Artigo de método

Induzindo plasticidade de longo prazo da excitabilidade neuronal intrínseca em neurônios do núcleo geniculado lateral dorsal

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DOI:

10.3791/65950

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20 de setembro de 2024

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1Unité de Neurobiologie des canaux Ioniques et de la Synapse (UNIS), UMR1072, INSERM, Aix-Marseille University

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a plasticidade de longo prazo da excitabilidade intrínseca neuronal em neurônios de retransmissão do núcleo geniculado lateral dorsal mantido em fatias cerebrais ex vivo.

Resumo

O núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) há muito tempo atua como um retransmissor básico para informações visuais que viajam da retina para as áreas corticais, mas descobertas recentes sugerem uma plasticidade funcional amplamente subestimada das células principais do dLGN. No entanto, os mecanismos celulares que suportam essas mudanças não foram totalmente explorados. Aqui, relatamos um protocolo para induzir a potenciação de longo prazo da excitabilidade neuronal intrínseca (LTP-IE) em células de retransmissão dLGN dorsal de fatias cerebrais agudas de ratos jovens. A plasticidade intrínseca é geralmente induzida em paralelo com a plasticidade sináptica. No entanto, em neurônios dLGN, LTP-IE é induzido de forma confiável por atividade de pico a uma frequência de 40 Hz por 10 min. LTP-IE em neurônios de retransmissão dLGN é duradouro, pois pode ser acompanhado até 40 min após o protocolo de indução. Em conclusão, os resultados deste estudo fornecem a primeira evidência para a indução de plasticidade intrínseca em células de retransmissão dLGN, apontando ainda mais para o papel dos neurônios talâmicos na plasticidade visual dependente da atividade.

Introdução

O objetivo geral deste artigo de método é fornecer uma maneira simples de induzir plasticidade duradoura da excitabilidade neuronal em neurônios talâmicos visuais do rato in vitro, usando o modo de pinça de corrente padrão da técnica de patch clamp1,2. A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica é sua simplicidade e reprodutibilidade. A vantagem sobre técnicas alternativas, como estimulação de entradas sinápticas pareadas ou não com potenciais de ação pós-sinápticos entregues em um determinado tempo, é sua confiabilidade.

A plasticidade no sistema visual é tradicionalmente expressa exclusivamente no nível cortical, enquanto o núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN), uma estrutura receptora primária de entradas retinianas no nível talâmico, é tradicionalmente considerado apenas um retransmissor de informações visuais3. No entanto, essa conclusão inicial foi contestada por trabalhos recentes indicando que essa visão simplista não se sustenta mais4,5,6. Por exemplo, déficits funcionais na resposta visual já são observados em pacientes amblíopes no estágio da classe LGN7. Além disso, uma grande proporção de neurônios de retransmissão dLGN em um determinado território monocular recebe entradas de cada olho, indicando binocularidade potencial para uma grande proporção de neurônios dLGN8,9,10. Além disso, a privação monocular produz uma mudança significativa na dominância ocular em neurônios dLGN5,11,12.

Dentre os mecanismos de plasticidade funcional que podem ocorrer na mudança de dominância ocular, a plasticidade da excitabilidade neuronal intrínseca é uma candidata potencial. De fato, muitas regiões do cérebro, incluindo áreas visuais, expressam plasticidade intrínseca após várias tarefas comportamentais13,14. Foi relatada plasticidade intrínseca de longo prazo em neurônios centrais após estimulação de entradas aferentes de glutamato15,16,17,18, atividade de pico19,20, estimulação sensorial21 ou após atividade ou privação sensorial20,22,23. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a indução de potenciação de longo prazo da excitabilidade intrínseca (LTP-IE) em neurônios de relé dLGN após atividade de pico a uma frequência de 40 Hz. A frequência de disparo de 40 Hz corresponde a uma frequência observada na maioria dos neurônios dLGN in vivo após estimulação visual24,25.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes europeias e institucionais (Diretiva 86/609/CEE do Conselho e Conselho Nacional de Pesquisa da França e aprovados pela autoridade sanitária local (Serviços Veterinários, Préfecture des Bouches-du-Rhône, Marselha)).

1. Animais

  1. Realizar experimentos usando ratos Long Evans de 19 a 25 dias de idade de ambos os sexos (pesando entre 50 e 90 g).
  2. Alojar os animais em gaiolas de plástico convencionais, junto com sua mãe e seu irmão de ninhada. Mantenha a temperatura constante com um ciclo claro/escuro de 12 h e acesso ad libitum à água e alimentos.

