É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Descrevemos um protocolo para estabelecer um modelo de cultura de interface ar-líquido (ALI) utilizando células epiteliais das vias aéreas traqueais neonatais (nTAEC) e realizar exposição à hiperóxia fisiologicamente relevante para estudar o efeito do estresse oxidativo induzido pela atmosfera em células derivadas do epitélio da superfície das vias aéreas neonatais em desenvolvimento.
O epitélio das vias aéreas neonatais pré-termo está constantemente exposto a estressores ambientais. Um desses estressores em neonatos com doença pulmonar inclui a tensão de oxigênio (O2) maior do que a atmosfera ambiente - denominada hiperóxia (>21% O2). O efeito da hiperóxia nas vias aéreas depende de vários fatores, incluindo o estágio de desenvolvimento das vias aéreas, o grau de hiperóxia e a duração da exposição, com exposições variáveis potencialmente levando a fenótipos únicos. Embora tenha havido uma extensa pesquisa sobre o efeito da hiperóxia na alveolarização pulmonar neonatal e na hiper-reatividade das vias aéreas, pouco se sabe sobre o efeito subjacente de curto e longo prazo da hiperóxia nas células epiteliais das vias aéreas neonatais humanas. Uma das principais razões para isso é a escassez de um modelo in vitro eficaz para estudar o desenvolvimento e a função epitelial das vias aéreas neonatais humanas. Aqui, descrevemos um método para isolar e expandir células epiteliais das vias aéreas traqueais neonatais humanas (nTAECs) utilizando aspirados traqueais neonatais humanos e cultura dessas células em cultura de interface ar-líquido (ALI). Demonstramos que as nTAECs formam uma monocamada celular polarizada madura em cultura de LPA e sofrem diferenciação mucociliar. Também apresentamos um método para exposição moderada à hiperóxia da monocamada celular em cultura de LPA usando uma incubadora especializada. Além disso, descrevemos um ensaio para medir o estresse oxidativo celular após a exposição à hiperóxia em cultura de LPA usando quantificação fluorescente, que confirma que a exposição moderada à hiperóxia induz estresse oxidativo celular, mas não causa danos significativos à membrana celular ou apoptose. Este modelo pode potencialmente ser usado para simular a exposição à hiperóxia clinicamente relevante encontrada pelas vias aéreas neonatais na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) e usado para estudar os efeitos de curto e longo prazo do O2 na programação epitelial das vias aéreas neonatais. Estudos usando esse modelo podem ser utilizados para explorar maneiras de mitigar a lesão oxidativa no início da vida nas vias aéreas em desenvolvimento, que está implicada no desenvolvimento de doenças das vias aéreas de longo prazo em ex-bebês prematuros.
O oxigênio terapêutico (O2) é uma das terapias mais utilizadas na unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN)1. Consequentemente, a exposição à hiperóxia (>21% O2) é um estressor atmosférico comum encontrado por neonatos com e sem doença pulmonar significativa. As respostas pulmonares à hiperóxia podem variar dependendo da intensidade e/ou duração da exposição e da localização anatômica, tipo de célula e estágio de desenvolvimento pulmonar 2,3,4,5,6.<....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
As amostras de aspirado traqueal neonatal foram coletadas somente após o consentimento informado dos pais, e o protocolo utilizado para coleta, transporte e armazenamento foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma (IRB 14377).
1. Preparação para isolamento, passagem e cultura ALI de nTAEC
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Para isolar os nTAECs, coletamos aspirados traqueais de neonatos intubados na UTIN e transportamos os aspirados em gelo para o laboratório para processamento posterior (Figura 1A). Após a semeadura das amostras de aspirado traqueal em meio de crescimento epitelial das vias aéreas (BLEAM-I contendo inibidores de Rho/Smad, GSK3 e mTOR), as células cuboidais apareceram dentro de 7 a 10 dias. Aos 14 dias, as células estavam 50% -60% confluentes e, cerca de 21 di.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
O protocolo aqui descrito detalha um método para a coleta e processamento de amostras de aspirado traqueal neonatal de neonatos intubados na UTIN, com posterior isolamento e expansão de nTAECs vivos dessas amostras usando métodos previamente estabelecidos39. Além disso, descrevemos um método para cultivar nTAECs em LPA e caracterizar sua diferenciação em um epitélio mucociliar polarizado das vias aéreas em função do tempo por meio da medição de TEER, ensaio FITC-d.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm nada a divulgar e nenhum conflito de interesse a relatar.
