Otimização do Modelo de Periodontite Induzida por Ligadura para Pesquisa Pré-clínica

Resumo

O modelo de camundongos de periodontite induzida por ligadura é uma ferramenta eficaz e cada vez mais popular para estudar doenças periodontales. Orientações detalhadas são apresentadas para implementar uma versão simplificada do modelo focada na destruição do osso alveolar interproximal, incluindo o desenho de estudos laboratoriais, produção de ferramentas impressas em 3D e quantificação óssea usando análise μCT.

Resumo

O modelo experimental de periodontite induzida por ligadura em camundongos desempenhou um papel fundamental na compreensão da patogênese da doença periodontal; ainda assim, ele não foi totalmente aproveitado para aplicações translacionais e terapêuticas. Semelhante à doença humana, a periodontite induzida por ligadura em camundongos se desenvolve por meio de uma série de eventos microbianos, inflamatórios e osteoimunológicos distintos. A destruição do osso alveolar induzida pela ligadura progride em um período razoavelmente curto e é facilmente quantificável, tornando-se um modelo de doença custo-efetivo para estudos pré-clínicos.

Para superar o desafio técnico do modelo clássico de ligadura, foi elaborado o estabelecimento do modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura. Em vez de induzir doença em toda a circunferência de dois dentes adjacentes, o modelo simplificado da doença é centrado na destruição inflamatória óssea apenas na região interproximal de dois dentes posteriores, que também é a região que a doença periodontal comum inicia em humanos. Como utiliza ferramentas tridimensionais impressas em 3D para colocação de ligaduras, a abordagem é rápida e eficaz, levando a um tempo procedimental de 5 a 10 minutos por mouse. Embora a sinalização osteoclastogênica seja detectada após 3 dias após a colocação da ligadura, a destruição óssea se desenvolve consistentemente aos 9 dias após a ligadura.

Aqui, o protocolo simplificado do modelo de ligadura é elaborado destacando elementos importantes específicos do projeto do estudo (ou seja, cálculo de potência, padronização de procedimentos, calibração), desenvolvimento das ferramentas impressas em 3D (ou seja, a "cama dentária do camundongo" e o "suporte de ligadura") e quantificação do osso alveolar por meio de análise μCT. A expressão gênica gengival de Rank, Rankl e Opg, uma tríade regulatória mestre da osteoclastogênese, é usada como evidência indireta de eficácia terapêutica. Os métodos apresentados neste artigo orientarão a implementação pelos pesquisadores do modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura para testar terapêuticas periodontales inovadoras no contexto pré-clínico.

Introdução

A doença periodontal é um processo inflamatório complexo que leva à destruição das estruturas que sustentam os dentes, incluindo a gengiva, o ligamento periodontal, o cémulo e o osso alveolar. Para que a perda óssea periodontal se desenvolva, é necessário ocorrer a ruptura da barreira gengival e a invasão bacteriana, além do recrutamento de células inflamatórias e da transição de uma resposta imune dominada inata para uma dominada por aquisição¹. O desequilíbrio final entre osteoblastos e osteoclastos resultará em perda óssea alveolar por sua^{destruição 2}. O achado fenotípico marcante que diferencia o diagnóstico de doença periodontal da inflamação gengival reversível (gengivite) é a perda do osso alveolar. Portanto, a quantidade de osso alveolar que sustenta o dente é um desfecho terapêutico chave no contexto pré-clínico.

