Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de culturas de células ex vivo ou in vitro para pré-processamento de dados transcriptômicos para triagem de drogas baseada em transcriptoma custo-efetivo.
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Artigo de método
Triagem Transcriptomic-Based Drug Screening Custo-Eficiente
Neste artigo
Resumo
Resumo
A transcriptômica permite obter informações abrangentes sobre programas celulares e suas respostas a perturbações. Apesar da diminuição significativa dos custos de produção e sequenciamento das bibliotecas na última década, a aplicação dessas tecnologias na escala necessária para a triagem de drogas continua sendo proibitivamente cara, obstruindo o imenso potencial desses métodos. Nosso estudo apresenta um sistema custo-efetivo para triagem de drogas baseada em transcriptomas, combinando culturas de perturbação miniaturizadas com transcriptômica mini-massil. O protocolo otimizado de mini-bulk fornece sinais biológicos informativos em profundidade de sequenciamento econômica, permitindo uma extensa triagem de drogas conhecidas e novas moléculas. Dependendo do tratamento escolhido e do tempo de incubação, este protocolo resultará em bibliotecas de sequenciamento dentro de aproximadamente 2 dias. Devido a vários pontos de parada dentro deste protocolo, a preparação da biblioteca, bem como o sequenciamento, pode ser realizado de forma independente do tempo. É possível processar simultaneamente um número elevado de amostras; A medição de até 384 amostras foi testada sem perda da qualidade dos dados. Também não há limitações conhecidas para o número de condições e/ou drogas, apesar de considerar a variabilidade nos tempos ideais de incubação dos fármacos.
Introdução
O desenvolvimento de novos fármacos é um processo complexo e demorado que envolve a identificação de potenciais fármacos e seus alvos, a otimização e síntese de candidatos a fármacos e o teste de sua eficácia e segurança em ensaios pré-clínicos e clínicos1. Os métodos tradicionais de triagem de drogas, ou seja, a avaliação sistemática de bibliotecas de compostos candidatos para fins terapêuticos, envolvem o uso de modelos animais ou ensaios baseados em células para testar os efeitos em alvos ou vias específicas. Embora esses métodos tenham sido bem-sucedidos na identificação de candidatos a drogas, eles muitas vezes não forneceram informações s....
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética locais da Universidade de Bonn.
1. Preparação de tampões, soluções e equipamentos
- Preparar as soluções e reunir os materiais descritos na Tabela de Materiais.
- Aquecer o banho-maria a 37 °C e aquecer o meio de crescimento completo (RPMI-1640 + 10% de soro fetal de bezerro (SFB) + 1% de penicilina/estreptomicina).
- Para a colheita celular, use solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada.
NOTA: Mantenha um ambiente limpo enquanto trabalha com células para manter a esterilidade.
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Resultados
Seguindo o protocolo relatado, as CMSP humanas foram semeadas, tratadas com diferentes drogas imunomoduladoras e, após diferentes tempos de incubação, colhidas para análise transcriptômica em massa usando o protocolo de sequenciamento (Figura 1).
As concentrações ideais dos fármacos e os tempos de incubação dos compostos teste devem ser identificados a montante deste protocolo com o auxílio de estratégias experimentais complementares e com base na questão científi.......
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Discussão
A descoberta de drogas e o desenvolvimento de drogas podem se beneficiar muito da visão holística dos processos celulares que a transcriptômica em massa pode fornecer. No entanto, essa abordagem é frequentemente limitada pelo alto custo do experimento com o protocolo RNA-seq a granel padrão, proibindo sua aplicação em ambientes acadêmicos, bem como seu potencial para escalabilidade industrial.
As etapas mais críticas do protocolo são o descongelamento celular e as etapas iniciais da preparação.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
A J.L.S. é apoiada pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) no âmbito da Estratégia de Excelência da Alemanha (EXC2151-390873048), bem como sob o SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, o projeto de excelência financiado pelo BMBF Diet-Body-Brain (DietBB); e o projeto da UE SYSCID sob o número de subvenção 733100. M.B. é suportado pela DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). A L.B. é apoiada pela DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Projeto número 513977171) e pela Estratégia de Excelência da Alemanha (EXC2151-390873048). Imagens criadas com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo cônico de 50 mL | fisher scientific | 10203001 | |
| Adesivo PCR | Selos Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 amostras) |
| Contas AMPure XP | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Placas de 96 poços de grau de cultura de células | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Bomba de vácuo de cultura de células (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Mistura de trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs) 10 mM cada | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | para células aderentes |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Soro Fetal Bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Pontas de filtro (10 µ L) | Gilson | ||
| Pontas de filtro (100 µ L) | Gilson | ||
| Pontas de filtro (20 µ L) | Gilson | ||
| Pontas de filtro (200 µ L) | Gilson | ||
| Cloridrato de Guanidina | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µ M) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Suporte magnético Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT (96 amostras), alternativamente 0,2% SDS |
| Primer de indexação compatível com Nextera | Água | ||
| Invitrogen | 10977049 | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR Placas de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| Selante de placas PCR | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicilina / Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorômetro | Invitrogen | 15723679 | |
| Inibidor de RNase recombinante (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 meio de cultura de células | Gibco | 61870036 | Se não estiver funcionando com PBMCs, ajuste para o tipo de célula |
| Primer SMART dT30VN | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 | |
| Equipamento de laboratório padrão | vários | por | exemplo, centrífuga, máquina de gelo, balde de gelo, água destilada, banho-maria |
| SuperScript II Transcriptase Reversa (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Transcriptase Reversa (SSRT II) tampão (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 amostras) |
| Sistema TapeStation 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotina AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G | |
| Mixer Vortex-Genie 2 | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Referências
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19(2020).
- Bonagur....
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Reimpressões e permissões
