O protocolo aqui apresentado permite a identificação e análise de alta dimensão de células-tronco musculares e progenitoras por citometria de massa de célula única e sua purificação por FACS para estudos aprofundados de sua função. Essa abordagem pode ser aplicada para estudar a dinâmica de regeneração em modelos de doenças e testar a eficácia de intervenções farmacológicas.
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Artigo de método
Identificação e análise de progenitores miogênicos in vivo durante lesão muscular esquelética aguda por citometria de massa de célula única de alta dimensão
Neste artigo
Resumo
Resumo
A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico impulsionado por células-tronco musculares adultas e sua progênie. Principalmente quiescentes em um estado estacionário, as células-tronco musculares adultas são ativadas após a lesão muscular. Após a ativação, eles proliferam e a maior parte de sua progênie se diferencia para gerar células musculares competentes para fusão, enquanto o restante se auto-renova para reabastecer o pool de células-tronco. Embora a identidade das células-tronco musculares tenha sido definida há mais de uma década, com base na co-expressão de marcadores de superfície celular, os progenitores miogênicos foram identificados apenas recentemente usando abordagens unicelulares de alta dimensão. Aqui, apresentamos um método de citometria de massa de célula única (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para analisar células-tronco e células progenitoras na lesão muscular aguda para resolver a dinâmica celular e molecular que se desdobra durante a regeneração muscular. Essa abordagem é baseada na detecção simultânea de novos marcadores de superfície celular e fatores-chave de transcrição miogênica cuja expressão dinâmica permite a identificação de células-tronco ativadas e populações de células progenitoras que representam marcos da miogênese. É importante ressaltar que uma estratégia de classificação baseada na detecção dos marcadores de superfície celular CD9 e CD104 é descrita, permitindo o isolamento prospectivo de células-tronco musculares e células progenitoras usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para estudos aprofundados de sua função. As células progenitoras musculares fornecem um elo perdido crítico para estudar o controle do destino das células-tronco musculares, identificar novos alvos terapêuticos para doenças musculares e desenvolver aplicações de terapia celular para medicina regenerativa. A abordagem apresentada aqui pode ser aplicada para estudar células-tronco musculares e progenitoras in vivo em resposta a perturbações, como intervenções farmacológicas direcionadas a vias de sinalização específicas. Também pode ser usado para investigar a dinâmica das células-tronco musculares e progenitoras em modelos animais de doenças musculares, avançando nossa compreensão das doenças com células-tronco e acelerando o desenvolvimento de terapias.
Introdução
O músculo esquelético constitui o maior tecido em massa do corpo e regula múltiplas funções, da visão à respiração, da postura ao movimento, bem como o metabolismo1. Portanto, manter a integridade e a função do músculo esquelético é fundamental para a saúde. O tecido muscular esquelético, que consiste em feixes compactados de miofibras multinucleadas cercadas por uma complexa rede de nervos e vasos sanguíneos, exibe notável potencial regenerativo 1,2.
Os principais impulsionadores da regeneração do músculo esquelético são as ....
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Protocolo
Os procedimentos em animais foram aprovados pela inspeção dinamarquesa de experimentos com animais (protocolo # 2022-15-0201-01293) e os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Aarhus. A analgesia (buprenorfina) é fornecida na água potável 24 horas antes da lesão para que os camundongos se adaptem ao sabor. O fornecimento de buprenorfina na água potável é continuado por 24 horas após a lesão. Juntamente com uma injeção subcutânea (s.c.) de buprenorfina no momento da lesão muscular aguda, a buprenorfina na água potável após a injeção de notexina aliviará a dor associada à lesão. Embora seja recomendado administr....
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Resultados
Aqui, apresentamos uma visão geral da configuração experimental para usar essa abordagem combinada, que inclui (i) análise CyTOF de alta dimensão de um curso de tempo de lesão aguda por injeção de notexina para estudar a dinâmica celular e molecular de células-tronco e progenitoras no músculo esquelético (Figura 1, esquema superior); e (ii) FACS de células-tronco e progenitoras usando dois marcadores de superfície celular, CD9 e CD104, para isolar essas populações e realizar estudos aprofund.......
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Discussão
A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico que depende da função das células-tronco adultas. Embora estudos anteriores tenham se concentrado no papel das células-tronco musculares durante a regeneração, sua progênie in vivo foi pouco estudada, principalmente devido à falta de ferramentas para identificar e isolar essas populações de células 15,16,17,18.
