Terapia fotodinâmica antimicrobiana mediada por curcuminóides em um modelo murino de candidíase oral

A candidíase oral (CO) é a principal infecção fúngica da cavidade oral; é causada pelo crescimento excessivo de Candida spp. Os fatores predisponentes para FO incluem disfunção endócrina, uso de antibióticos de amplo espectro, radioterapia e quimioterapia, deficiências nutricionais, xerostomia (baixo fluxo salivar), uso de próteses dentárias, falta de higiene e, principalmente, imunossupressão¹. Entre as espécies de Candida , Candida albicans é a mais prevalente e virulenta; É encontrada como uma espécie comensal no corpo humano e como um patógeno oportunista. C. albicans tem a capacidade de alterar sua morfologia de leveduras comensais (blastóporos) para filamentos patogênicos (hifas e pseudo-hifas)². As formas filamentosas, especialmente as hifas, podem invadir o epitélio do hospedeiro por endocitose ou penetração ativa, causando^infecção3. Outros fatores de virulência de C. albicans incluem adesão, formação de biofilme e secreção de enzimas e toxinas lipolíticas e hidrolíticas, como lipases, fosfolipases, proteinases e candidalisina⁴.

O tratamento da CO envolve o uso de antifúngicos, especialmente polienos e azólicos tópicos (nistatina e miconazol)⁵. No entanto, apresentam eficácia em curto prazo, sendo frequente a recorrência. Além disso, o uso excessivo de antifúngicos tem gerado o problema do desenvolvimento e disseminação de resistência antifúngica⁶. Portanto, terapias alternativas são necessárias, como a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa), que combina um fotossensibilizador (PS) e luz em um comprimento de onda apropriado (o mesmo da absorção do PS) na presença de oxigênio. As PSs são ligadas ou absorvidas pelas células e, quando ativadas pela luz, produzem espécies reativas de oxigênio (EROs) tóxicas para as células sensibilizadas⁷.

Na aPDT, um dos fotossensibilizadores (PSs) empregados é a curcumina (CUR), um composto natural extraído dos rizomas da planta cúrcuma (Curcuma longa L.). A curcumina possui inúmeros atributos terapêuticos, incluindo capacidades anti-inflamatórias, antioxidantes, anticancerígenas e antimicrobianas ^8,9. Uma investigação anterior constatou que a TFD utilizando CUR efetivamente diminuiu C. albicans em um modelo murino de candidíase oral sem causar qualquer dano aos tecidos do hospedeiro¹⁰. CUR é o principal curcuminóide extraído da cúrcuma, Mas outros polifenóis, como demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina, também são encontrados nesta planta. A aPDT mediada por curcuminóides demonstrou atividade antibacteriana contra biofilmes de Staphylococcus aureus cultivados em cateteres¹¹. No entanto, até onde sabemos, sua atividade antifúngica contra C. albicans permanece obscura. Portanto, neste estudo, avaliamos a aPDT mediada por um sal curcuminóide contra C. albicans em um modelo murino de CO.

O protocolo de pesquisa para o uso de camundongos foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (processos números 05/2008 e 09/2020) da Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) foi utilizada como cepa de referência. Camundongos Swiss fêmeas com seis semanas de idade (n = 45), com uma faixa de massa corporal de 20-30 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram fornecidos pela Universidade Estadual Paulista, UNESP, Botucatu.

1. Preparação do PS e seleção da fonte de luz para aPDT

1. Preparar o PS de acordo com as especificações da substância a ensaiar.
   NOTA: Neste estudo, uma mistura solúvel em água de curcuminóides (mistura de sal solúvel em água à base de CUR¹²) foi usada como PS (ver Tabela de Materiais e Figura 1). Diluições de 20 μM, 40 μM e 80 μM (15,6, 29,2 e 58,4 mg/L, respectivamente) foram preparadas em água ultrapura imediatamente antes do uso e mantidas a 5 °C.
2. Selecionar um equipamento de luz com comprimento de onda apropriado (o mesmo da absorção PS) capaz de iluminar todo o alvo fotossensibilizado uniformemente e simultaneamente sem aquecer o tecido.
   OBS: Neste estudo, foi utilizada uma peça de mão contendo diodo emissor de luz (LED, ver Tabela de Materiais), projetada no Instituto de Física de São Carlos (Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brasil). A potência de saída fornecida pela luz foi de 89,2 mW/^cm2 a um comprimento de onda azul de aproximadamente 455 nm.