2. Fatias agudas de dLGN de rato

  1. Prepare soluções de corte/recuperação e gravação extracelular.
    1. Para preparar a solução de corte/recuperação, misture 92 mM de n-metil-D-glutamina, 30 mM de NaHCO3, 25 mM de D-glicose, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl, 0,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de NaH2PO4, 20 mM de Hepes, 5 mM de ascorbato de sódio e 3 mM de piruvato de sódio e borbulhou com 95% de O2-5% CO2 (pH 7,4). Mantenha a solução de corte fria durante o procedimento de fatiamento.
    2. Prepare a solução de registro (líquido cefalorraquidiano artificial, ACSF) misturando 125 mM de NaCl, 26 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 2,5 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 0,8 mM de NaH2PO4 e 10 mM de D-glicose e equilibre-a permanentemente com 95% de O2-5% de CO2.
  2. Prepare as ferramentas de dissecação e duas plataformas de gelo (Figura 1A).
  3. Coloque gelo no tanque externo e encha a câmara de corte do vibratomo com uma solução de corte gelada (Figura 1B).
  4. Anestesiar profundamente ratos jovens de Long Evans (idade: P19-P25) com isoflurano (5%). Depois de confirmar que o animal está profundamente anestesiado (beliscando firmemente o pé sem resposta), eutanasiar o animal por decapitação com tesoura ou guilhotina (dependendo da idade/tamanho do animal) ao nível da medula. Colocar a cabeça na primeira plataforma gelada e regar o tecido isolado a cada 10 s com a solução oxigenada de corte gelado.
    NOTA: Os procedimentos de anestesia e eutanásia devem ser realizados em uma sala separada do biotério.
  5. Corte o couro cabeludo na direção caudal e, usando uma tesoura pequena, corte o crânio bilateralmente. Usando uma pinça romba, abra o crânio e extraia rapidamente o cérebro do crânio com uma espátula e coloque-o na segunda plataforma de gelo.
    NOTA: O tempo não deve exceder 2 minutos desde a decapitação até a extração do cérebro.
  6. Faça 2 cortes no plano frontal do cérebro em todo o cérebro; o primeiro para remover a parte anterior do córtex e os bulbos olfatórios (ver Figura 1C) e o segundo ao nível do colículo inferior para remover a parte posterior do córtex e o cerebelo.
  7. Cole o bloco cerebral na placa do vibratomo com o lado rostral voltado para cima (consulte Figura 1D,E). Regue o cérebro regularmente (a cada 10 s) durante todo o procedimento até que esteja submerso na câmara de corte do vibratome.
  8. Faça fatias finas de 350 μm contendo o dLGN com o vibratomo (Figura 1G). Remova o córtex e o hipocampo do mesencéfalo com um lápis, puxando suavemente essas estruturas.
  9. Aspire as fatias com uma pipeta Pasteur quebrada conectada a uma ventosa de borracha flexível (Figura 1H).
  10. Deixe as fatias se recuperarem por 20-30 min na solução de recuperação (Figura 1I).

3. Eletrofisiologia de patch-clamp de células inteiras

NOTA: Para gravações de patch-clamp de células inteiras de neurônios de retransmissão dLGN, use um patch-clamp específico amplifier.

  1. Ligue as bombas do equipamento para fazer a solução salina de gravação extracelular (ver composição na etapa 2.1) circulando na câmara de gravação.
  2. Prepare a solução intracelular misturando 120 mM de K-gluconato, 20 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,5 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2, 2 mM de Na2 ATP e 0,3 mMde NaGTP (pH 7,4).
    NOTA: A solução intracelular pode ser preparada com antecedência e mantida congelada a -80°C. Quando descongelada, a solução é mantida a 4 °C.
  3. Adicione o bloqueador do canalGABA A, picrotoxina (concentração final de 100 μM) e o antagonista do receptor ionotrópico de glutamato, quinurenato (2 mM, concentração final), à solução salina extracelular.
  4. Transfira a fatia para uma câmara submersa montada em um microscópio vertical. A câmara é controlada por temperatura a 30 °C e continuamente perfundida com aCSF equilibrado.
  5. Coloque o fio de platina em forma de U na fatia e posicione a fatia para visualizar o dLGN (Figura 2A).
  6. Prepare pipetas de remendo a partir de tubos de vidro borossilicato puxados com um extrator. Certifique-se de que as pipetas de adesivo tenham uma resistência de 5-10 MΩ quando preenchidas com a solução intracelular.
  7. Visualize o dLGN em alta ampliação (40x ou 60x) e selecione um neurônio para gravação de patch-clamp usando videomicroscopia infravermelha de contraste de interferência diferencial (Figura 2B). Selecione os neurônios com base em sua aparência saudável (ou seja, ligeiramente inchados com contornos nítidos da membrana).
  8. Posicione a pipeta de remendo no neurônio selecionado com pressão positiva constante usando o micromanipulador.
    1. Coloque o amplificador no modo VC e injete um passo de tensão de 5 mV. Defina a tensão para -65 mV. Em seguida, libere a pressão positiva para obter uma vedação de alta resistência (correspondente à redução da corrente em resposta aos passos de tensão). Aspire ligeiramente através da pipeta para obter transientes claros.
    2. Coloque o amplificador no modo CC, equilibre a ponte para compensar a resistência de acesso e mantenha o neurônio em -65 mV.