Nenhum modelo animal isolado pode replicar todos os aspectos biológicos necessários para o desenvolvimento de diferentes terapêuticas ^3,4,5. O modelo de periodontite induzida por ligadura desenvolve destruição óssea quantificável em um tempo razoavelmente curto (3-9 dias⁾⁵, tornando-se um modelo econômico para testar intervenções terapêuticas inovadoras para prevenção e modulação da periodontite. Apesar do sucesso em apoiar o desenvolvimento de ensaios clínicos humanos de fase^II-III 6,7,8,9,10, a periodontite induzida por ligadura em camundongos não é comumente utilizada como modelo pré-clínico. Para superar os desafios técnicos do modelo clássico, no qual a ligadura envolve o dente, foi estabelecido o modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura^11,12. A modificação simples do modelo clássico está centrada em um local focado de destruição óssea, entre, em vez de ao redor dos dentes. Os benefícios dessa modificação são múltiplos, incluindo um tempo mais curto necessário para 1) treinamento de pessoal, 2) facilidade técnica do procedimento experimental e 3) reprodutibilidade da quantificação óssea. Além disso, foi descoberto que vários eventos microbiológicos e imunológicos que se desenvolvem e se manifestam sob esse modelo simplificado estão alinhados com o entendimento atual da doença periodontal humana^comum 2,11,12,13. Por fim, a prevenção eficaz da perda óssea induzida por medicamentos, anteriormente relatada por^{nós 2,14}, apoia ainda mais o uso do modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura como uma ferramenta in vivo para avaliar aspectos-chave de novas terapias periodontas.

Um aspecto inovador do modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura tem sido o desenvolvimento de ferramentas impressas em 3D para facilitar mais facilmente o processo de indução da^{doença 11,12}. Embora seja intuitivo para alguns, os pesquisadores relataram a incapacidade de montar as ferramentas impressas^{em 3D 15}, o que pode dificultar ou atrasar ainda mais o início do estudo em animais. O presente estudo expande as informações apresentadas em nosso estudo de protocolo^{anterior 11}e fornece informações detalhadas para permitir a implementação bem-sucedida do modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura em ambiente laboratorial. Os detalhes incluídos neste protocolo atual fazem parte de um conjunto complexo de fatores que podem contribuir para a falta de reprodutibilidade dos resultados dos achados^científicos 15,16,17. O uso consistente do modelo e a reabsorção óssea confiável identificados nos múltiplos estudos ^{2,11,12,14,18} e por grupos de pesquisa ^{colaborativa 13,19,20,21} nos últimos 10 anos apoiam a importância de disseminar informações detalhadas para promover a reprodutibilidade na comunidade científica.

Protocolo

Este protocolo seguiu as diretrizes Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (^{ARRIVE) 22,23}. Todos os procedimentos experimentais descritos neste protocolo foram aprovados pela IACUC da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1. Desenho experimental

