Permitindo estudos de expressão de transgenes de alto rendimento usando manuseio automatizado de líquidos para protoplastos de folhas de milho estiolado

Summary

Este protocolo descreve a criação de um layout de transfecção aleatório usando um manipulador de líquido automatizado, um protocolo de isolamento de protoplastos para folha de milho estiolada e um procedimento de transfecção de 96 poços usando um manipulador de líquido.

Abstract

O campo da biotecnologia vegetal testemunhou avanços notáveis nos últimos anos, revolucionando a capacidade de manipular e projetar plantas para vários fins. No entanto, à medida que a pesquisa neste campo aumenta em diversidade e se torna cada vez mais sofisticada, a necessidade de soluções de triagem transitória precoces, eficientes, confiáveis e de alto rendimento para restringir as estratégias que prosseguem para uma transformação estável é mais aparente. Um método que ressurgiu nos últimos anos é a utilização de protoplastos vegetais, para os quais métodos de isolamento e transfecção estão disponíveis em várias espécies, tecidos e estágios de desenvolvimento. Este trabalho descreve um protocolo automatizado simples para a preparação aleatória de plasmídeo em uma placa de 96 poços, um método para o isolamento de protoplasto foliar de milho estiolado e um procedimento automatizado de transfecção. A adoção de soluções automatizadas em biotecnologia vegetal, exemplificada por esses novos protocolos de manuseio de líquidos para transfecção de protoplastos vegetais, representa um avanço significativo em relação aos métodos manuais. Ao alavancar a automação, os pesquisadores podem facilmente superar as limitações dos métodos tradicionais, aumentar a eficiência e acelerar o progresso científico.

Introduction

A transfecção de protoplastos vegetais, a introdução de material genético estranho em células vegetais desprovidas de paredes celulares, é uma técnica fundamental e, no último meio século, abrange inúmeras espécies em apoio à pesquisa em biotecnologia vegetal. No entanto, a utilização desses métodos pode ser dolorosa e limitada em escopo, mesmo com milhões de protoplastos produzidos por isolamento. Os métodos tradicionais de transfecção de protoplastos vegetais são frequentemente trabalhosos, demorados, propensos à variabilidade e tecnicamente exigentes, levando a sistemas de nicho com baixa reprodutibilidade¹. No entanto, o potencial introduzido pelas soluções automatizadas nos últimos anos ilumina a possibilidade de dar nova vida a essa técnica jovem de 60 anos ^2,3. Com o potencial de automatizar etapas cruciais, mas repetitivas, como preparação de materiais, incubação de polietilenoglicol (PEG) e subsequente distribuição de reagentes de transfecção, os pesquisadores podem reduzir significativamente os requisitos de manuseio físico e outras fontes potenciais de erro humano⁴. Além disso, o controle preciso e a uniformidade oferecidos pelos sistemas automatizados de manuseio de líquidos garantem resultados de transfecção consistentes e reprodutíveis.

Embora o isolamento do protoplasto seja um processo meticuloso que envolve corte, digestão, incubação, filtração e centrifugação, a parte de transfecção desses protocolos é feita sob medida para manipuladores automatizados de líquidos. O procedimento para a maioria dos protocolos de transfecção de protoplastos é mediado por PEG, e misturar o protoplasto isolado na presença de PEG e DNA de plasmídeo purificado por um período especificado em uma concentração precisa (dependendo da espécie e do tecido) permite que essas células absorvam o DNA do plasmídeo⁵. Essa transfecção é seguida por uma série de etapas de lavagem, culminando em uma incubação noturna⁶. Após o período de incubação, se tudo foi projetado e entregue adequadamente, o experimento resulta na expressão do componente de interesse e/ou no potencial de avaliação de diferentes componentes regulatórios⁷. Todas as etapas de aspiração, dispensação e agitação/mistura associadas a este procedimento normalmente seriam tratadas por uma pipeta manual. A execução manual de tal protocolo, uma reação individual de cada vez, é trabalhosa e introduz variações desnecessárias entre as amostras, ao mesmo tempo em que limita a capacidade que pode ser avaliada a qualquer momento. Protocolos automatizados para manipulação de células de mamíferos ou insetos e síntese química na indústria farmacêutica estão em prática há vários anos ^4,8,9. A utilização de protoplastos e protocolos envolvendo o manuseio automatizado de líquidos de materiais vegetais estão aumentando 10,11,12,13.