Este trabalho é apoiado por financiamento da Presbyterian Health Foundation (PHF) e Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 com um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do NIGMS) para AG. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul LeRou e ao Dr. Xingbin Ai do Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, por fornecerem células de doadores neonatais usadas em alguns dos experimentos. As figuras foram criadas com Biorender. A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Formalina tamponada a 10% | Fisher Scientific | 23-426796 | |
| 1X PBS (solução salina tamponada com fosfato), pH 7,4 | Gibco | 10010049 | |
| A 83-01 | Tocris | 29-391-0 | |
| ALI Transwell Inserts, anticorpo | Corning | 3470 | |
| , monoclonal de camundongo | Sigma | T7451 | |
| Anticorpo anti-alfa tubulina | Abcam | ab7291 | |
| Anticorpo anticitoqueratina 5 | Abcam | ab53121 | |
| BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM) | LifeLine Cell Technology | LL-0023 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 44-231-0 | |
| Anticorpo de caspase-3 clivado | Sinalização celular | 9664T | |
| Proteína de SCGB1A1 ou Célula de Clube (CC16) Humano, Anticorpo Policlonal de Coelho | BioVendor R& D | RD181022220-01 | |
| CM-H2DCFDA (Indicador Geral de Estresse Oxidativo) | Thermo Scientific | C6827 | |
| Corning Frascos T25 tratados com cultura de células Corning | 430639 | ||
| Frascos T75 Corning em forma de U | Corning | 430641U | |
| CyQUANT LDH Ensaio de citotoxicidade | Thermo Scientific | C20300 | |
| DAPI Solução (1 mg/mL) | Fisher Scientific | EN62248 | |
| Dimetilsulfóxido [DMSO] Hybri-Max | Sigma | D2650 | |
| Água destilada | Gibco | 15230162 | |
| EVOM Manual para Medição TEER | Instrumento de Precisão Mundial | EVM-MT-03-01 | |
| FBS (Soro Fetal Bovino) | Gibco | 10082147 | |
| Isotiocianato de Fluoresceína Dextrano (peso médio de mol 10.000) | Fisher Scientific | F0918100MG | |
| Isotiocianato de Fluoresceína– dextrano (peso médio de mol 20,00) | Sigma | FD20-100MG | |
| IgG anti-rato de cabra (H+L), anúncios humanos-HRP | Southern Biotech | 1031-05 | |
| Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG2b anti-rato de cabra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21141 | |
| IgG de cabra anti-coelho (H+L) Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| IgG anti-coelho de cabra (H + L), mouse / humanos ads-HRP | Southern Biotech | 4050-05 | |
| HBTEC Interface Ar-Líquido (ALI) Diferenciação Medium | LifeLine Cell Technology | LM-0050 | |
| HEPES | Lonza | CC-5024 | |
| Heracell VIOS 160i Incubadora de CO2 Tri-Gas, 165 L | Kit | de | |
| Suplemento Thermo Scientific | 4368814 | ||
| HLL | LifeLine Cell Technology | LS-1001 | |
| ImageJ | NIH | N/A | |
| Invivogen Normocin - Reagente Antimicrobiano | Fisher Scientific | NC9273499 | |
| L-Glutamina | LifeLine Cell Technology | LS-1013 | |
| Soro de Cabra Normal | Gibco | ||
| Normocin | Invivogen | ant-nr-05 | |
| anticorpo p63 | Santa Cruz Biotechnology | sc-25268 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183025 | |
| RAPAMYCIN | Thermo Scientific | AAJ62473MC | |
| Taqman de 4444964 | Thermo Scientific | ||
| Taqman: 18S rRNA | Thermo Scientific | Hs99999901_s1 | |
| Ensaios de Exposição de Genes Taqman: CAT | Thermo Scientific | Hs00156308_m1 | |
| Ensaios de Exposição de Genes Taqman: FOXJ1 | Thermo Scientific | Hs00230964_m1 | |
| Ensaios de Exposição de Genes Taqman: GAPDH | Ensaios | da Hs02786624_g1 | |
| da | Thermo Scientific | GPX1 | |
| : Ensaios de Extensão do Gene Taqman da Hs01591589_m1 | Thermo Scientific | ||
| GPX2: Ensaios de Extensão do Gene Taqman | Hs01078668_m1 | Scientific | |
| : KRT5 | Thermo Scientific | ||
| Exposição do Gene Taqman Hs00361185_m1: MUC5AC | Thermo Scientific | Hs01365616_m1 | |
| Ensaios de Exposição do Gene Taqman: SCGB1A1 | Thermo Scientific | Hs00171092_m1 | |
| Ensaios de Exposição do Gene Taqman: SOD1 | Thermo Scientific | Hs00533490_m1 | |
| Ensaios de Exposição do Gene Taqman: SOD2 | Thermo Scientific | Hs00167309_m1 | |
| Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis de Fluxo Rápido Nalgene da Thermo Scientific com Membrana PES (0.22 μ m poros, 500 ml) | Thermo Scientific | 5660020 | |
| TM-1 Suplemento Combinado | LifeLine Cell Technology | LS-1055 | |
| Anticorpo total de caspase-3 | Sinalização celular | 14220S | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), Fenol vermelho | Gibco | 25300062 | |
| Y-27632 2 HCl | Tocris | 12-541-0 |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Este artigo foi publicado
Vídeo em breve