4. Aquisição de dados

  1. Adquira sinais a 20 KHz para detectar melhor os potenciais de ação rápida. Defina o filtro passa-baixo para 10 kHz para voltage e sinais de corrente.
  2. Monitore a excitabilidade neuronal durante um período de controle de cerca de 10 minutos, injetando um pulso positivo de corrente (normalmente ~ 80-250 pA durante 500 ms) suficiente para provocar 3-5 potenciais de ação em condições de controle a uma frequência de 0,1 Hz.
  3. Monitore a resistência de entrada do neurônio durante todo o experimento com um breve pulso negativo de corrente (normalmente -20 pA durante 100 ms). Mantenha a amplitude do pulso de corrente constante antes e depois da indução de LTP-IE.

5. Indução de LTP-IE

  1. Após o período de controle, induza LTP-IE provocando trens de 15 picos evocados por 15 passos curtos (2-5 ms) de corrente despolarizante fornecida a 40 Hz por 10 min.
  2. Escolha a amplitude do pulso de corrente para eliciar um único potencial de ação a cada vez (ou seja, 15 potenciais de ação por trem).
    NOTA: Cada trem de 15 picos é eliciado a uma frequência de 0.1 Hz (ou seja, 60 trens e 900 picos).

6. Análise dos dados

NOTA: O procedimento de análise é o mesmo antes (condições de controle) e após a indução de LTP-IE.

  1. Para cada traço registado, calcular a resistência de entrada (Rin) a partir da resposta de tensão ao pequeno impulso de corrente negativa injectado antes do passo de ensaio da corrente (Rin =passo V/passo I). Se houver um aumento ou uma diminuição da resistência de entrada (mais de 10%) durante o período de controle, descarte o experimento.
  2. Selecione os traços registrados com base no potencial da membrana antes de qualquer injeção de corrente. Manter apenas os traços com um potencial de membrana em repouso de -67 a -63 mV.
  3. Quantifique LTP-IE durante um período de 10 min, 20 min após o início do período pós-indução, medindo o número de AP evocado por cada pulso de corrente e calculando a média de cada minuto usando uma rotina caseira em um software de análise de dados (consulte o Arquivo Suplementar 1 para a rotina Igor Pro). Detecte picos quando o sinal de tensão cruza 0 mV.
    NOTA: LTP-IE é expresso como o número de potenciais de ação eliciados pela injeção de pulso atual após o protocolo de indução em comparação com antes (%). A análise foi feita em -10-0 min para a linha de base e +20/+30 min para o teste.

Resultados

Neurônios do dLGN foram registrados na configuração de célula inteira, e a PTP-IE foi induzida por disparos de potenciais de ação em 40 Hz durante 10 min na presença de antagonistas dos receptores ionotrópicos de glutamato e GABA (Figura 3A). Um aumento de três vezes no número de potenciais de ação foi observado 20-30 min após a indução (Figura 3B), sem qualquer alteração na resistência de entrada, Rin (Figura 3C). Este protocolo induziu de forma confiável a PTP-IE em neurônios do dLGN (Figura 3D)26. Esses resultados demonstram como o protocolo descrito aqui é eficiente para induzir plasticidade duradoura da excitabilidade neuronal em neurônios do dLGN in vitro.