A adoção de protocolos automatizados de manuseio de líquidos para transfecção de protoplastos de plantas é uma grande promessa para aplicações de pesquisa. Os pesquisadores podem explorar bibliotecas genéticas maiores, rastrear funções genéticas específicas em um ritmo acelerado e investigar interações genéticas complexas relacionadas ao estresse das plantas de forma mais abrangente¹⁴. A escalabilidade de abordagens automatizadas utilizando cápsulas de 96 poços combinadas com triagem de fluorescência permite experimentação de alto rendimento e permite que os cientistas gerem rapidamente dados e insights que podem alimentar avanços na biotecnologia vegetal¹¹. No entanto, com esse aumento na taxa de transferência, levando à geração de centenas, senão milhares de pontos de dados, deve haver um controle de qualidade adicional que leve em conta quaisquer fontes de erro que possam confundir os resultados¹⁵. Um elemento que foi identificado como um fator contribuinte em várias disciplinas científicas é o efeito de borda. Algumas estratégias mitigadoras sugerirão a melhor placa para usar ou preencher o espaço entre poços ou os poços mais externos com água para combater esse fenômeno^16,17. No entanto, essas estratégias aumentam o tempo e, se um descartável específico não estiver disponível, a única opção é se contentar com menos ou adiar. Como alternativa, observar estratégias que levam em conta esse efeito por meio de um esquema de bloqueio não sacrifica a taxa de transferência ou o atraso na execução.

Este protocolo de protoplastos foliares de milho estiolado e seus dois métodos automatizados ilustrados na Figura 1 buscam abordar a variabilidade inerente aos experimentos de protoplastos automatizando várias porções do método canônico de protoplastos, a alocação de material de plasmídeo ao vaso usado para transfecção e a própria transfecção. Esses métodos são demonstrados para a plataforma de protoplastos foliares de milho estiolados, pois é uma plataforma de protoplastos bem caracterizada, simples e eficiente. Todas as etapas detalhadas são imediatamente acessíveis aos protocolos de transfecção de protoplastos, que utilizam soluções tampão semelhantes ou iguais. No entanto, atenção especial às características únicas do tecido e das espécies de origem de protoplastos deve ser considerada antes da adoção dessas técnicas. Essas melhorias por meio da automação simplificam a preparação de material para experimentos individuais e melhoram significativamente o rendimento, de uma a uma transfecção sequencial para 96 transfecções tratadas simultaneamente. Este trabalho também mostrará justificativa para a utilização de blocos incompletos casualizados para explicar o viés posicional da placa.

