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Artigo de método

Hibridização da Reação em Cadeia de RNA Fluorescência de Monte Inteiro Hibridização in situ de Genes Quimiossensoriais em Apêndices Olfativos de Mosquitos

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DOI:

10.3791/65933

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17 de novembro de 2023

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

O artigo descreve os métodos e reagentes necessários para realizar a hibridização em cadeia de reação em cadeia de hibridização por fluorescência completa de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) para revelar informações sobre a resolução espacial e celular de genes de receptores quimiossensoriais na antena do mosquito e palpo maxilar.

Resumo

Os mosquitos são vetores eficazes de doenças mortais e podem navegar em seu ambiente químico usando receptores quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos. Compreender como os receptores quimiossensoriais estão organizados espacialmente nos apêndices olfativos periféricos pode oferecer insights sobre como o odor é codificado no sistema olfatório do mosquito e informar novas maneiras de combater a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos. O surgimento da hibridização de terceira geração de reação em cadeia de RNA, hibridação in situ de montagem total de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) permite o mapeamento espacial e o perfil de expressão simultânea de múltiplos genes quimiossensoriais. Aqui, descrevemos uma abordagem passo a passo para a realização do HCR RNA WM-FISH na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar. Investigamos a sensibilidade desta técnica examinando o perfil de expressão dos receptores olfatórios ionotrópicos. Perguntamos se a técnica de HCR WM-FISH descrita era adequada para estudos multiplexados por meio da ligação de sondas de RNA a três fluoróforos espectralmente distintos. Os resultados forneceram evidências de que o HCR RNA WM-FISH é robustamente sensível para detectar simultaneamente múltiplos genes quimiossensoriais na antena e apêndices olfativos palpos maxilares. Investigações posteriores atestam a adequação do HCR WM-FISH para o perfil de co-expressão de alvos de RNA duplo e triplo. Esta técnica, quando aplicada com modificações, pode ser adaptável para localizar genes de interesse nos tecidos olfativos de outras espécies de insetos ou em outros apêndices.

Introdução

Mosquitos vetores como Anopheles gambiae dependem de um rico repertório de genes quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos periféricos para prosperar em um mundo químico complexo e identificar odores comportamentalmente relevantes emanados de hospedeiros humanos, detectar fontes de néctar e localizar sítios de oviposição1. A antena do mosquito e o palpo maxilar são enriquecidos com genes quimiossensoriais que conduzem a detecção de odor nesses apêndices olfativos. Três classes principais de canais iônicos ligados a ligantes conduzem a detecção de odor nos apêndices olfativos de mosquitos: os receptores odorantes (ORs), que funcionam com um co-receptor odorante obrigatório (Orco); os receptores ionotrópicos (RIs), que interagem com um ou mais correceptores de RI (IR8a, IR25a e IR76b); os receptores gustativos quimiossensoriais (RGs), que funcionam como um complexo de três proteínas para detectar dióxido de carbono (CO2)1,2.

A hibridização in situ por fluorescência de RNA é uma ferramenta poderosa para detectar a expressão deRNAm 3 endógeno. Em geral, este método utiliza uma sonda de ácido nucleico de fita simples marcada com fluoróforo com sequência complementar a um RNAm alvo. A ligação da sonda de RNA fluorescente ao RNA alvo permite a identificação de células que expressam um transcrito de interesse. Avanços recentes agora permitem a detecção de transcritos em tecidos de mosquitos de montagem total 4,5. A primeira geração da tecnologia de reação em cadeia de hibridização (HCR) usou um amplificador HCR baseado em RNA; isso foi melhorado em um método de segunda geração que, em vez disso, usou DNA projetado para o amplificador HCR 6,7. Essa atualização resultou em um aumento de 10x no sinal, uma redução drástica no custo de produção e uma melhoria significativa na durabilidade dos reagentes 6,7.