1. Cálculo do tamanho da amostra
   NOTA: Devido à natureza translacional do programa de pesquisa, o cálculo de potência apresentado aqui é baseado em medições de osso alveolar de camundongos selvagens C57Bl6 de 8 a 12 semanas de vida.
   1. Analise o osso com base nas medições lineares entre a junção cemento-esmalte e a crista óssea alveolar (CEJ-ABC).
      1. Camundongos saudáveis têm um nível médio de fixação (ou medição CEJ-ABC) de 0,2 mm, enquanto camundongos com periodontite no período de 9 dias após a ligadura apresentam o dobro dessa quantidade (distância CEJ-ABC de 0,4 mm)¹¹. A perda óssea alveolar não aumenta significativamente de 9 a 18 dias após a colocação da^{ligadura 11}.
      2. Realize uma análise de cálculo de potência baseada nesse tamanho de efeito para identificar o número de camundongos necessários para revelar essas diferenças entre saúde e doença (aqui, um total de 8 a 10 camundongos [Figura 1A]).
         NOTA: A potência foi calculada para alcançar uma potência entre 0,8 e 0,95, α = 0,05, usando uma média de duas amostras. Médias de grupo e desvios padrão são apresentados na Figura 1B.
   2. Para determinar um efeito terapêutico na perda óssea, realize um cálculo de potência diferente. Em vez de comparar camundongos saudáveis com camundongos doentes, já que tanto grupos experimentais quanto controles de camundongos desenvolvem periodontite neste protocolo, reserve-se entre 19 e 31 camundongos/grupo para garantir a reprodutibilidade dos resultados ao testar a modulação da perda óssea usando o modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura (veja resultados representativos e Figura 1C).
      NOTA: A potência foi calculada usando o mesmo teste descrito acima. Médias de grupo e desvios padrão são apresentados na Figura 1D.
2. Padronização de procedimentos e calibração de pessoal
   1. Treinar e calibrar todo o pessoal envolvido na indução e quantificação da doença antes do início do estudo (intercalibração e intracalibração; r² ≥ 0,90).
      NOTA: Estima-se que o treinamento para colocação de ligaduras e quantificação da perda óssea requer um período de 2 a 3 meses (cronograma apresentado na Tabela 1). Outras etapas exigidas são apresentadas como linha do tempo na Tabela 1.
   2. Para o procedimento de colocação da ligadura, tenha dois investigadores treinados trabalhando juntos na sala do procedimento. O pesquisador principal (intra e intercalibrado) permanece como o operador que coloca as ligaduras.
   3. Faça com que o segundo investigador trabalhe como assistente de procedimentos e execute as etapas listadas abaixo:
      1. Registre o peso do mouse.
      2. Coloque o rato na caixa de anestesia.
      3. Coloque pomada ocular no rato antes de entregá-lo ao operador para sua colocação na "cama dentária do rato".
      4. Certifique-se de que ≥3 "suportes de ligaduras" estejam devidamente carregados com as ligaduras e prontos para uso.
         NOTA: Para melhorar a eficiência, é ideal ter ≥3 "suportes de ligadura" devidamente carregados para uso pelo operador. Recomenda-se rapidez (ou seja, um tempo de procedimento de 5-10 min/mouse), aumentando o número de experimentos realizados em um dia e diminuindo os potenciais efeitos de lote.
      5. Realize monitoramento do camundongo (antes e depois do procedimento).
         NOTA: A periodontite induzida por ligadura é um procedimento não invasivo, não cirúrgico, semelhante ao uso do fio dental de um dente humano. A colocação de ligaduras deve causar desconforto muito leve aos camundongos (principalmente devido ao acúmulo de bactérias entre dois dentes), mas não deve exigir o uso de analgésicos. Não se esperam complicações após a colocação da ligadura realizada por um indivíduo treinado. Todos os animais são monitorados a cada 2-3 dias após a colocação da ligadura. Desfechos humanos (por exemplo, falha em escovar ou alimentar, incapacidade de levantar ou andar, respiração dificultosa, feridas necróticas ou infectadas) devem estar listados no protocolo animal aprovado, mas se ocorrerem complicações, a equipe veterinária deve ser consultada sobre as ações adequadas.

2. Criação de ferramentas impressas para induzir periodontite por ligadura em camundongos

NOTA: Para otimizar a colocação das ligaduras, foram desenvolvidas ferramentas impressas em 3D chamadas Cama Dentária de Mouse e Suporte de Ligadura , compostas por várias peças impressas em 3D individuais que são impressas separadamente e montadas manualmente. As especificações do blueprint desses dispositivos foram publicadas^{anteriormente em 11} e podem ser usadas por pesquisadores experientes para criar arquivos STL individuais. Os novos dispositivos do presente estudo foram criados em conjunto com o BeAM Design Center da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. Os materiais podem ser obtidos pela respectiva instalação central ou impressos em 3D usando os arquivos STL no Arquivo Suplementar 1.