2. Preparação do inóculo de C. albicans

1. Manter a estirpe de referência C. albicans (ATCC 90028) em levedura-peptona-glicose (YEPD, ver Tabela de Materiais) com 50% de glicerol a -80 °C até à utilização.
2. Descongelar a estirpe congelada à temperatura ambiente, espalhar uma alíquota de 100 μL numa placa de Petri com ágar Sabouraud dextrose (SDA) com cloranfenicol (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 48 horas.
3. Transferir cinco colônias para 10 mL de caldo nitrogenado de levedura com meio de glicose a 2% (YNBg) e crescer aerobicamente a 37 °C por 16 h.
4. Diluir a cultura de levedura em YNBg fresco (1:10) e incubar aerobicamente a 37 °C até que a densidade óptica atinja a fase logarítmica média de crescimento.
   OBS: Padronizar previamente a curva de crescimento microbiano para cada laboratório. Na presente pesquisa, as culturas foram incubadas por cerca de 8 h, até atingirem a fase logarítmica média de crescimento, como indicado pela densidade óptica a 540 nm (OD₅₄₀), com valor médio de 0,536 ± 0,062 unidades arbitrárias (média ± desvio padrão [DP]).
5. Centrifugar a cultura a 5.000 x g à temperatura ambiente por 5 min, descartar o sobrenadante e lavar o pellet duas vezes com o mesmo volume de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Use alíquotas de 100 μL para realizar quatro diluições seriadas de 10 vezes em PBS, espalhe diluições em placas de SDA e incube a 37 °C por 48 h para contagem de colônias. Como padrão, suspensões fúngicas são usadas em concentrações de aproximadamente 4,5 × 10⁷ unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL)].

3. Indução de CO em camundongos

OBS: A seguinte metodologia foi previamente descrita por Takakura et ^al.13 e reproduzida por nosso^grupo10,14, com algumas modificações.

1. Camundongos distribuídos aleatoriamente em nove grupos (n = 5), correspondendo ao mesmo número de tratamentos (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: A cavidade oral de camundongos deve ser negativa para o crescimento de Candida . Isso precisa ser verificado por swab da cavidade oral e plaqueamento da amostra em SDA.
2. Manter os animais em caixas de propileno¹⁰ (5 ratos por caixa, máx.), com aparas de madeira para revestimento do piso, num biotério com temperatura controlada a 23 ± 2 °C sob um ciclo claro/escuro de 12/12 h. Não é necessário fornecer nenhum enriquecimento específico.
3. Manter camundongos em dieta extrusada de camundongos e água filtrada ad libitum.
4. Injetar subcutaneamente a droga imunossupressora, prednisolona (100 mg/kg de peso corporal, ver Tabela de Materiais), pela primeira vez no primeiro dia a todos os membros dos grupos C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: Mantenha ratos do mesmo grupo na mesma caixa e monitore-os diariamente para qualquer sinal de estresse e perda de peso. Procure aconselhamento veterinário para analgésicos ou alimentos / água alterados se o estresse ou perda de peso são observados..
5. A partir do primeiro dia e até o final do experimento, fornecer cloridrato de tetraciclina em água de beber a 0,83 mg/mL¹³.
6. Inocular línguas de camundongos no segundo dia, incluindo os grupos C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (Arquivo Suplementar 1), com o inóculo de C. albicans . Não inocular os ratinhos do grupo de controlo negativo (NCtrl).
   1. Sedar os animais por injeção intramuscular de 10 mg/kg de cloreto de clorpromazina (ver Tabela de Materiais) em cada músculo da coxa antes de realizar a inoculação.
   2. Realizar a inoculação intraoral dos camundongos mergulhando um swab estéril (um por animal) em uma suspensão padronizada de C. albicans recém-preparada (ou seja, preparada imediatamente antes da inoculação).
   3. Coloque camundongos sedados em decúbito dorsal. Puxe suavemente a língua para fora da boca usando uma pinça estéril. Esfregue a língua de cada rato com um cotonete embebido por 30 s. Monitore camundongos até que eles se recuperem da sedação.
7. No quinto dia, administrar uma injeção subcutânea complementar de prednisolona (100 mg/kg de peso corporal) para manter a imunossupressão.
   NOTA: Este protocolo é adequado para manter a infecção por 7 dias após a inoculação intraoral. A linha do tempo do protocolo é mostrada na Figura 2.