No protocolo, descrevemos a utilização de um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA de terceira geração (HCR RNA WM-FISH) desenvolvido para detectar a localização espacial e expressão de qualquer gene 8,9. Este método de duas etapas utiliza primeiro sondas de ácido nucleico específicas para o mRNA de interesse, mas que também contêm uma sequência de reconhecimento do iniciador; a segunda etapa utiliza grampos marcados com fluoróforos que se ligam à sequência do iniciador para amplificar o sinal fluorescente (Figura 1). Este método também permite a multiplexação de duas ou mais sondas de RNA e amplificação de sinais de sonda para facilitar a detecção e quantificação de RNA8. A visualização da abundância de transcritos e dos padrões de localização de RNA de genes quimiossensoriais expressos nos apêndices olfativos oferece a primeira linha de conhecimento sobre as funções gênicas quimiossensoriais e a codificação de odores.

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Protocolo

1. Considerações e preparação dos materiais

  1. Decida se a montagem completa ou a criossecção do tecido serão apropriadas. Este protocolo é otimizado para imagens in situ de RNA na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar sem criossecção. Se as amostras tiverem espessura superior a 5 mm, recomenda-se a criossecção para permitir a penetração da sonda.
  2. Identifique os genes de interesse e copie as sequências, incluindo íntrons e éxons de um banco de dados adequado. Transcreva a sequência gênica em RNA para síntese.
  3. Determine se as sondas devem ser compradas de fornecedores comerciais ou se as sondas serão sintetizadas em laboratório.
    NOTA: Neste estudo, as sondas in situ foram adquiridas de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais). Alternativamente, pode ser sintetizado como relatado anteriormente10. Os reagentes utilizados no estudo estão descritos na Tabela 1. Os materiais necessários para preparar os reagentes estão listados na Tabela de Materiais.

2. Pré-fixação tecidual

  1. Anestesiar 10-15 mosquitos Anopheles coluzzii adultos fêmeas ou machos (cepa N'Gousso), com idade entre 5 e 10 dias após a emergência, coletando-os com um aspirador bucal em um copo de papel ou tubo plástico e colocando-os em um balde contendo gelo. Uma anestesia induzida pelo frio bem-sucedida pode ser confirmada quando os mosquitos estão imóveis.
  2. Decapitá-los removendo as cabeças da região do pescoço com um par de pinças. Com a mão não dominante, segure o tórax com uma pinça e separe o pescoço do corpo com uma pinça segurada pela mão dominante. Colocar as cabeças num tubo de 1,5 ml contendo 500 μL de tampão quitinase-quimotripsina dimetilsulfóxido (tampão CCD) sobre gelo.
    OBS: Animais congelantes podem deformar as antenas; Recomenda-se uma rápida derrubada no gelo. A idade do mosquito durante o teste pode variar dependendo do projeto. É importante confirmar e coordenar seu estado fisiológico, como se eles são alimentados com sangue, famintos ou acasalados. Neste estudo, apêndices olfativos foram amostrados de mosquitos que foram alimentados com sangue e acasalados.
  3. Pré-aqueça as cabeças do mosquito em tampão CCD a 37 ° C em um bloco de calor por 5 min e, em seguida, transfira o tubo contendo as cabeças do mosquito para um forno de hibridização e gire a 37 ° C. O tempo de incubação no tampão CCD depende do tipo de tecido. Para antenas Anopheles fêmeas, use 20 min, antenas masculinas requerem 15 min, enquanto maior tempo de incubação (1 h) é necessário para os palpos maxilares.
  4. Transfira todo o conteúdo do tubo para um vidro de relógio dissecante. Despeje suavemente a amostra na depressão de um vidro de relógio (dissecação). Se as cabeças do mosquito estiverem presas dentro do tubo, use uma pipeta para adicionar tampão CCD no tubo e enxaguar a cabeça.
  5. Use pinça para transferir cuidadosamente as cabeças ou quaisquer antenas/palpos destacados durante a incubação e fixe em 1 mL do pré-fixador.
    NOTA: O buffer CCD restante pode ser preservado a -20 ° C. O buffer pode ser reutilizado até 3x. Se o pré-fixador ficar levemente acastanhado por causa do transporte do tampão CCD pelos tecidos, substitua-o por mais 1 mL de fixador.
  6. Gire as cabeças em pré-fixador por 24 h a 4° C usando um nutador.
    OBS: A velocidade de balanço do nutador utilizado neste estudo não foi ajustável; Foi utilizada a velocidade padrão definida (12 rpm) pelo fabricante.