1. Cama dentária de camundongos
   1. Imprima a Cama Dentária do Mouse (Figura 2A) e o Suporte de Ligadura (Figura 2B) usando qualidade padrão de impressão em uma impressora 3D com filamento de ácido polilático (PLA) de 3,0 mm. Imprima a cama dentária na orientação projetada e as outras partes com as superfícies planas uniformes orientadas para baixo em relação à base da base de impressão. Ative a opção de material de suporte ativando a configuração de Posicionamento de Suporte. Certifique-se de que o material de suporte toque primeiro na placa de construção selecionando a opção Tocar na Placa de Construção.
      NOTA: Use os cinco arquivos STL do Arquivo Suplementar 1 para imprimir todos os elementos necessários, incluindo o Tubo Destacável, Ligadura (com entalhe), Cama Dentária do Rato (com entalhes), Tampa e Trava do Suporte de Ligadura. Veja a Tabela de Materiais para as dimensões de cada item (especificações do projeto apresentadas^{anteriormente 10}).
   2. Após a impressão, corte quaisquer peças de suporte impressas dos modelos usando alicates, alicates de bico fino ou outro instrumento.
      NOTA: Use óculos de proteção durante este procedimento.
2. Montagem de camas odontológicas para camundongos
   1. Para preparar a cama dentária do camundongo, dispeça todas as partes conforme mostrado (Figura 3A) e prepare a cola a ser usada (Figura 3B).
   2. Coloque algumas gotas de cola (Figura 3C) e fixe os parafusos como mostrado (Figura 3D). Novamente, prepare-se para transferir cola (Figura 3E) para as áreas onde será aplicada. Deslize a ranhura do tubo impresso (Figura 3F) no lugar com a extremidade farpada voltada para longe da Cama Dental do Rato (é onde a mangueira para administrar isoflurano vai se conectar).
   3. Fixe peças estabilizadoras de cabeça em posições com cola (Figura 3F).
   4. Limpe qualquer excesso de cola e mantenha uma leve pressão em todas as peças inseridas para fixação firme (Figura 3F).
3. Ajustes do suporte de ligadura
   1. Para reduzir o desconforto ao travar/destravar o mecanismo, certifique-se de que todas as bordas quadradas/afiadas na parte externa do Cadeado do Suporte de Ligadura (Figura 4A) estejam levemente chanfradas em um ângulo de 45° usando um cabo de lâmina de bisturi 15C, nº 3 com lâmina 15C.
   2. Para garantir um encaixe apertado do mecanismo de trava no Suporte de Ligadura, alinhe quaisquer cantos arredondados internos do Trava do Suporte de Ligadura (Figura 4B-F) usando uma lâmina de bisturi 15C.
      NOTA: Isso permitirá que a trava assente totalmente contra o suporte da Ligadura e exigirá apenas pequenos ajustes.
      1. Use uma ferramenta de corte para impressão 3D ou uma lâmina de bisturi 15C para remover o "flash" restante nas bordas superior e inferior mesmo após remover a maior parte do suporte, e faça um chanfro leve nas bordas a 45° (semelhante ao bisel realizado no Ligature Holder Lock na etapa 1) para garantir um encaixe firme.
         NOTA: Não remova muito material, mas apenas o suficiente para que a trava deslize sem resistência.
   3. Se muito fina, corte o comprimento de cada ponta até atingir uma seção transversal mais espessa [pelo menos 0,5 mm de espessura], garantindo que permaneça espaço suficiente entre as pontas para evitar impactos no palato ao colocar as ligaduras. Certifique-se de que as pontas tenham pelo menos 3 mm de comprimento após o corte (Figura 5A, mostrada por "CUT").
   4. Nas pontas do Suporte de Ligadura, remova qualquer flash do "suporte" onde a ferramenta foi impressa para garantir que o lado das pontas fique plano (Figura 5B, seta).
   5. Remova uma "fatia" do lado de cada ponta em um ângulo de 45° para facilitar a carga da ligadura nela, além de suavizar as bordas para evitar lesões traumáticas nos tecidos moles (Figura 5C, indicada por setas).
