Análise Qualitativa e Quantitativa da Produção de Siróforos de Pseudomonas aeruginosa

Resumo

Este protocolo fornece análises qualitativas e quantitativas de sideróforos totais, pioverdina e piocelina de Pseudomonas aeruginosa.

Resumo

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é conhecida por sua produção de diversos fatores de virulência para estabelecer infecções no hospedeiro. Um desses mecanismos é a extração de ferro através da produção de sideróforos. P. aeruginosa produz dois sideróforos diferentes: a pioquelina, que tem menor afinidade quelante ao ferro, e a pioverdina, que tem maior afinidade quelante ao ferro. Este relato demonstra que a pioverdina pode ser quantificada diretamente a partir de sobrenadantes bacterianos, enquanto a pioquelina precisa ser extraída de sobrenadantes antes da quantificação.

O principal método para analisar qualitativamente a produção de sideróforos é o ensaio em placa de ágar Chrome Azurol Sulfonate (CAS). Neste ensaio, a liberação do corante CAS do complexo Fe³⁺-Dye leva a uma mudança de cor de azul para laranja, indicando a produção de sideróforo. Para a quantificação dos sideróforos totais, os sobrenadantes bacterianos foram misturados em proporções iguais com o corante CAS em placa de microtitulação, seguido de análise espectrofotométrica a 630 nm. A pioverdina foi quantificada diretamente a partir do sobrenadante bacteriano, misturando-a em proporções iguais com Tris-HCl 50 mM, seguida de análise espectrofotométrica. Um pico a 380 nm confirmou a presença de pioverdina. Quanto à pioquelina, a quantificação direta do sobrenadante bacteriano não foi possível, por isso teve que ser extraída primeiro. Análises espectrofotométricas subsequentes revelaram a presença de pioquelina, com pico em 313 nm.

Introdução

Os organismos necessitam de ferro para desempenhar várias funções vitais, como o transporte de elétrons e a replicação do DNA¹. Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista Gram-negativo, é conhecida por possuir uma variedade de fatores de virulência para estabelecer infecção no hospedeiro, entre os quais um mecanismo é a formação de sideróforos². Durante as condições de esgotamento do ferro, a P. aeruginosa libera moléculas especializadas chamadas sideróforos, que extinguem o ferro do ambiente circundante. Os sideróforos quelatam o ferro extracelularmente, e o complexo férrico-sideróforo resultante é ativamente transportado de volta para a célula³.

P. aeruginosa é conhecida por produzir dois sideróforos, pioverdina e piochelina. Sabe-se que a pioverdina tem maior afinidade quelante de ferro (1:1), enquanto a pioquelina é conhecida por ter menor afinidade quelante de ferro (2:1)⁴. A pioquelina também é chamada de sideróforo secundário por apresentar menor afinidade quelante ao ferro⁵. A produção e regulação de sideróforos são ativamente controladas por sistemas Quorum Sensing (QS) em P. aeruginosa⁶.

Além da têmpera do ferro, os sideróforos também estão envolvidos na regulação dos fatores de virulência e desempenham um papel ativo na formação do biofilme⁷. Os sideróforos desempenham funções cruciais adicionais, incluindo envolvimento na sinalização celular, defesa contra o estresse oxidativo e facilitação de interações entre comunidades microbianas⁸. Os sideróforos são tipicamente categorizados com base nos grupos funcionais específicos através dos quais eles quelatam ferro. Os três ligantes bidentados primários nesta classificação são catecolato, hidroxamato e α-hidroxicarboxilato³. Pioverdinas são características de espécies fluorescentes de Pseudomonas, como P. aeruginosa e P. fluorescens⁵. Eles consistem de um cromóforo fluorescente verde misto acoplado a um oligopeptídeo contendo 6-12 aminoácidos. Várias sintetases peptídicas não ribossomais (NRPs) estão envolvidas em sua síntese⁹. Quatro genes envolvidos na produção e regulação da pioverdina são pvdL, pvdI, pvdJ e pvdD¹⁰. A pioverdina também é responsável pela infecção e virulência em mamíferos¹¹. Observa-se que a P. aeruginosa produz pioquelina em condições moderadas limitantes de ferro, enquanto a pioverdina é produzida durante ambientes limitantes severos de ferro¹². Dois operons envolvidos na produção de pioquelina são pchDCBA e pchEFGHI¹³. Nota-se que, na presença de piocianina, a pioquelina (catecolato) induz dano oxidativo e inflamação e gera radicais hidroxila, que são prejudiciais aos tecidos do hospedeiro¹¹.