3. Dissecção tecidual

  1. Enxaguar as cabeças 4x (5 min por lavagem) com 1 mL de PBS-Tween a 0,1% no gelo. Para evitar a perda de amostra, use uma pipeta acoplada à ponta de carregamento de gel para remover o líquido.
    NOTA: Duas lavagens rápidas seguidas de uma lavagem de 10 minutos e uma lavagem rápida final poderia ser realizada em vez da etapa 3.1.
  2. Transfira as cabeças no tubo para um vidro de relógio dissecante. Despeje suavemente a amostra na depressão de um vidro de relógio. Enxágue as cabeças dos mosquitos que estão presas dentro do tubo com 0,1% de PBS-Tween.
  3. Sob um microscópio dissecante, remova os tecidos de interesse (antenas/palpos) da cabeça com pinças afiadas. Segure a parte posterior da cabeça com pinça e pegue uma antena com outra pinça da base. Pinça limpa com papel umedecido com solvente sem RNAse. Remova os palpos usando o mesmo processo.
  4. Transfira as antenas e palpos com pinças para tubos vazios sem DNA/RNase colocados no gelo. Separe as diferentes partes do tecido em tubos diferentes pré-marcados.
  5. Desidratar o tecido em 400 μL de solvente contendo uma mistura de metanol (MeOH 80%) e dimetilsulfóxido (DMSO 20%) por 1 h à temperatura ambiente.
    NOTA: Não há necessidade de colocar tecido em um nutador; Deixe-o descansar em um rack de tubo à temperatura ambiente na bancada do laboratório. Recomenda-se o uso de mistura de solventes frescos. Para uma solução-mãe de 500 μL, misturar 400 μL de MeOH com 100 μL de DMSO.
  6. Substitua o reagente desidratante por 400 μL de metanol absoluto (100%) e desidrate os tecidos durante a noite a -20 °C. Deixe os tecidos se acomodarem por gravidade e use uma pipeta para remover o líquido.
    NOTA: As amostras são viáveis para um período prolongado de desidratação, até 4 noites foram testadas sem perda de sinal.

4. Pós-fixação tecidual

  1. Reidratar os tecidos em uma série de quatro etapas de 400 μL de MeOH/PBS-Tween por 10 min em gelo. Comece com 75% MeOH/25% PBS-Tween seguido por 50% MeOH/ 50% PBS-Tween, depois 25% MeOH/ 75% PBS-Tween e, finalmente, 100% PBS-Tween.
    NOTA: Uma ponta de carregamento de gel com uma pequena abertura pode ser usada para remover o tampão do tubo para evitar a perda dos tecidos. A remoção do tampão pode ser feita sob um microscópio dissecante.
  2. Lavar com 400 μL de solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 a 0,1% (PBS-T) por 10 min à temperatura ambiente. Lave colocando a amostra num nutador.
  3. Fazer uma solução de 20 μg/mL de proteinase-K e incubar em 400 μL de solução de proteinase-K por 30 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Diluir 20 mg/mL de proteinase-K (solução estoque de 1000x), ou seja, 2 μL em 2 mL de PBS-Tween a 0,1%. As sobras podem ser armazenadas em um freezer de -20°C.
  4. Pare a digestão enzimática do tecido lavando 2x por 10 min com 400 μL de PBS-tween a 0,1%.
  5. Adicionar 400 μL do pós-fixador e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Lavar 3x, 15 min por lavagem, com 400 μL de PBS-Tween a 0,1%.

5. Hibridização da sonda

  1. Incubar o tecido em 400 μL de tampão de hibridização por 5 min. Certifique-se de que o tecido está completamente submerso no tampão pipetando suavemente.
  2. Prepare-se para a próxima etapa aquecendo uma alíquota de tampão de hibridização de sonda a 37°C por 30 min.
  3. Retire o tampão e pré-hibridize com 400 μL de tampão de hibridização pré-aquecido por 30 min a 37°C.
  4. Fazer solução de sonda para os receptores quimiossensoriais alvo (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a ou Orco) adicionando 8 pM de sonda. Adicionar 8 μL de estoque de sonda de 1 μM a 500 μL de tampão de hibridização pré-aquecido da sonda.
  5. Remova o tampão de hibridização da sonda pré-aquecido e substitua-o por 400 μL de solução de sonda aquecida.
  6. Incubar o tecido a 37 ° C por duas noites em um nutador colocado dentro de uma incubadora e coberto sob uma caixa.