   6. Certifique-se de que cada ponta do Suporte de Ligadura inclua uma entalhe em formato de "V" onde as ligaduras de seda para sutura possam descansar. Se isso foi removido no passo 2.3.6 porque a ponta impressa inicial era muito fina, refine na impressão ou reproduza-a.
      1. Se esse entalhe em formato de "V" for visível, coloque o suporte da ligadura sobre uma superfície plana com ambas as pontas paralelas à mesa, coloque uma lâmina de bisturi 15C suavemente na base da ranhura e balance suavemente a lâmina de um lado para o outro, de modo que a lâmina fique na base do "V" e o lado da lâmina toque as paredes superiores do "V". Com a lâmina na base da entalhe, angule cuidadosamente a lâmina em direção à superfície externa da ponta e repita esse movimento para refinar a base da entalhe em forma de "V" na borda externa, o que permitirá que a linha da sutura se guie mais facilmente no lugar.
         NOTA: Essa ação de balanço cria movimento suficiente no filamento para afastá-lo e refinar a entalhe sem remover uma quantidade excessiva de material.
      2. Se essa entalhe em formato de "V" não for visível, coloque o suporte da ligadura sobre uma superfície plana com ambas as pontas perpendiculares à mesa. Enquanto olha para baixo ao longo das duas pontas do Suporte de Ligadura, coloque uma lâmina de bisturi 15C no meio das pontas e, em um movimento deliberado, faça um corte raso para criar o início do que acabará sendo a entalhe em formato de "V".
         NOTA: Muitas vezes é mais fácil realizar essa ação em cada ponta separadamente do que tentar posicionar a lâmina no lugar correto em ambas as pontas ao mesmo tempo.
      3. Repita o passo 2.3.7.2 se necessário, certificando-se de que a lâmina do bisturi esteja sempre de volta para o mesmo ponto no meio da ponta.
         NOTA: Se a lâmina não recuar no mesmo ponto, vários cortes serão feitos, o que fará com que as camadas de filamento comecem a se separar nessas áreas e potencialmente reduzam o desempenho da ferramenta.
         NOTA: A profundidade da entalhe em formato de "V" deve ser testada periodicamente usando uma ligadura de sutura amarrada-seda para determinar se a ligadura está firme ou se ela continua escorregando (pode indicar que é necessário refinamento adicional). O suporte deve ser impresso com a ranhura voltada para baixo na placa de construção e o Trava do Suporte de Ligadura orientado, com a abertura mais larga tocando a placa de construção. Novamente, o material de suporte pode ser usado com o Posicionamento de Suporte configurado apenas para Tocar na Placa de Construção.
4. Suporte de ligadura montado
   NOTA: Após as modificações, monte o Suporte de Ligadura e verifique o seguinte:
   1. Quando uma ligadura está travada no lugar, certifique-se de que a trava prenda a rosca ao Suporte da Ligadura (não visto na Figura 6A como apontado pela seta, mas visto na Figura 6B) na parte superior ou inferior da fechadura (ambos, se possível, mas isso pode ser difícil de alcançar).
      NOTA: Esse atrito garante que a ligadura não escorregue para fora do lugar.
   2. Ao enfiar a ligadura nos sulcos do Suporte da Ligadura, se ela continuar escorregando das pontas, aprofunde os sulcos ou estenda-os mais para fora da ponta para criar um "trilho" onde a rosca vai se acomodar.
   3. Verifique se os dois nós estão centralizados (Figura 6C) e nivelados (linha reta na Figura 6D) quando vistos da frente do Suporte da Ligadura; Se não, então um sulco é mais profundo que o outro.
   4. Verifique se a ligadura está posicionada logo dentro das ranhuras e que não está muito profunda; caso contrário, há um risco elevado de a ponta do Suporte de Ligadura entrar em contato com os tecidos moles e causar trauma durante a colocação da ligadura.
   5. Usando um explorador dentário (Figura 6E), confirme que a ligadura volta ao lugar sem escorregar quando uma força suave é aplicada entre os nós (isso simula a força que ela sentirá durante a colocação da ligadura).

