O artigo descreve os métodos e reagentes necessários para realizar a hibridização em cadeia de reação em cadeia de hibridização por fluorescência completa de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) para revelar informações sobre a resolução espacial e celular de genes de receptores quimiossensoriais na antena do mosquito e palpo maxilar.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Hibridização da Reação em Cadeia de RNA Fluorescência de Monte Inteiro Hibridização in situ de Genes Quimiossensoriais em Apêndices Olfativos de Mosquitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os mosquitos são vetores eficazes de doenças mortais e podem navegar em seu ambiente químico usando receptores quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos. Compreender como os receptores quimiossensoriais estão organizados espacialmente nos apêndices olfativos periféricos pode oferecer insights sobre como o odor é codificado no sistema olfatório do mosquito e informar novas maneiras de combater a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos. O surgimento da hibridização de terceira geração de reação em cadeia de RNA, hibridação in situ de montagem total de RNA (HCR, RNA, WM-FISH) permite o mapeamento espacial e o perfil de expressão simultânea de múltiplos genes quimiossensoriais. Aqui, descrevemos uma abordagem passo a passo para a realização do HCR RNA WM-FISH na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar. Investigamos a sensibilidade desta técnica examinando o perfil de expressão dos receptores olfatórios ionotrópicos. Perguntamos se a técnica de HCR WM-FISH descrita era adequada para estudos multiplexados por meio da ligação de sondas de RNA a três fluoróforos espectralmente distintos. Os resultados forneceram evidências de que o HCR RNA WM-FISH é robustamente sensível para detectar simultaneamente múltiplos genes quimiossensoriais na antena e apêndices olfativos palpos maxilares. Investigações posteriores atestam a adequação do HCR WM-FISH para o perfil de co-expressão de alvos de RNA duplo e triplo. Esta técnica, quando aplicada com modificações, pode ser adaptável para localizar genes de interesse nos tecidos olfativos de outras espécies de insetos ou em outros apêndices.
Introdução
Mosquitos vetores como Anopheles gambiae dependem de um rico repertório de genes quimiossensoriais expressos em seus apêndices olfativos periféricos para prosperar em um mundo químico complexo e identificar odores comportamentalmente relevantes emanados de hospedeiros humanos, detectar fontes de néctar e localizar sítios de oviposição1. A antena do mosquito e o palpo maxilar são enriquecidos com genes quimiossensoriais que conduzem a detecção de odor nesses apêndices olfativos. Três classes principais de canais iônicos ligados a ligantes conduzem a detecção de odor nos apêndices olfativos de mosquitos: os receptores odorantes (ORs), qu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Considerações e preparação dos materiais
- Decida se a montagem completa ou a criossecção do tecido serão apropriadas. Este protocolo é otimizado para imagens in situ de RNA na antena do mosquito Anopheles e palpo maxilar sem criossecção. Se as amostras tiverem espessura superior a 5 mm, recomenda-se a criossecção para permitir a penetração da sonda.
- Identifique os genes de interesse e copie as sequências, incluindo íntrons e éxons de um banco de dados adequado. Transcreva a sequência gênica em RNA para síntese.
- Determine se as sondas devem ser compradas de fornecedores comerciais ou se as sondas serão ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Detecção robusta de genes quimiossensoriais em antena de anofelinos
Investigamos a sensibilidade do método HCR FISH (Figura 1) para detectar a expressão de receptores quimiossensoriais em tecidos olfativos de mosquitos. Guiados pelos dados de transcrição de RNA relatados anteriormente na antena fêmea do mosquito Anopheles, geramos sondas para atingir uma variedade de IRs. Os valores médios de transcrição de quatro estudos independentes de transcriptoma a.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A terceira geração da reação em cadeia de hibridização (HCR) é notável por sua sensibilidade e robustez para visualizar vários alvos deRNA8. O HCR WM-FISH tem sido utilizado com sucesso em embriões de Drosophila, galinhas, camundongos e zebrafish, bem como em larvas de nematoides e zebrafish 10,16,17. Antenas de mosquito e palpos maxilares são tipicamente propensos a alta autofluorescência e frac.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Margo Herre e ao laboratório Leslie Vosshall por compartilharem seu protocolo de hibridização in situ para apêndices olfativos do Aedes aegypti . Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde para C.J.P. (NIAID R01Al137078), uma bolsa HHMI Hanna Gray para J.I.R, um Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award para J.I.R, e uma bolsa de pós-doutorado do Johns Hopkins Malaria Research Institute para J.I.R. Agradecemos ao Johns Hopkins Malaria Research Institute e à Bloomberg Philanthropies pelo apoio.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tampão de amplificação | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | Hibridização In Situ + Imunofluorescência | 50 mL |
| Cloreto de Cálcio (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Quimotripsina | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tubo | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Fórceps | Dumont | 11251 | Número 5 |
| Ponta de carregamento de gel | Costar | 4853 | 1-200 µ Ponta L |
| Grampos de cabelo | Instrumentos | Moleculares Instrumentos Moleculares, Inc. | Hibridização In Situ + Imunofluorescência | h1 e h2 iniciador divide HEPES |
| (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a sonda | Molecular Instruments | Conjunto de Sondas ID: PRK149 | AGAP010272 |
| Sonda IR41t.1 | Molecular Instruments | ID do conjunto de sondas: PRK978 | AGAP004432 |
| sonda IR64a | Molecular Instruments | ID do conjunto de sondas: PRK700 | AGAP004923 |
| Sonda IR75d | Molecular Instruments | ID do conjunto de sondas: PRK976 | AGAP004969 |
| Sonda IR76b | Molecular Instruments | ID do conjunto de sondas: PRI998 | AGAP011968 |
| Sonda IR7t | Molecular Instruments | ID do conjunto de sondas: PRL355 | AGAP002763 |
| Sonda IR8a | Molecular Instruments | ID do conjunto de sondas: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubos Cloreto de |
| Magnessium (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Metanol | Fisher | A412-500 | |
| Água livre de nuclease | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Modelo 135 | 3-D Mini rocker |
| Sonda Orco | Instrumentos Moleculares | Conjunto de sondas ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldeído (20%) Serviços de | Microscopia Eletrônica | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Sonda de hibridização Molecular | Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Buffer de lavagem da sonda | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | Hibridização In Situ + Imunofluorescência | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Salino-Citrato de Sódio (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| Diamante SlowFade Thermo | Fisher | Solução de montagem | S36972 |
| Cloreto de Sódio (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10%) | Teknova | T0027 | |
| Vidro de relógio | Carolina | 742300 | 1 5/8" quadrado; transparente |
Referências
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