O ensaio Chrome Azurol Sulfonate (CAS) é amplamente adotado devido à sua abrangência, alta sensibilidade e maior conveniência em comparação com ensaios microbiológicos, que, embora sensíveis, podem ser excessivamente específicos¹⁴. O ensaio CAS pode ser realizado em superfícies de ágar ou em solução. Ele depende da mudança de cor que ocorre quando o íon férrico faz a transição de seu intenso complexo azul para laranja. O ensaio colorimétrico CAS quantifica a depleção de ferro de um complexo ternário Fe-CAS-surfactante. Este complexo particular, consistindo de metal, corante orgânico e surfactante, tem uma cor azul e exibe um pico de absorção em 630 nm.

Este trabalho apresenta um método para a detecção qualitativa da produção de sideróforos, onde se pode detectar a produção de sideróforos em uma placa de ágar. Um método para a estimativa quantitativa da produção total de sideróforos em uma placa de microtitulação e a detecção e análise quantitativa de dois sideróforos, pioverdina e piochelina, de P. aeruginosa, também é fornecido.

Protocolo

Todos os isolados bacterianos de P. aeruginosa foram obtidos de laboratórios de microbiologia médica de Vadodara e Jaipur, Índia. Todos os isolados clínicos selecionados foram manuseados em Gabinete de Biossegurança (BSL2) e o máximo cuidado foi tomado ao manusear isolados bacterianos durante os experimentos. Os detalhes comerciais de todos os reagentes/soluções são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação do corante Cromo Azurol Sulfonato (CAS) e meio ágar

1. Preparar corante CAS (100 mL) com a seguinte composição:
   1. Dissolver 60 mg de CAS em 50 ml de água destilada (Solução 1).
   2. Dissolver 2,7 mg de FeCl₃·6H₂O em 10 ml de HCl 10 mM (Solução 2).
   3. Dissolver 73 mg de brometo de cetrimônio (HDTMA) em 40 mL de água destilada (Solução 3).
   4. Misture cuidadosamente a Solução 1, a Solução 2 e a Solução 3. Guarde-o em uma garrafa de vidro.
2. Prepare o ágar CAS seguindo os passos abaixo:
   1. Adicionar 100 ml de solução salina MM9 a 750 ml de água destilada.
   2. Dissolver 32,24 g de ácido livre de piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanossulfônico) (PIPES).
   3. Adicione 15 g de ágar ágar. Autoclave e deixe esfriar.
   4. Adicionar 30 ml de solução estéril de Casamino ácido e 10 ml de solução estéril de glicose a 20% à mistura.
   5. Adicione 100 mL de corante CAS, misture e despeje em condições assépticas.
      NOTA: A preparação do meio MM9, da solução de Casamino e da 8-hidroxiquinolina é fornecida no ficheiro suplementar 1. O buffer PIPES é sensível ao pH. Ele não se dissolverá até que o pH 5,6 seja alcançado. Certifique-se de que o pH seja constantemente monitorado, pois quando o PIPES começar a se dissolver na água, ele diminuirá ainda mais o pH. Extrair Casamino ácido com o mesmo volume de 3% 8-hidroxiquinolina dissolvida em clorofórmio. Deixar a solução imiscível a 4 °C durante cerca de 20 minutos e recolher cuidadosamente a fase superior da solução sem perturbar a fase inferior.

2. Análise qualitativa da produção de sideróforos

1. Definir o OD₆₀₀ nm para 0,2 para culturas cultivadas em 24 h de P. aeruginosa.
2. Usando uma alça de arame estéril, listre a cultura bacteriana em uma placa de ágar CAS.
3. Incubar a 30 °C durante 24 h.
   NOTA: Meio de água peptonada ou soro fisiológico 0,8% pode ser usado para diluir a cultura bacteriana. Se nenhum crescimento bacteriano for observado em 24 h, incubar as placas de CAS por 48 a 72 h.