3. Colocação da ligadura

NOTA: É possível que as ligaduras sejam colocadas entre dentes murinos com ou sem a adição de patógenos periodontais^{humanos 11}. Uma análise dependente do tempo da composição microbiana da ligadura (sem suplementação com espécies bacterianas humanas) demonstrou uma mudança na comunidade microbiomática (disbiose) durante o desenvolvimento da^{periodontite 12}. Por esse motivo, a substituição da ligadura não é recomendada, pois pode alterar a reprodutibilidade dos resultados. A inclusão de espécies bacterianas em combinação com a ligadura depende da questão abordada em um estudo específico. Devido à perda esperada de 10-15% de^{ligadura, as} ligaduras são colocadas bilateralmente em um único camundongo. Essa abordagem minimiza a perda de camundongos durante o experimento.

1. Depois que o camundongo for anestesiado usando isoflurano inalado, coloque-o na Cama Dentária do Rato com as costas encostadas na cama e o nariz posicionado próximo ao cone nasal.
   NOTA: Os camundongos devem ser anestesiados usando isoflurano a 4% (vol/vol). O vaporizador de isoflurano e o oxigênio são filtrados por um filtro de ar de 0,2 μm. Uma vez que o camundongo esteja totalmente anestesiado e colocado na Cama Dentária do Rato, ele deve ser mantido com um fluxo de 1,5-2,5% pelo cone nasal. Os ratos são monitorados por movimentos involuntários do corpo e pela frequência respiratória (~55-65 respirações por minuto). Não é necessário administrar nenhum analgésico a camundongos induzidos com periodontite por ligadura, pois este é um procedimento não invasivo e não cirúrgico, semelhante ao uso do fio dental de um dente humano. A colocação de ligaduras deve causar desconforto muito leve aos camundongos (principalmente devido ao acúmulo de bactérias entre dois dentes), mas não deve exigir o uso de analgésicos. Não se esperam complicações após a colocação da ligadura realizada por um indivíduo treinado.
2. Use os elásticos para estabilizar a cabeça do rato e abra sua boca.
   NOTA: A faixa ao redor dos incisivos mandibulares também retrai a língua, e a tensão é passiva para abrir a mandíbula sem puxá-la. A visualização dos molares é facilitada quando a fonte de luz é direcionada em um ângulo para evitar que sombras obscureçam o campo de visão. A cama odontológica para camundongos foi projetada especificamente para o modelo simplificado de periodontite induzida por ligadura. A distância entre o nariz do camundongo e o cone é necessária para permitir que o camundongo tenha pequenos movimentos corporais durante o procedimento experimental. Esse movimento do mouse permite monitorar adequadamente a manobra da mão do operador ao usar o suporte da ligadura e controlar a quantidade de força usada durante a colocação da ligadura. A colocação da ligadura deve levar de 5 a 10 minutos por mouse. Os procedimentos devem ser realizados em um exaustor bem ventilado para realizar experimentos com animais
3. Para colocar uma ligadura no lado direito, segure o Suporte de Ligadura na mão direita e o explorador na esquerda.
   NOTA: Se os nós na ligadura não estiverem centralizados entre as pontas, mas sim mais próximos de uma ponta, então a ligadura pode ser mais adequada para ser colocada em um lado específico. Por exemplo, se os nós forem colocados mais próximos da ponta direita do Suporte de Ligadura, essa ligadura pode ser mais fácil de colocar do lado direito.
4. Coloque delicadamente a ponta do explorador abaixo do contato interproximal dos primeiros e segundos molares no lado palatino.
   1. Faça a ponta exploradora tocar primeiro os dentes e depois deslizar para baixo e apoiar a gengiva para evitar traumatizar o tecido mole; Apoie a alça exploradora em uma angulação horizontal depois de posicionada corretamente.
   2. Anote qual extremidade do explorador é usada para posicionamento do lado direito e qual do lado esquerdo. Certifique-se de que a ponta do explorador se encaixe na área de contato proximal em direção ascendente, permitindo que a curvatura da haste se apoie no lado contralateral para estabilizar a cabeça contra forças reacionárias durante a colocação.
5. Usando o Suporte de Ligadura em angulação horizontal, retraa a bochecha primeiro posicionando o Suporte acima do contato interproximal entre o segundo e o terceiro molar, pressionando a borda do Suporte contra a bochecha para movê-la e, em seguida, colocando o Suporte de Ligadura na posição no contato interproximal dos primeiro e segundo molares.
   NOTA: Esta etapa ajuda a garantir que nenhuma mucosa bucal fique presa entre a ligadura e os dentes, o que possa interferir na colocação.
6. Uma vez que a ligadura esteja posicionada sobre o contato interproximal entre o primeiro e o segundo molar, gire o cabo do suporte da Ligadura até 45° e, com uma combinação de balanço suave e deslizamento, empurra a ligadura através do contato.
7. Cortando o excesso de linha:
   1. Use uma pinça fina para prender o excesso de linha presa ao nó do lado direito, puxe a linha pelos dentes para a esquerda e, usando tesouras que estejam apenas um pouco abertas, deslize a tesoura pela linha até posicionar a ~1,5 mm do nó antes de cortar.
      NOTA: Isso ajuda a reduzir a probabilidade de trauma mucoso inadvertido ao cortar o excesso.
   2. Repita o que foi dito acima com as direções invertidas para o outro nó.
8. Espelhe os passos acima da versão 3.3. até 3.7.2. ao colocar uma ligadura do lado oposto da boca.
   NOTA: A coleta de ligaduras no sacrifício é recomendada, pois o deslocamento disbiótico pode ser alterado por diferentes condições experimentais sendo^{testadas 12}. Para facilitar a coleta, os camundongos são colocados na Cama Dentária Murina e um dos nós da ligadura é cortado, seguido de uma remoção interproximal suave com pinças. O uso da Cama Dentária do Mouse durante a coleta da ligadura permite a estabilidade adequada do rato e facilita o acesso ao local da ligadura.