Protocol

1. Criação de placas de transfecção

1. Criação do layout do deck: Para criar um método de randomização de placas de DNA, abra o software de manipulação de líquidos. Clique no botão Novo método na barra de menus para criar um novo método. Adicione a linha de configuração do instrumento entre as linhas de início e término pressionando o botão Configuração do instrumento no painel esquerdo.
   NOTA: As capturas de tela relevantes que acompanham esse protocolo automatizado podem ser encontradas na Figura Suplementar 1, na Figura Suplementar 2 e na Figura Suplementar 3.
2. Clique na linha de configuração do instrumento , encontre o material de laboratório correto no menu de categorias do material de laboratório e arraste-o para o layout do deck, conforme mostrado na Figura 1 suplementar.
   NOTA: Se o material de laboratório não estiver definido anteriormente, ele precisará ser programado no manipulador de líquidos de acordo com a especificação do fabricante, mas essas instruções estão fora do escopo deste protocolo.
3. Configuração de transferência do arquivo: Pressione o botão Transferir do arquivo nas paletas de etapas e coloque a linha Transferir do arquivo abaixo da linha de configuração do instrumento. Certifique-se de que a seleção e a substituição da ponta sejam mostradas na Figura Suplementar 3.
4. Verifique se o arquivo tem uma linha de cabeçalho e verifique se as informações da coluna estão corretas.
5. Pressione a área de origem para ativá-la e clique na placa de origem no layout do deck, defina a placa de destino e insira a quantidade de DNA a ser pipetada.
6. Pressione o botão Personalizar para definir a técnica de pipetagem em detalhes, como toques de ponta na parede.
7. Especifique a quantidade de DNA plasmidial a ser transferida. Este protocolo usa 20 μL de DNA plasmidial de 1 μg/μL por transfecção (poço).
   NOTA: a quantidade de DNA de plasmídeo que é transferida para a placa de transfecção antes da transfecção do protoplasto dependerá da plataforma de protoplasto que está sendo usada.
8. Crie uma transferência do arquivo .csv documento.
   1. Este documento é composto por duas colunas. Prepare a primeira coluna, ou seja, a coluna De, que indica a localização do DNA do plasmídeo de estoque dentro do rack de tubos, ou seja, para a amostra 1; isso seria bem A01. Como essa transferência acontece três vezes (três repetições), três linhas devem indicar A01 na coluna De.
   2. Prepare a segunda coluna, ou seja, a coluna Para, usada para especificar o poço de destino da construção do plasmídeo da placa de 96 poços. Por exemplo, a amostra 1 (A01) pode ser B02, D04 e H07. Salve-o como um arquivo .csv para ser compatível com o software manipulador de líquidos.
9. Antes de executar o protocolo, verifique se as posições do convés estão carregadas, se o material de laboratório está definido corretamente, se o documento de randomização inclui a localização dos poços para todo o DNA da amostra no rack de tubos e se há amostra de plasmídeo suficiente nos tubos para executar o protocolo.
10. Expanda o menu Propriedades do arquivo da etapa Transferir do arquivo, selecione o arquivo .csv criado e execute o protocolo.
11. Cubra as placas de transfecção com um selo de papel alumínio quando o protocolo for concluído com sucesso. Armazene as placas de transfecção a -20 °C até que estejam prontas para uso. O protoplasto isolado da folha de milho estiolado será adicionado a esta placa de transfecção na etapa 3.3.

2. Isolamento de protoplastos de folha de milho estiolado

1. Para iniciar o isolamento do protoplasto foliar de milho estiolado, obtenha um fundo genético compatível com o protoplasto, como NP222, que foi usado aqui¹⁸. Preparar apenas 3 tampões, nomeadamente tampões MMg, W5 e WI, enumerados no quadro 1 antes do início da experiência e manter a 4 °C. Prepare a solução de digestão e o PEG no dia do experimento para obter melhores resultados.
2. Esterilize 25 sementes na superfície submergindo-as primeiro em uma solução de alvejante comercial a 25% e agitando-as em um agitador de plataforma rotativa por aproximadamente 15 a 20 min em temperatura ambiente.
3. Após agitação, enxágue bem as sementes com água estéril (DI). Repita a etapa de enxágue 5x. Beba as sementes em água estéril durante a noite em temperatura ambiente.
4. Semeie a semente em solo úmido e autoclavado no dia seguinte. Adicione pellets de argila seca para absorver o excesso de umidade do solo e evitar a contaminação por fungos.
5. Cultive as mudas de milho em uma câmara de crescimento leve de 16 h a 28 ° C (umidade relativa (UR) de 30%) por aproximadamente 3 dias até que o coleóptilo esteja 1-2 cm acima do solo e, em seguida, transfira para uma câmara escura com a mesma temperatura e UR por mais 5 a 7 dias.
6. Colha o primeiro tecido foliar verdadeiro cortando-o logo acima do primeiro colarinho.
7. Esterilize o tecido foliar brevemente em alvejante comercial a 25% e 250 μL de solução Tween 20 a 20% por 1 min. Enxágue bem o material da folha 5x com água DI.
8. Seque (suavemente) o tecido da folha do milho com tecidos sem fiapos e, usando uma lâmina afiada, remova ~ 1,5 cm da ponta e da base de cada lâmina foliar.
9. Corte o tecido foliar restante em tiras transversais estreitas (0,5 mm - 1 mm) e coloque em uma placa de Petri de 100 x 25 mm.
10. Filtre-esterilize 25 mL da solução de digestão através de um filtro de seringa de 0,22 μm diretamente na placa de Petri contendo o tecido fatiado.
11. Infiltre a vácuo o tecido foliar com solução de digestão aplicando vácuo por 30 min à temperatura ambiente em um dessecador a vácuo a aproximadamente -75 mbar de pressão.
    NOTA: A pressão de vácuo da casa para vários laboratórios acadêmicos e privados deve ser suficiente para esta etapa.
12. Colocar num agitador de plataforma rotativa e agitar a 25 °C no escuro a 60 RPM durante 2,5 a 3 h. Quando faltarem 10 minutos para o final do período de digestão, aumente a velocidade para 90 RPM.
13. Despeje a solução de digestão e qualquer material vegetal não digerido através de um funil em cima de um filtro de peneira de 40 μm em um tubo de 50 mL.
14. Centrifugue a solução dentro do tubo de 50 mL a 150 x g por 4 min para pellet o protoplasto. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 - 15 mL de solução tampão MMg.
15. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante. Ressuspenda em 5 - 10 mL de tampão MMg fresco.
16. Usando um hemocitômetro, meça cuidadosamente a densidade do protoplasto isolado. Ressuspenda para uma densidade aproximada de 5 x 10⁵ protoplastos por mL.
17. Deixe o isolado descansar no gelo por ~ 30 min antes da transfecção. Durante este tempo, prepare a solução PEG. Dissolva completamente o PEG em uma solução usando um banho-maria a 37 ° C e deixe-o lá até a transfecção.

