Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.
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Artigo de método
Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E específica (IgE), afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial. Enquanto a coloração por imunofluorescência (IF) tem sido uma técnica padrão para detectar a expressão de proteínas doença-específicas, as técnicas convencionais de FI são limitadas em sua capacidade de detectar os níveis de expressão de três ou mais proteínas na mesma amostra. Consequentemente, técnicas de FI multicolorido têm sido desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a marcação simultânea de múltiplos alvos em células ou tecidos.
Este protocolo fornece uma visão abrangente do processo para o estabelecimento de um modelo de RA em ratos, obtenção de amostras de mucosa nasal e procedimentos técnicos para imunofluorescência multicolorida. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz, com observações comportamentais pontuando ≥5 pontos. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou aumento da contagem de células inflamatórias e integridade da mucosa nasal no grupo RA. A imunofluorescência multicolor (mIF) demonstrou aumento da expressão de RORγt e TICAM-1, enquanto a expressão de Foxp3 diminuiu no tecido da mucosa nasal de ratos RA.
Introdução
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E (IgE) específica1,2. É caracterizada por sintomas como espirros, coriza, congestão nasal e prurido nasal. Com a industrialização e urbanização, a prevalência da RA vem aumentando gradativamente, afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial1. A técnica de imunofluorescência (IF) é um método de coloração fluorescente que utiliza uma reação de ligação anticorpo-antígeno. Pode ser empregado para detectar e quantificar os níveis de distribuição e expr....
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Protocolo
O protocolo e os procedimentos experimentais receberam aprovação do Comitê Administrativo e de Pesquisa Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Ratos machos Sprague Dawley (SD), com oito semanas de idade, pesando entre 180 e 200 g, foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados sob um ciclo claro/escuro natural com temperatura (23 ± 2 °C) e umidade relativa (55% ± 10%) controladas. Doze ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo controle e grupo RA. Todos os ratos foram aclimatados a essas condições e receberam acesso gratuito a comida e água por uma semana ....
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Resultados
Seis ratos SD foram induzidos com sucesso no modelo de RA através de injeção intraperitoneal de OVA e desafio nasal. A RA foi induzida em todos os ratos do grupo RA, correspondendo a 100% do grupo. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz. Todas as observações comportamentais obtiveram pontuação ≥5 pontos (Tabela 2).
Os resultados da coloração H&E no21º dia de modelagem revelaram que, nos ratos controle, a.......
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Discussão
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória não infecciosa da mucosa nasal resultante de uma combinação de fatores ambientais e genéticos. Tornou-se um problema de saúde global, impactando a eficiência do trabalho, diminuindo a qualidade de vida, prejudicando o sono, a função cognitiva e causando irritabilidade e fadiga. A RA afeta 10%-20% da população mundial¹ e acarreta custos econômicos substanciais, causando perdas anuais de até 30-50 bilhões de euros nos países da UE18. Além disso, vário.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2021YJ0175).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Al (OH) < sub> 3< / sub> | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% etanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Amônia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Etanol anidro | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Selante | de têmpera anti-fluorescênciaSouthernBiotech | 0100-01 | |
| Máquina de tingimento automática | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Tampão citrato-fosfato | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Solução de reparo de antígeno de ácido cítrico (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | ||
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Agitador de descoloração | SCILOGEX | S1010E | |
| Solução de descalcificação EDTA | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | ||
| Secador de jateamento com aquecimento elétrico | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Máquina de marcação de caixa de embutir | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Máquina de Incorporação | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Máquina de desidratação rápida de tecidos | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Selador de filme | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Microscópio de fluorescência | ensolarado Tecnologia óptica Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Tabela de congelamento | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Cabra Anti-Coelho IgG H & L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Soro de cabra | Biosharp | BL210A | |
| H & Kit de coloração E | Leagene | DH0020 | |
| Fórceps hemostático | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Ácido clorídrico | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Caneta imuno-histoquímica | Biosharp | BC004 | |
| Forno de microondas | Midea | M1-L213B | |
| Goma neutra | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumina | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Forno | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Centrífuga de palma | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldeído | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Scanner de seção de patologia | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| Pipeta PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Dragon | KE0003087/KA0056573 | ||
| Rorγ t | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Bisturi | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Agente de têmpera autofluorescente Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Fatiador | Thermo scientific | HM325 | |
| Máquina de fatiar | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Ratos Sprague Dawley | Academia de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan | SYX  2023-0100 | |
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tesoura de tecido | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Máquina de assadeira de espalhamento de tecido | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 corantes fluorescentes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Misturador de vórtice | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Secador de lâmina de água | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Aparador de cera | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xileno | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
Referências
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Und....
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Reimpressões e permissões