4. Quantificação da destruição óssea

1. Análise μCT
   1. Abra o software e clique em Arquivo | Importar imagem...
   2. Clique em Navegar no menu pop-up, vá até a pasta que contém arquivos Dicom para uma digitalização e selecione o primeiro arquivo.
   3. Clique em Examinar para encontrar e selecionar quaisquer outros arquivos dentro da pasta que façam parte da mesma amostra escaneada. Clique em OK.
   4. Depois que a imagem começar a carregar, clique em Visualizar e Isosuperfície.
   5. Mude o limiar da imagem para 5.000 e o Fator de Qualidade da Superfície (%) para 55.
   6. Marque as caixas marcadas como Habilitar Suavização de Imagem e Recortar Superfície com ROI Atual e clique em Atualizar.
   7. Ajuste as Propriedades do Nível clicando com o botão direito em Janela/Nível na parte inferior (Figura 7A) e clique em Editar Janela/Propriedades do Nível. Selecione um valor de densidade óssea que seja padrão para todas as amostras. Para seguir esse protocolo, use 2.000 , mas altere com base na densidade óssea das amostras e mantenha-a constante em todas as medições.
   8. Para manipular aviões:
      1. Use atalhos de teclado I/J/K ocultar/mostrar para os três planos diferentes.
      2. Clique com o botão direito e mova o cursor para dar zoom in e out.
      3. Pressione Shift e depois clique com o botão esquerdo para panoramear.
      4. Clique em Slice para mover e girar os planos.
      5. Clique no centro do plano para movê-lo para frente/trás ou coloque o cursor no centro do plano desejado e use as setas para cima e para baixo para mover o plano uma fatia de cada vez.
      6. Clique na borda do plano para girar ao redor de uma linha paralela a essa aresta no centro do plano.
      7. Clique no canto de um plano para girar ao redor do plano.
   9. Oriente o eixo z (painel azul no topo da tela — a fatia z) de modo que as superfícies/formas dos três dentes fiquem visíveis ao mesmo tempo (ou o mais próximas possível) (Figura 7B).
   10. Role por esse mesmo plano (painel azul no topo da tela-z-slice) para que as raízes dos^1º e^2º molares fiquem visíveis (Figura 7C). Tente escolher um ponto que fique longe o suficiente nas raízes para que toda a anatomia ao redor possa ser vista, mas também onde os canais pareçam bem definidos e em linha reta.
       NOTA: O plano pode precisar ser girado para orientar verticalmente os canais.
   11. Oriente o eixo x (linha verde vertical no painel da fatia z) para alinhar com as raízes bucais do^1º e^2º molar (tente alinhar pela parte central de cada raiz/canal, se possível; caso contrário, alinhe pela raiz bucal do^1º molar e pela raiz distobucal do^2º molar) (Figura 7D).
   12. Use a orientação da fatia x como referência para o alinhamento da fatia em y (linha azul vertical no painel da fatia x).
       1. Alinhe a fatia em Y de modo que fique verticalmente paralela através da raiz do primeiro molar no painel da fatia X (Figura 7E). Gire o plano para orientar a raiz verticalmente. Observe que a linha azul atravessa o meio da raiz.
          NOTA: Em áreas de perda óssea (como esperado neste modelo), a crista alveolar pode apresentar um defeito; portanto, a linha média da raiz deve ser estimada porque o osso ao redor pode não estar presente para definir idealmente o meio do alvéolo.
   13. No painel de fatia em Y, meça a distância da junção de esmalte cemento-esmalte (CEJ) até a crista óssea alveolar (ABC) colocando o cursor no ponto mais profundo do sulco na CEJ e pressionando 1, e depois colocando o cursor no ponto mais próximo do ABC e pressionando 2 , como mostrado (Figura 7F). O^1º ponto é indicado por uma seta azul e o segundo ponto por uma seta verde.
       1. Se as setas não aparecerem até que ambos os pontos estejam selecionados, selecione-as passando o cursor sobre as áreas desejadas e pressione as teclas numéricas do teclado, pois só clicar no mouse não funcionará.
       2. Se o CEJ for difícil de determinar, use as setas para cima e para baixo para percorrer fatias adjacentes e confirmar sua localização.
       3. Meça múltiplos pontos do ABC se o "ponto mais próximo" for difícil de determinar para confirmar que há pouca ou nenhuma variação na medição.
          NOTA: Para confirmar que a medição correta foi feita, é necessário ver as fatias x e z se cruzando sobre a raiz desejada e confirmar visualmente a medição na visualização 3D escondendo os planos (Figura 7F).
2. Quantificação da expressão gengival de Rankl/Opg e Rankl/Rank
   1. Colete tecido gengival conforme descrito^{anteriormente 9}.
      NOTA: Os melhores resultados de extração de RNA são obtidos usando amostras de tecido fresco e a purificação de RNA deve ser processada o mais rápido possível.
   2. Extraia RNA do tecido gengival por batida de esferas usando o kit referenciado e as esferas cerâmicas. Siga as instruções do kit e armazene a amostra a -80 °C até a análise por qRT-PCR.