Preparação e seccionamento de tecidos para microscopia; configuração do micrótomo e corte em andamento; etapas do experimento.
Figura 1: Método para obtenção de cortes cerebrais contendo o dLGN. (A) Ferramentas necessárias para a extração do cérebro. (B) Micrótomo. (C) Corte do cérebro em planos frontais. (D) Colagem sobre a placa. (E) Posicionamento do cérebro na placa. (F) Cérebro colado na placa. (G) Seccionamento. (H) Retirada do corte. (J) Cortes na solução de recuperação. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Imagem microscópica do dLGN e vLGN de camundongo, com detalhe celular. Barras de escala: 150 µm, 10 µm.
Figura 2: Visão do corte contendo o dLGN e visualização dos neurônios ao microscópio. (A) Visão geral com a objetiva de 4x do corte contendo o dLGN e o vLGN, imobilizado na câmara de registro por um fio de náilon. (B) Visão com a objetiva de 40x dos neurônios do dLGN na região contralateral do dLGN, simbolizada pelo retângulo tracejado no painel A. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados de eletrofisiologia no dLGN mostrando alterações no PA; gráfico e análise de dados da resposta neuronal.
Figura 3: Indução de LTP-IE em um neurônio do dLGN. (A) Configuração do registro e estímulo de indução. O estímulo utilizado para a indução de LTP-IE consistiu em 15 pulsos de ~1 nA para elicitar um potencial de ação por cada pulso de corrente despolarizante. (B) Curso temporal de LTP-IE. Acima, traçados representativos antes (preto) e depois (vermelho) da indução de LTP-IE. Abaixo, curso temporal do número normalizado de potenciais de ação por pulso despolarizante em função do tempo. Observe o aumento no número de picos que não apresenta declínio ao longo de >40 min. (C) Estabilidade da resistência de entrada. Desvio do potencial induzido por um degrau negativo de corrente antes (preto) e depois (vermelho) da indução de LTP-IE. A resistência de entrada é medida em uma latência fixa (simbolizada por *). (D) Esquerda, dados agrupados de 8 neurônios do dLGN mostrando a reprodutibilidade de LTP-IE. Direita, dados agrupados de 8 neurônios do dLGN mostrando a ausência de alteração na Rin. O painel B é reutilizado com permissão de Duménieu et al.26. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Análise Igor LTP-IE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Relatamos aqui a indução de LTP-IE em neurônios dLGN mantidos vivos em fatias cerebrais agudas por estimulação do neurônio registrado para evocar potenciais de ação a uma frequência de 40 Hz por 10 min. Este protocolo é simples de implementar em qualquer laboratório de neurofisiologia, pois requer um número mínimo de equipamentos (fatiador, microscópio, 1 amplificador, 1 placa de aquisição e computador). No entanto, algumas etapas críticas devem ser respeitadas para coletar dados valiosos. O primeiro passo crítico dentro do protocolo é a qualidade do tecido cerebral. Uma fatia talâmica saudável contém muitos neurônios da superfície até o meio da fatia (~ 150 μm). Os neurônios saudáveis parecem ligeiramente inchados, enquanto os neurônios moribundos geralmente estão enrugados. A segunda etapa crítica é a estabilidade da gravação durante a linha de base. O número de potenciais de ação deve ser estável sem qualquer aumento ou diminuição. Além disso, a resistência de entrada testada com um breve pulso de corrente hiperpolarizante não deve apresentar nenhuma alteração maior que 10%. Finalmente, a corrente de retenção deve ser estável dentro de +/- 10 pA. Esse protocolo de indução foi usado pela primeira vez para induzir LTP-IE em neurônios corticais visuais19,20. Mostramos aqui que este protocolo também pode induzir potenciação intrínseca em neurônios de retransmissão talâmicos do sistema visual26. A indução de picos com injeção de corrente contínua deve imitar a estimulação de entrada retiniana que normalmente impulsiona os neurônios dLGN, pois a estimulação de uma única fibra retiniana geralmente evoca o potencial pós-sináptico excitatório (EPSP) que é capaz de desencadear um potencial de ação no neurônio dLGN27,28. Os mecanismos de expressão de LTP-IE em neurônios dLGN foram investigados na publicação original26 e revelaram que os canais de Kv1 são regulados negativamente após a indução de LTP-IE. Assim, a regulação negativa dos canais Kv1 é responsável tanto pela LTP-IE em interneurônios corticais de pico rápido16 e neurônios dLGN26 quanto pela plasticidade homeostática na região CA329,30. No entanto, a via de sinalização difere, pois a proteína quinase A (PKA) está envolvida nos neurônios dLGN, enquanto um papel importante para o mTOR foi sugerido em interneurônios de pico rápido.