3. Estimativa quantitativa do total de sideróforos

1. Re-inocular culturas de P. aeruginosa cultivadas em 24 h em meio aquoso de peptona após ajuste de OD₆₀₀ nm para 0,25 e incubar a 30 °C por 48 h.
2. Após 48 h, centrifugar a cultura bacteriana a 4650 x g por 10 min à temperatura ambiente.
3. Após a centrifugação, adicionar 100 μL de sobrenadante livre de células a uma placa de microtitulação de 96 poços e adicionar 100 μL de corante CAS a ela.
4. Cubra a placa com papel alumínio e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos.
5. Após a incubação, realizar leituras espectrofotométricas a 630 nm.
6. Calcular os resultados obtidos para a quantificação do total de sideróforos como Unidade Percentual de Siróforo (PSU).
   NOTA: A PSU pode ser calculada como: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   onde, A_r = absorbância da referência a 630 nm, A_s = absorbância do sobrenadante livre de células da amostra. Para referência, o corante CAS deve ser adicionado a meios de água peptonados não inoculados. Encha todos os utensílios de vidro, tais como tubos de ensaio, frascos, etc., com HCl 6 M durante 2 h e lave-os duas vezes com água destilada para remover qualquer vestígio de ferro sobre eles.

4. Estimativa quantitativa da pioverdina

1. Re-inocular culturas de P. aeruginosa cultivadas em 24 h em meio aquoso de peptona após ajuste de OD₆₀₀ nm para 0,25 e incubar a 30 °C por 48 h.
2. Após 48 h, medir o OD₆₀₀ nm do crescimento bacteriano antes de prosseguir.
3. Centrifugar a cultura bacteriana a 4650 x g por 10 min à temperatura ambiente.
4. Após a centrifugação, adicionar 100 μL de sobrenadante livre de células a uma placa de microtitulação de 96 poços e adicionar 100 μL de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a ela.
5. Faça leituras espectrofotométricas a OD₄₀₅ nm.

5. Extração de pioquelina e espectrofotometria

1. Re-inocular culturas de P. aeruginosa cultivadas em 24 h em meio King's B (Arquivo Suplementar 1) após ajuste de OD₆₀₀ nm para 0,25 e incubar a 30 °C por 24 h.
2. Após 24 h, tomar 100 mL de cultura e centrifugar a 4650 x g por 10 min à temperatura ambiente.
3. Após centrifugação, adicionar 5 mL de ácido cítrico 1 M ao sobrenadante. Extrair duas vezes com 50 mL de acetato de etila.
4. Filtrar a fase orgânica com sulfato de magnésio através de um filtro de seringa. Conservar a fase orgânica filtrada a -20 °C.
5. Fazer leituras espectrofotométricas a 320 nm.
   NOTA: Como a pioquelina é um composto altamente instável à temperatura ambiente, execute o processo de extração no gelo. Use uma seringa estéril de 50 mL para separação do filtro. Coloque o algodão na ponta da seringa e adicione 1 g de sulfato de magnésio. Fixe um filtro de seringa estéril na ponta da seringa e colete o filtrado em um tubo estéril.

Resultados

Antes da quantificação dos sideróforos dos isolados clínicos, foi realizada uma triagem qualitativa para a produção de sideróforos para garantir a produção de sideróforos. A detecção qualitativa de sideróforos de isolados clínicos foi observada por bactérias em placas de ágar CAS. Três isolados clínicos, MR1, TL7, J3, juntamente com PAO1 (a cepa de referência), foram selecionados para o estudo. Todos os três isolados clínicos e PAO1 apresentaram resultados positivos para a produção de sid...

Discussão

Este protocolo permite aos pesquisadores quantificar sideróforos totais e dois sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina e piochelina, a partir do sobrenadante livre de células bacterianas. No ensaio de placas de ágar CAS, o corante CAS e os íons Fe³⁺ formam um complexo. Quando as bactérias produzem sideróforos, elas extinguem íons Fe³⁺ do complexo CAS-Fe³⁺, levando a uma mudança de cor em torno do crescimento bacteriano. Essa alteração resulta em halo alaranja...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar ágar, tipo I	HIMEDIA	GRM666
8-hidroxiquinolina	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Clorofórmio	Merck	1070242521
sulfonato de azurol de cromo	HIMEDIA	RM336-10G
Ácido cítrico	Merck	100241
Dextrose monohidratada	Merck	108342
Diclorometano	Merck	107020
Cloreto férrico hexahidratado	HIMEDIA	GRM6353
Frascos de vidro	Borosil	5100021
de ensaio de vidro	Borosil	9820U05
Ácido clorídrico	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Sais médios mínimos	HIMEDIA	G013-500G
Sulfato de Magnésio	Qualigens	10034
MultiskanGO Espectrofotômetro UV	Thermo Scientific	51119200
Peptona Tipo I, Bacteriológico	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES ácido livre	MP Biomedicals	190257
Potássio di-hidrogenofosfato	Merck	1048731000
Proteose peptona	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu Espectrofotômetro UV-Vis	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Cloreto de sódio	Qualigens	15915

tubos