Resultados

A análise representativa de dados das medições do osso alveolar linear em camundongos fêmeas e machos WT no início (saúde) e 9 dias após a ligadura é apresentada na Figura 1A. O cálculo de potência indica que um total de 10 camundongos (4-5 por grupo) são necessários para detectar diferenças entre esses grupos se o resultado principal considerado forem os níveis lineares de osso medidos por μCT (Figura 1B). No entanto, um cálcul...

Discussão

O presente estudo fornece informações perspicazes e orientações detalhadas, passo a passo, sobre o protocolo simplificado de modelo de periodontite induzida por ligadura anteriormente^{apresentado 10}. Os detalhes incluídos no presente artigo podem impactar drasticamente a reprodutibilidade e são apoiados pela experiência do grupo com este modelo específico de periodontite induzida por ligaduras: 11,12,13,18,19,21.^...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Blade	Integra	4-315C	Lâmina 15C
Contas cerâmicas	VWR	10158-608	0,5 mL x 1,4 mm Contas cerâmicas
Material de cola/resina	A Empresa de Cola Gorila,	8401519
Suporte de Ligadura (com Entalhe)	Centro central da instalação do UNC no Centro de Design BeAM de Chapel Hill	Não aplicável	118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Trava do Suporte de Ligadura	Centro central da instalação do UNC no Centro de Design BeAM de Chapel Hill	Não aplicável	17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Impressora 3D Lulzbot mini v1.0	Lulzbot (Fargo Aditivive Manufacturing Equipment 3D, LLC)	Não aplicável	Objetos Aleph, modelo Lulzbot Mini v1.0
MicroView Software	Inovações na Parallax	2.5.0-3139	Software usado para medições ósseas
Cama Dentária para Rato (Com Entalhes)	Centro central da instalação do UNC no Centro de Design BeAM de Chapel Hill	Não aplicável	103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Topo de Cama Dental Mouse	Centro central da instalação do UNC no Centro de Design BeAM de Chapel Hill	Não aplicável	99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Filamento de ácido polilático (PLA)	Palavra por palavra	55259	PLA 3,0 mm
Kit de Tecidos de RNA Rapidpure	MP Biomédicos	112721050
Cabo de lâmina de bisturi	Bard-Parker	371030	Cabo de lâmina de bisturi 15C
Seda de sutura	Instrumento Cirúrgico Roboz	SUT-15-1
Primers Taqman qPCR	Thermo Fisher	Posto (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765	InvivoGen, San Diego, EUA	#inh-vx765-1	Inibidor de caspase-1 usado para modulação do hospedeiro