6. Amplificação da sonda

  1. Aqueça o tampão de lavagem da sonda a 37 ° C. Retire o excesso de solução da sonda enxaguando o tecido 5x, 10 min por lavagem, com 400 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 ° C, nutando na incubadora.
    NOTA: A preparação para o passo 6.4 pode começar. Veja a nota na etapa 6.4.
  2. Lavar amostras 2x, 5 min por lavagem, com 400 μL de 5x citrato salino-sódico contendo 10% de Tween-20 (SSCT) à temperatura ambiente. Descongelar o tampão de amplificação à temperatura ambiente em uma bancada.
  3. Preparar o tecido para amplificação incubando com 400 μL de tampão de amplificação por 10 min à temperatura ambiente. Devido à viscosidade do tampão de amplificação, os tecidos podem não estar completamente submersos. Misture pipetando suavemente o tampão de amplificação abaixo do tecido e expelindo o tampão em cima do tecido até que eles fiquem submersos.
  4. Preparar separadamente 18 pM de hairpin h1 e 18 pM de hairpin h2 aquecendo 6 μL de estoque de 3 μM a 95 °C por 90 s e resfriar à temperatura ambiente em uma gaveta escura por 30 min. Certifique-se de que os tubos de PCR estejam bem tampados para evitar a evaporação dos grampos de cabelo durante o aquecimento em um termociclador.
    NOTA: Para economizar tempo, a etapa 6.4 pode ser iniciada durante a4ª etapa de lavagem na etapa 6.1. Os grampos de cabelo devem ser aquecidos separadamente para evitar reação cruzada. Os grampos de cabelo não devem ser diluídos com qualquer tampão nesta etapa. Os grampos de cabelo podem ser comprados do fabricante da sonda junto com as sondas.
  5. Substitua o tampão de amplificação adicionado no passo 6.3 por uma mistura contendo os grampos aquecidos (do passo 6.4) juntamente com 100 μL de tampão de amplificação. Uma reação típica conterá 6 μL de h1, 6 μL de h2 e 100 μL de tampão de amplificação.
    NOTA: Os grampos h1 e h2 podem ser combinados após o resfriamento à temperatura ambiente e, em seguida, adicionados a 100 μL de tampão de amplificação. Para evitar a transferência das amostras de tecido de um tubo para outro, o tampão de amplificação na etapa 6.3 pode ser removido e substituído pela mistura de grampos diluídos em tampão de amplificação.
  6. Incubar o tecido durante a noite e nutar no escuro à temperatura ambiente usando a velocidade padrão do nutador.

7. Montagem da amostra de tecido

  1. Tampão de amplificação diluído no tecido incubado com 300 μL de 5x SSCT (cloreto de sódio-citrato de sódio diluído em Tween-20).
    NOTA: A diluição é útil para reduzir a viscosidade e facilita a remoção do tampão de amplificação do tecido. Utilizamos Triton-X 100 para o passo pré-fixativo e Tween-20 para o passo pós-fixativo devido às diferenças em suas ações como agentes de permeabilização da membrana celular.
  2. Lavar o tecido 5x com 400 μL de 5x SSCT à temperatura ambiente.
    NOTA: Conservar temporariamente o tecido a 4 °C até estar pronto para ser montado, se necessário. Não ultrapassamos 2 dias antes da aquisição de imagens.
  3. Faça 5 gotículas de solução de montagem em uma lâmina de vidro. Corte a ponta de uma pipeta de 200 μL para torná-la mais larga e transfira o tecido para uma nova lâmina de vidro.
  4. Pegue as amostras de tecido por sua base com pinças e mergulhe e enxágue suavemente em uma série de gotículas de solução de montagem. Tenha cuidado para não quebrar os tecidos nesta etapa.
  5. Monte com solução de montagem, coloque a tampa e sele com esmalte. Imagem in situ de amostras de tecido usando microscópio confocal.