4. Terapia fotodinâmica antimicrobiana e recuperação de C. albicans de lesões bucais

1. No sétimo dia, antes do tratamento, anestesiar os animais com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) combinado com xilazina (10 mg/kg de peso corporal) (ver Tabela de Materiais).
2. Colocar cada animal em decúbito dorsal sobre um dispositivo^de almofada ^14,15 equipado com fios de aço inoxidável que podem ser enrolados ao redor dos incisivos para manter a boca aberta.
   OBS: As almofadas isotérmicas são recomendadas para aquecer os camundongos enquanto estão sedados, prevenindo a hipotermia à temperatura ambiente e evitando mortalidade relacionada à anestesia¹⁵. Cada animal anestesiado deve ser monitorado pela ausência de um reflexo de retirada quando os dedos são pinçados para confirmar a profundidade da anestesia. Uma dose de manutenção de cetamina a 1/3 da dose original (sem xilazina) pode ser administrada se necessário.
3. Com a mandíbula e as bochechas retraídas, coloque suavemente a língua fora da boca.
4. Para camundongos do grupo C+L+, pipetar 70 μL do PS no dorso da língua (em uma das concentrações testadas). Manter os ratos em um ambiente escuro por uma duração de 20 minutos como um período de pré-irradiação. Certifique-se de que, durante esse tempo, a língua de cada animal permaneça posicionada dentro da cavidade oral para evitar que o fotossensibilizador (PS) seja ingerido.
5. Após o período de fotossensibilização, puxe a língua para fora da boca para iluminação. Coloque o dispositivo de LED no dorso da língua e acenda a 37,5 J/cm² (7 min com o presente dispositivo) (Figura 3).
6. Para os animais dos grupos C+L-, pipetar 70 μL do PS em uma das concentrações testadas no dorso da língua e mantê-los no escuro por 27 min.
7. Para os animais do grupo C-L+ (tratados com luz sem fotossensibilização prévia), pipetar 70 μL de solução salina estéril no dorso da língua. Mantenha os ratos no escuro por 20 min e, em seguida, ilumine suas línguas a 37,5 J/cm² (7 min com o presente dispositivo).
8. Para camundongos do grupo C-L- (não tratados com PS nem com luz), pipetar 70 μL de solução salina estéril no dorso da língua e mantê-los no escuro por 27 min.
9. Recuperar C. albicans das línguas de todos os ratos imediatamente após o tratamento. Esfregue o dorso da língua por 1 min com um cotonete estéril.
10. Coloque cada swab de amostra em um tubo contendo 1 mL de solução salina estéril e vórtice por 1 min para ressuspender as células microbianas.
11. Realizar imediatamente diluições seriadas de 10 vezes em PBS e alíquotas de placa de 25 μL sobre placas SDA em duplicata. Incubar as placas por via aeróbia a 37 °C durante 48 horas.
12. Após 48 h, use um contador de colônias digital (consulte Tabela de Materiais) para determinar as contagens de colônias de leveduras. Calcular a carga de C. albicans (UFC/mL) para cada animal.
13. Transformar os valores de UFC/mL em log₁₀ e analisar adequadamente de acordo com o planejamento do experimento e as premissas dos dados.
    LEGENDA: No presente estudo, foi utilizada a ANOVA one-way de Welch e o teste post-hoc de Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ .

5. Análise histopatológica

1. No oitavo dia, anestesiar camundongos com cetamina a 100 mg/kg combinada com xilazina a 10 mg/kg por injeção intraperitonial e eutanasiá-los com uma overdose de cetamina (200 mg/kg administrada por via intraperiotonial). Confirme a morte verificando a ausência de movimento respiratório (apneia) e ausência de batimentos cardíacos (assistolia).
2. Aperte cuidadosamente a língua e retire-a da boca do animal. Com o uso de bisturi manual, faça uma incisão antes das papilas circunvaladas para remover cirurgicamente toda a língua sem causar lesões nas regiões anterior e central.
3. Fixar a língua em formalina tamponada a 10% (pH 7,2-7,4) por 24 h e lavá-la em água corrente por 2 h.
4. Proceder com a inclusão no processo de parafina: desidratação, clarificação e impregnação^10,14.
5. Corte seções seriais (5 μm de espessura) usando um micrótomo e, em seguida, afixe as seções em lâminas de vidro. Proceder à coloração destes cortes utilizando ácido periódico de Schiff e hematoxilina (PAS-H) para exame histopatológico e identificação de fungos através de observação ao microscópio de luz.
6. Peça a um patologista, de preferência cego para os grupos estudados, para examinar a reação tecidual devido à infecção por C. albicans .
7. Descrever as características histológicas do tecido (epitélio e tecido conjuntivo), especialmente as respostas inflamatórias locais de intensidades variáveis.