O presente protocolo fornece resultados reprodutíveis nas condições experimentais aqui utilizadas: 3 mM de Ca2+, 2 mM de Mg2+, picrotoxina e quinurenato, estimulação de 10 min a 40 Hz em ratos de 19 a 25 dias26. De fato, em média, este protocolo permite um aumento de 2 vezes na excitabilidade. A magnitude da excitabilidade aumentada diminui com a duração da estimulação, frequência da estimulação ou idade do animal26. Antes da abertura dos olhos, nenhum LTP-IE pode ser observado. A frequência usada para induzir a plasticidade duradoura da excitabilidade neuronal intrínseca corresponde à banda gama de oscilações cerebrais conhecida por ser a frequência de ligação para a percepção sensorial31 e para promover a plasticidade no sistema visual32.

No entanto, se uma concentração mais baixa de cálcio foi usada (ou seja, 1,5 mM Ca2+), o protocolo provavelmente precisa ser revisado, pois foi demonstrado anteriormente para a plasticidade sináptica33. Nesse caso, a frequência de estimulação provavelmente precisará ser elevada para 60-80 Hz. Acredita-se que a incidência de bloqueadores do receptor GABA (picrotoxina da gabazina) usados no presente protocolo sobre a indução de LTP-IE seja limitada, pois os picos são evocados por injeção de corrente contínua. No entanto, na situação in vivo em que os potenciais de ação são evocados em neurônios dLGN por estimulação retiniana, a entrada GABAérgica recrutada34 provavelmente elevaria o limiar de pico. Assim, entradas retinianas mais fortes provavelmente seriam necessárias para desencadear LTP-IE em neurônios dLGN. No entanto, sistemas neuromoduladores ativos durante a excitação, como a orexina, podem reduzir o limiar35.

A indução de plasticidade intrínseca de longa duração nos neurônios de retransmissão dLGN pode ser alcançada por meio de privação visual, estimulação de entradas retinianas para evocar potenciais de ação ou diretamente por meio da indução de potenciais de ação por meio de injeção de corrente nos neurônios registrados26. Este último protocolo é de longe o método mais simples porque é rápido de implementar e fornece resultados equivalentes ao procedimento de simulação sináptica26.

Este protocolo demonstrou induzir LTP-IE em neurônios piramidais corticais visuais19 e em neurônios de retransmissão talâmicos26. Provavelmente também poderia ser usado para induzir plasticidade duradoura da excitabilidade neuronal em outros núcleos visuais subcorticais, incluindo o LGN ventral (vLGN) ou o colículo superior (SC).

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Apoiado pelo INSERM, CNRS (para DD), AMU (para MR), FRM (DVS20131228768 para DD e DEQ20180839583 para DD), NeuroSchool (programa "França 2030" via A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) e financiamento ANR (ANR-17-EURE-0029 para AW) e ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 para DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 para DD). Agradecemos à A Venture & K Milton pelo excelente cuidado com os animais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Micrótomo de lâmina vibratória automatizadaLeicaVT-1200Svibratome/fatiador
Tubo de vidro borossilicatoPhymepB-15086-10
Controlador Typ VLuigs& Controlador de temperatura NeumannTyp V
Software Igor softwarede análisewavemetrics
Videomicroscopia infravermelhaCâmera OlympusXM-10
KynurenateMerk/SigmaK3375Bloqueador de receptores AMPA/NMDA
Sistema de aquisição de dados de baixo ruídoAxônio - Dispositivos molecularesDigidata 1440Ainterface analógica/digital
MicromanipuladoresLuigs& NeumannLN Mini25
Multiclamp 200BAxon - Dispositivos molecularesN/AAmplificador de patch-clamp
Multiclamp 700BAxon - Dispositivos molecularesN/Ade patch-clamp
Extrator PC-100NarishigePC-100Extrator de micropipetas
PClamp10Axon - Dispositivos molecularesN/Asoftware
PicrotoxinaAbCamab120315Bloqueador de receptores GABAA
Slice mini câmara Luigs& NeumannLN Chambre Slice mini I-IIMicroscópio vertical de câmara submersa
OlympusBX51 WI
amplificador de gravação de patch-clamp

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Induzindo plasticidade de longo prazo da excitabilidade neuronal intrínseca em neurônios do núcleo geniculado lateral dorsal
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