Artigo de método
Aqui apresentamos um protocolo para um teste de comportamento versátil desenvolvido recentemente, o teste de viga de escada. Este teste tem a vantagem de detectar ataxia cerebelar sutil causada por um defeito de ação do hormônio tireoidiano no sistema nervoso central em relação aos testes comportamentais convencionais que avaliam o desempenho motor.
A ação do hormônio tireoidiano (TH) é essencial durante o desenvolvimento do sistema nervoso central, incluindo o cerebelo. Em caso de deficiência de HT no início da vida, como hipotireoidismo congênito, os pacientes apresentam distúrbios neurológicos, como retardo cognitivo e déficits motores. Existem vários estudos usando modelos de camundongos com deficiência de HT específica de tecido ou célula para investigar o papel do HT no cerebelo. Em comparação com camundongos com hipotireoidismo congênito generalizado, os camundongos com deficiência de TH específicos para células cerebelares exibem características atáxicas mais leves e sutis, dificultando a avaliação da função motora ao usar testes convencionais, como o teste rotarod.
Devido à necessidade de uma ferramenta alternativa para avaliar a função motora em modelos animais relacionados ao TH, desenvolvemos um método comportamental versátil chamado "teste de feixe de escada", no qual podemos projetar os vários testes de escada dependendo da gravidade da ataxia em camundongos modelo. Utilizamos camundongos transgênicos expressando um receptor TH dominante-negativo especificamente na célula cerebelar de Purkinje, um único neurônio de saída no córtex cerebelar que modula o desempenho motor. O teste de feixe de escada recém-construído detectou com sucesso deficiências robustas no desempenho motor nos camundongos transgênicos em um nível maior em comparação com o teste rotarod. A interrupção do aprendizado motor também foi detectada no teste de viga em escada, mas não no teste de rotarod. O protocolo com este novo aparato comportamental pode ser aplicado a outros modelos animais que podem apresentar fenótipo atáxico leve para examinar mudanças sutis na função cerebelar.
O hormônio tireoidiano (HT) é indispensável para o desenvolvimento do cérebro1. Em particular, seu papel no cerebelo é crítico porque a deficiência de HT no início da vida causa desenvolvimento cerebelar aberrante 1,2. Por exemplo, no hipotireoidismo congênito, os pacientes apresentam uma série de retardo neurológico, incluindo déficits cognitivos e motores3. Para desvendar o papel do HT no desenvolvimento funcional cerebelar, alguns estudos limitaram a deficiência de HT de maneira específica para células cerebelares4. No entanto, em comparação com camundongos com hipotireoidismo congênito generalizado, nos quais todos os tecidos e células são afetados pela deficiência de HT, esses modelos específicos do cerebelo exibem ataxia tão sutil que os testes de comportamento convencionais, como rotarod, pegada e testes de trave de equilíbrio, mal detectam as diferenças. Assim, para investigar completamente os efeitos do TH na função cerebelar, é necessária uma nova ferramenta de avaliação para detectar uma mudança sutil na coordenação motora de camundongos modelo.
O teste rotarod é a ferramenta mais comum para avaliar a coordenação motora, originalmente desenvolvida por Dunham e Miya5 e posteriormente aplicada a uma versão acelerada por Jones e Roberts6. A latência para cair da haste rotativa é interpretada como o teste de coordenação motora, e sua simplicidade e concisão a tornam comumente utilizada entre pesquisadores comportamentais que estudam a funçãomotora 7. No entanto, a facilidade de uso deste teste é uma faca de dois gumes. Como a haste gira automaticamente, os ratos podem se agarrar e permanecer na haste rotativa sem se mover. Além disso, os ratos podem ter a intenção de cair em vez de continuar se equilibrando na haste rotativa. Em qualquer situação, a validade e a confiabilidade do teste são questionáveis para avaliar a "coordenação motora pura"7. Em outras palavras, não visa com precisão a função cerebelar e envolve outros fatores, como força muscular para preensão.