3. Transfecção automatizada de protoplastos

NOTA: As etapas 3.6 a 3.15 são gerenciadas completamente pelo manipulador de líquidos automatizado, exceto pelas duas pausas do usuário nas etapas 3.10 e 3.13, que requerem centrifugação manual. Capturas de tela relevantes que acompanham esse protocolo automatizado podem ser encontradas no suplemento, Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4 e Figura Suplementar 5.

1. Prepare o layout do convés do manipulador de líquidos para transfecção de acordo com o método de transfecção de protoplastos descrito nas etapas a seguir. Monte os seguintes materiais: Placa de destino (neste caso, seria uma placa preta de 96 poços com uma microplaca de fundo transparente para medição de fluorescência), uma caixa de pontas de automação de diâmetro largo de 25 a 250 μL para a etapa de aspiração de PEG, cinco caixas de pontas de automação de pipeta de 25 a 250 μL para as etapas restantes de manuseio de líquidos, três calhas de plástico como reservatórios de reagentes, uma placa vazia de 96 poços para coleta de resíduos, soluções de lavagem de tampão de transfecção restantes, W5 e WI.
2. Imediatamente antes do início do procedimento de transfecção, esterilize por filtro a solução de PEG através de uma unidade de filtro a vácuo descartável estéril de 0,22 μm em um tubo novo de 50 mL.
3. A partir do protoplasto ressuspenso em tampão MMg, adicione 100 μL (aproximadamente 50.000 protoplastos) a cada poço da placa de transfecção pré-preparada e descongelada. Para fazer isso, despeje a solução tampão contendo protoplastos em uma calha estéril de 10 mL e use uma pipeta multicanal. Continue agitando suavemente a calha para evitar que o protoplasto se acumule fora da solução durante esta etapa de transferência manual.
4. Despeje a solução de PEG na calha apropriada e coloque a placa de transfecção, agora contendo protoplasto e DNA de plasmídeo contendo placa de transfecção, preparada usando a etapa 1, no local especificado de acordo com o layout do convés.
5. Para criar um método de transfecção de protoplasto, abra o software de manipulação de líquidos e execute as etapas descritas abaixo.
   1. Movendo material de laboratório entre decks: Substitua a caixa de ponta vazia no deck de carregamento de ponta por uma nova usando o comando Mover Material de Laboratório. Selecione os decks De e Para na visualização Configuração .
   2. Para volumes superiores a 200 μL: Não substitua as pontas entre as transferências. Carregue as pontas para a primeira etapa de transferência e descarregue após a última etapa de transferência, o que requer que as opções de Carga/Descarga sejam especificadas corretamente para cada etapa de transferência, como na Figura Suplementar 3.
6. Criação do layout do deck: Como o método de criação da placa de transfecção, para criar um método de transfecção automatizado de DNA, abra o software de manipulação de líquidos. Clique no botão Novo método na barra de menus para criar um novo método. Adicione a linha de configuração do instrumento entre as linhas inicial e final pressionando o botão Configuração do instrumento no painel esquerdo. Crie um layout de deck de acordo com o layout de deck mostrado na Figura Suplementar 1.
7. Mistura de células/DNA: Adicione uma etapa para misturar protoplastos e DNA antes da adição de PEG usando o botão Device Action e configurando o dispositivo (posicionador automatizado de material de laboratório ou ALP), velocidade de agitação (1500 rpm) e tempo de agitação (10 s).