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do FACS Core Facility no Departamento de Biomedicina da Universidade de Aarhus pelo apoio técnico. Agradecemos a Alexander Schmitz, gerente da Unidade de Citometria de Massa do Departamento de Biomedicina, pela discussão e apoio. Ilustrações científicas foram criadas usando Biorender.com. Este trabalho foi financiado por uma bolsa inicial da Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) e uma bolsa do pacote inicial (0071113) da Fundação Novo Nordisk para a EP
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Agulha de 20 G | KDM | KD-900123 | |
| fina 28 G, seringa de insulina de 0,5 mL | BD | 329461 | |
| 29 G, seringa de insulina de 0,3 mL Seringas | BD | 324702 | |
| seringas de 3 mL | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µ filtros de células m | Fisher Scientific | 11587522 | |
| tubos de polipropileno de 5 mL | Fisher Scientific | 352002 | |
| tubos de ensaio de poliestireno de 5 mL com 35 µ filtro de células | m Falcon | 352235 | |
| seringas de 5 mL | Terumo medical | SS05LE1 | |
| tubo de centrífuga de 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-desoxiuridina (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0,5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0,2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Estoque = 0,2 mg/mL |
| anti-alfa; 7 integrina PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrumento | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561 e 633 nm laser |
| Albumina de soro bovino | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorfina 0,3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; |
| CD106/VCAM-1 conjugado internamente (Clone: 429 MVCAM. a) | Biolegend | 105701 | Er170; |
| CD11b conjugado interno (Clone: M1 / 70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; |
| CD29/Integrina conjugada interna β 1 (clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; |
| CD31 conjugado interno (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; |
| CD34 conjugado interno (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; |
| CD44 conjugado interno (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; |
| CD45 conjugado interno (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; CD9 conjugado interno |
| (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; |
| CD90.2/Thy1.2 conjugado interno (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; |
| CD98 conjugado interno (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; |
| Solução de aquisição de células conjugada internamente / Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | intercalador de ácido nucleico catiônico |
| Cisplatina | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatina (dicloreto de cis-Diammineplatina (II)) | Merck | P4394 | |
| Clear 1,5 mL tubo | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Colagenase, Tipo II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Câmara de contagem | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4 / SDF1 (Clone: 2B11 / CXCR4) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; DAPI conjugado interno |
| (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Tubo escuro de 1,5 mL | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Tesoura de Dissecção | Ferramentas de Ciências Finas | 14568-09 | |
| DMEM (baixa glicose, com piruvato) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Quatro Elementos de Calibração (EQ) | Padrão Biotools | 201078 | Calibração de Esferas Soro |
| Fetal Bovino, qualificado, origem brasileira | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Pinça Dumont #5SF | Fine Ferramentas Científicas | 11252-00 | |
| Fórceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Soro de cabra | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Sistema Helios CyTOF | Standard Biotools | N/A | |
| Soro de cavalo, inativado por calor, origem neozelandesa | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurano/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Metanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; MyoD conjugado interno |
| (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; MyoG conjugado interno |
| (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; Tampa de |
| Garrafa Descartável Estéril de Fluxo Rápido Nalgene conjugada internamente 0.20 μ Filtros PES M | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Ressuspende para 50 µ g/ml em PBS estéril. Manter estoques (por exemplo, 50 µ l) a -20 ° C |
| Mistura de nutrientes F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; |
| Penicilina-Estreptomicina conjugada interna (10.000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Unidades de Filtro PES 0.20 μ Filtro | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES | Fisher Scientific | 15206869 | |
| placa de Petri | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grau | MP Biomedicals | 219998320 | |
| cloreto de potássio (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Fosfato de potássio, monobásico, anidro (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Biotools padrão | 3166011A | Er166 |
| pS6 quinase (Clone: N7-548) | Biotools padrão | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; |
| Azida de sódio | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Fosfato de sódio, dibásico, heptahidratado (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Solução salina estéril 0,9% | Fresenius | B306414/02 | |
| &alfa; 7 integrina (Clone: 3C12) | MBL internacional | K0046-3 | Ho165; Conjugado internamente |
Referências
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462(2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A. Or....
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Reimpressões e permissões