Em vez das ferramentas convencionais para avaliação da coordenação motora, apresentamos aqui um novo teste de comportamento chamado "teste de feixe de escada", que foi desenvolvido recentemente em nosso laboratório. O teste de caminhada em escada horizontal foi projetado para avaliar habilidades motoras complexas relacionadas ao cerebelo: previsão feed-forward e integração de movimento8. O dispositivo de teste foi composto por quatro peças de plexiglass com furos (Figura 1). As quatro placas foram conectadas em paralelo por parafusos e varas inseridos nos orifícios das placas. Duas placas externas foram usadas para estabilizar o dispositivo e duas placas internas foram usadas para projetar os vários tipos de degraus da escada (Figura 2C). A largura do degrau foi ajustada dependendo do tamanho do animal para minimizar o movimento dos animais para trás (Figura 2B). A distância do ponto de partida até a meta foi de 110 cm. O dispositivo foi localizado 60 cm acima da bancada e uma almofada de segurança foi colocada sob o dispositivo (Figura 2A). A câmara escura foi colocada perto da meta para motivar os animais a se moverem em direção à meta (Figura 2A).
Examinamos os efeitos do TH no desenvolvimento funcional cerebelar usando camundongos transgênicos que expressam o receptor TH (TR) dominante-negativo em células cerebelares de Purkinje (camundongos Mf-1 / FVB). Em ambos os testes de rotarod e ladder beam, observamos fenótipo atáxico cerebelar em camundongos Mf-1 / FVB; no entanto, o teste de trave escada conseguiu detectar diferenças mais significativas do que o teste rotarod (Figura 3). Além disso, a capacidade de aprendizagem motora pode ser avaliada mais detalhadamente no teste de viga escada (Figura 3B,C). Como pano de fundo celular de tal fenótipo comportamental, a indução de depressão de longo prazo (LTD) foi inibida e, em vez disso, a potenciação de longo prazo (LTP) foi induzida após uma estimulação indutiva de LTD em células de Purkinje Mf-1 / FVB9. A LTD é essencial para a coordenação motora e a aprendizagem motora no cerebelo10. Muitos estudos relataram déficits motores e inibição de LTD em camundongos knockout ou mutados para genes-reguladores chave na função cerebelar, no entanto, nenhum estudo relatou a indução de LTP após uma estimulação indutiva de LTD11,12. Em conjunto, esse fenômeno pode ser exclusivo de camundongos Mf-1 / FVB ou camundongos com deficiência de TH (o mesmo fenômeno foi observado em camundongos com hipotireoidismo de início adulto), sugerindo que o TH regula a função cerebelar de maneira diferente das outras proteínas-chave. Nesse caso, é plausível que camundongos com ação anormal de TH não exibam ataxia cerebelar da mesma forma que outros camundongos modelo. Isso novamente enfatiza a necessidade de um método específico para avaliar os efeitos do HT na função cerebelar. Este artigo apresenta um novo protocolo para investigar os efeitos do TH na função cerebelar usando o teste de viga de escada recém-construído.
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O protocolo de experimentação animal no presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Experimentação Animal da Universidade de Gunma. Todos os procedimentos para o cuidado e tratamento dos animais foram realizados de acordo com a Lei Japonesa sobre o Bem-Estar e Manejo de Animais e as Diretrizes para a Condução Adequada de Experimentos com Animais emitidas pelo Conselho Científico do Japão. O desenho de montagem do aparelho pode ser encontrado na Figura 1.
1. Configuração da escada
2. Habituação (Dia 0)
NOTA: Recomenda-se levar pelo menos 1 dia para habituar os ratos à configuração da escada.
3. Medição do desempenho do motor
4. Análise
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No teste do rotarod, os camundongos Mf-1 / FVB mostraram uma diminuição significativa na latência para cair da haste rotativa ao longo de 3 dias consecutivos em comparação com os camundongos do tipo selvagem, indicando coordenação motora prejudicada (Figura 3A). No entanto, em termos de resultados dentro do grupo, os camundongos Mf-1 / FVB melhoraram significativamente seu desempenho do Dia 1 ao Dia 3, sugerindo a preservação da aprendizagem motora (
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Nosso desenho baseou-se no estudo anterior de Metz e Whishaw, que relataram a utilidade do "teste de caminhada com degraus em escada"13,14. Eles projetaram o teste de caminhada em escada para avaliar a caminhada habilidosa e medir a colocação, pisada e coordenação entre membros dos membros anteriores e posteriores, exigindo que os animais caminhassem de um ponto de partida a uma meta em uma escada horizontal13,1...
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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI (concessão nº 18H03379 para N.K., 21K15340 para I.A. e 22J11280 para A.N.).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sopro de ar | DAISO | ||
| Varetas de alumínio | CAINZ | 2 mm de diâmetro, o número de varas pode variar dependendo do design da escada. Aproximadamente 30 varas podem ser necessárias para construir a escada horizontal (intervalo de 4 cm). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 partes cada | |
| Parafusos | CAINZ |
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