8. Adição e mistura de PEG: Para iniciar a transfecção, adicione uma etapa de transferência para adicionar 110 μL de PEG do reservatório de PEG usando uma pipeta de 96 cápsulas. Certifique-se de que as posições corretas de origem e destino sejam programadas de acordo com o layout do deck especificado. Programe a etapa de transferência para aspirar PEG 1 mm do fundo do reservatório e depositar o PEG 3 mm da base da placa de 96 poços contendo a mistura protoplast/DNA. Adicione outra etapa de agitação após a adição de PEG, copiando e colando as etapas programadas anteriormente.
9. Incubação PEG: Adicione uma etapa de pausa selecionando o botão Pausar , selecione o agitador e insira o tempo de incubação pré-determinado, que começa com a adição de PEG.
   NOTA: O temporizador para a pausa continuará, a menos que haja interrupções ou interrupções na cortina de luz que resultem em uma mensagem de erro. Certifique-se de que, se a manipulação do deck for necessária, essas mensagens sejam apagadas antes de ir embora.
10. Adição/mistura de tampão W5: Adicione três linhas de transferência de 200 μL para transferir um total de 600 μL de tampão W5 para a placa de transfecção para extinguir a reação de incubação de PEG. Siga a adição de tampão W5 agitando e fazendo uma pausa do usuário para permitir a centrifugação da placa de transfecção.
11. Pausa do usuário 1: Centrifugue a placa de transfecção de protoplasto a 100 x g por 4 min. Retorne a placa de transfecção, agora com protoplasto peletizado, de volta à posição apropriada do convés. Adicione a pausa do usuário clicando no botão Pausar , exceto agora com a opção Pausar todo o sistema e exibir a mensagem selecionada.
    NOTA: O pop-up da mensagem de pausa precisa ser apagado antes que o manipulador de líquidos continue com o restante do protocolo.
12. Remoção do sobrenadante: Adicione duas linhas de transferência para remover 400 μL de sobrenadante e transfira para a placa de resíduos. Para evitar a aspiração celular durante a remoção do sobrenadante, defina a distância do fundo como 6 mm.
13. Adição/mistura de WI Adicione 3 linhas de transferência para transferir 580 μL de tampão WI para a placa de transfecção. Adicione outra etapa de agitação após a adição do WI, copiando e colando as etapas programadas anteriormente. Prossiga para a próxima pausa do usuário.
14. Pausa do usuário 2: Centrifugue a placa de transfecção de protoplasto a 100 x g por 4 min. Retorne a placa de transfecção, agora com protoplasto peletizado, de volta à posição apropriada do convés.
15. Remoção do sobrenadante: Adicione quatro linhas de transferência para remover 680 μL de sobrenadante e transfira para a placa de resíduos. Para evitar a aspiração celular durante a remoção do sobrenadante, defina a distância do fundo como 6 mm.
16. Transferência de protoplastos para microplacas: A transferência final deste protocolo é composta por duas etapas de transferência de 150 μL. Antes de cada etapa individual, aspire repetidamente os protoplastos a 50 μL / s a 2 mm do fundo da placa de transfecção e dispense a 3 mm. Em seguida, utilizando as mesmas pontas de pipeta, transfira para a microplaca de destino.
    NOTA: A aspiração e a distribuição do volume do tampão acima do pellet antes da transferência para a microplaca perturbará quaisquer protoplastos restantes peletizados no fundo da placa de transfecção para garantir que não haja perda de amostra. Como a randomização foi feita durante a criação da placa de transfecção, isso conclui o protocolo automatizado.
17. Incubar a microplaca à temperatura ambiente no escuro durante 24 a 48 h antes da primeira medição de fluorescência.