O modelo murino de CO mostrou manchas brancas típicas e pseudomembranas na língua de todos os camundongos infectados (Figura 4A). C. albicans recuperados de animais C-L- confirmaram a colonização tecidual por este microrganismo (valores variaram de 1,62 x 104 a 4,80 x 105 UFC/mL). Como esperado, os animais do grupo NCtr não apresentaram alterações teciduais ou crescimento de colônias após a amostragem (Figura 4B).

A aPDT diminuiu a viabilidade de C. albicans quando curcuminóides foram usados a 80 μM para fotossensibilização (Figura 5). A redução média do log10 obtida com 80 μM de aPDT mediada por PS foi de 2,47, comparada ao grupo C-L- (p = 0,008).

O número de colônias de C. albicans recuperadas de línguas de camundongos não foi significativamente diferente entre camundongos tratados com curcuminóides sem iluminação (grupos C+L-), camundongos tratados com luz, mas não previamente fotossensibilizados (grupos C-L+) e camundongos não tratados (grupo C-L-) (p ≥ 0,210).

As características histológicas das línguas dos animais não infectados (NCtr) mostraram tecidos normais/sadios, incluindo lâmina própria íntegra, membrana basal e papilas filiformes (Figura 6A). Em contraste, ao examinar as imagens histopatológicas das línguas dos camundongos do grupo C-L-, ficou evidente a presença de leveduras e filamentos na camada queratinizada do epitélio, embora não houvesse infiltração de fungos. No tecido conjuntivo subjacente, observou-se discreta resposta inflamatória, mediada primariamente por células mononucleares, e as papilas filiformes estavam notavelmente ausentes (Figura 6B). A análise histológica das línguas de camundongos nos grupos C+L- e C-L+ apresentou características semelhantes. Em contraste, os cortes da língua de camundongos tratados com 80 μM de aPDT mediada por curcuminóides revelaram um número reduzido de células fúngicas, principalmente limitadas à camada queratinizada do epitélio (Figura 6C).

Figura 1: Estrutura química do fotossensibilizador. A estrutura química da mistura de sal solúvel em água usada como fotossensibilizador, compreendendo 53,4% curcumina natural e 46,6% outros curcuminóides (demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina). O peso molecular médio final é de 730,32 g/mol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Linha do tempo do protocolo para o modelo murino de candidíase oral e aPDT. Uma linha do tempo delineando o protocolo para o modelo murino de candidíase oral e terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Iluminação da língua de camundongos após fotossensibilização. Após a fotossensibilização (incubação do tecido infectado com o fotossensibilizador), as línguas foram iluminadas a 37,5 J/cm2 usando uma luz LED azul (~455 nm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Lesões brancas no modelo murino de candidíase oral. (A) Imagens representativas das lesões brancas observadas no modelo murino de candidíase oral. (B) Controle negativo (não infectado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Candida albicans recuperada da língua de camundongos. Os dados representam valores médios ± desvio padrão do log10 (UFC/mL) dos grupos de tratamento. A ANOVA one-way de Welch indicou que os efeitos dos tratamentos foram estatisticamente diferentes entre os grupos (p < 0,001). Letras minúsculas diferentes (a, b, c) próximas às médias indicam diferenças estatisticamente significativas de acordo com o teste de Games-Howell (p≤ 0,030). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagens representativas de cortes histológicos de línguas de camundongos. Cortes histológicos de línguas de camundongos foram corados com PAS-H, e as imagens foram capturadas em 200x. (A) Camundongos controle negativo sem candidíase oral induzida, fotossensibilização e iluminação (grupo NCtr). (B) Camundongos com candidíase oral induzida, não fotossensibilizados nem expostos à iluminação LED (grupo C-L-). (C) Animais com candidíase oral induzida, expostos a 80 μM de curcuminóides e iluminação LED de 37,5 J/cm2 (grupo C+L+ 80). Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Grupos experimentais. Lista dos grupos experimentais utilizados no presente estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.