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Resultados

Detecção robusta de genes quimiossensoriais em antena de anofelinos
Investigamos a sensibilidade do método HCR FISH (Figura 1) para detectar a expressão de receptores quimiossensoriais em tecidos olfativos de mosquitos. Guiados pelos dados de transcrição de RNA relatados anteriormente na antena fêmea do mosquito Anopheles, geramos sondas para atingir uma variedade de IRs. Os valores médios de transcrição de quatro estudos independentes de transcriptoma a...

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Discussão

A terceira geração da reação em cadeia de hibridização (HCR) é notável por sua sensibilidade e robustez para visualizar vários alvos deRNA8. O HCR WM-FISH tem sido utilizado com sucesso em embriões de Drosophila, galinhas, camundongos e zebrafish, bem como em larvas de nematoides e zebrafish 10,16,17. Antenas de mosquito e palpos maxilares são tipicamente propensos a alta autofluorescência e frac...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Margo Herre e ao laboratório Leslie Vosshall por compartilharem seu protocolo de hibridização in situ para apêndices olfativos do Aedes aegypti . Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde para C.J.P. (NIAID R01Al137078), uma bolsa HHMI Hanna Gray para J.I.R, um Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award para J.I.R, e uma bolsa de pós-doutorado do Johns Hopkins Malaria Research Institute para J.I.R. Agradecemos ao Johns Hopkins Malaria Research Institute e à Bloomberg Philanthropies pelo apoio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tampão de amplificaçãoMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | Hibridização In Situ + Imunofluorescência50 mL
Cloreto de Cálcio (CaCl2) 1M Sigma-Aldrich 21115-100ML
ChitinaseSigma-AldrichC6137-50UN
QuimotripsinaSigma-AldrichCHY5S-10VL 
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf tuboVWR20901-5511.5 mL
FórcepsDumont11251Número 5
Ponta de carregamento de gelCostar48531-200 µ Ponta L
Grampos de cabelo InstrumentosMoleculares Instrumentos Moleculares, Inc. | Hibridização In Situ + Imunofluorescênciah1 e h2 iniciador divide HEPES
(1M)Sigma-AldrichH0887
IR25a sondaMolecular InstrumentsConjunto de Sondas ID: PRK149 AGAP010272
Sonda IR41t.1Molecular Instruments  ID do conjunto de sondas: PRK978AGAP004432
sonda IR64aMolecular InstrumentsID do conjunto de sondas: PRK700 AGAP004923
Sonda IR75dMolecular InstrumentsID do conjunto de sondas: PRK976AGAP004969
Sonda IR76bMolecular InstrumentsID do conjunto de sondas: PRI998AGAP011968
Sonda IR7tMolecular InstrumentsID do conjunto de sondas: PRL355AGAP002763
Sonda IR8aMolecular InstrumentsID do conjunto de sondas: PRK150AGAP010411
LoBind TubesVWR80077-2360.5 mL DNA/RNA LoBind Tubos Cloreto de
Magnessium (MgCl2) 1MThermo FisherAM9530G
MetanolFisher A412-500
Água livre de nucleaseThermo Fisher43-879-36
NutatorDenville ScientificModelo 1353-D Mini rocker
Sonda OrcoInstrumentos MolecularesConjunto de sondas ID PRD954AGAP002560
Paraformaldeído (20%) Serviços deMicroscopia Eletrônica 15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS)Thermo FisherAM9625
Sonda de hibridização MolecularInstrumentshttps://www.molecularinstruments.com/50 mL
Buffer de lavagem da sondaMolecular InstrumentsMolecular Instruments, Inc. | Hibridização In Situ + Imunofluorescência100 mL
Proteinase-KThermo FisherAM2548
Salino-Citrato de Sódio (SSC) 20x Thermo Fisher15-557-044
Diamante SlowFade ThermoFisher Solução de montagemS36972
Cloreto de Sódio (NaCl) 5MInvitrogenAM9760G
Triton X-100  (10%)Sigma-Aldrich 93443
Tween-20 (10%)TeknovaT0027
Vidro de relógioCarolina742300  1 5/8" quadrado; transparente

Referências

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