Results

Obter dados observacionais que comprovem que os efeitos extremos podem estar afetando as medições de resposta; Um estudo piloto foi realizado para confirmar essas suspeitas. Para este estudo, os métodos acima foram aplicados a três placas replicadas de 96 poços com apenas um único nível de tratamento; todos os protoplastos foram transfectados usando pSYN11250¹⁹, um plasmídeo que expressa constitutivamente ZsGreen, com o objetivo de mostrar que existem diferenças sistemáticas no nível de resposta para unidades na borda da placa em comparação com a segunda linha e regiões centrais da placa. Os 36 poços na borda externa da placa são definidos como bloco 1, os 28 poços na segunda linha da borda como bloco 2 e os 32 poços centrais como bloco 3 - consulte a Figura 2A no painel inferior direito. Esse arranjo pode acomodar 28 níveis de tratamento como um delineamento de blocos completos randomizados (RCBD) ou 32 níveis de tratamento como um delineamento de blocos incompletos randomizados (RIBD). Na Figura 2A, para cada réplica (representação), os pontos de dados brutos para cada poço foram normalizados pela média dessa respectiva placa. Em todas as três réplicas do experimento, as respostas na borda da placa são, em média, 1-1,5x maiores que o mínimo. A Figura 2B mostra as médias dos blocos como uma porcentagem da média geral da placa para cada replicação. A Tabela 2 mostra tabelas ANOVA unidirecionais do ajuste de um modelo linear com bloco como efeito fixo. Por razões relacionadas à randomização restrita envolvida em projetos de blocos, a inferência baseada em testes de hipóteses para o fator de bloqueio é considerada aproximada na melhor das hipóteses e inválida na pior. No entanto, ajustar um modelo com um fator de bloqueio fixo é útil para avaliar se um esquema de bloqueio é benéfico. Mn_Sq (bloco) representa o desvio quadrado médio das médias dos blocos sobre a média geral. Mn_Sq (Erro) representa o desvio quadrático médio das observações individuais sobre suas respectivas médias de grupo, neste caso, a média geral, uma vez que não há fator de tratamento no modelo. Quando Mn Sq (bloco) é maior que Mn Sq (Erro), ou seja, a razão F é maior que um, o tamanho do erro quadrático médio foi efetivamente reduzido em relação a um delineamento completamente casualizado (CRD), aumentando assim o poder estatístico para comparar os tratamentos de interesse e diminuindo a largura dos intervalos de confiança que estimam os contrastes dos tratamentos. A Figura 2B mostra razões F que excedem em muito um, e a resposta medida tende a diminuir à medida que se move em direção ao centro em todas as três placas replicadas. Em todas as três repetições, intervalos de confiança de 95% são observados no nível 0,05 para pelo menos um bloco que não cobre a média da placa observada. Por conseguinte, pode concluir-se que o sistema de bloqueio aumenta substancialmente a precisão destas estimativas. Além de ter menos precisão, a falha em levar em conta a variabilidade do incômodo espacial pode levar a resultados espúrios devido à possibilidade de confundir os efeitos do tratamento com o efeito de borda.

Embora haja uma longa história de protocolos de isolamento e transfecção de protoplastos de milho estiolado que remontam ao início da década de 1990, este protocolo introduz algumas modificações adicionais ao procedimento tradicional para facilitar melhor um isolamento de protoplastos a granel reprodutível para fins de transfecção de protoplastos de alto rendimento²⁰. As etapas de esterilização da superfície do tecido da semente e da folha antes da digestão reduzem a contaminação fúngica sem a necessidade de meios assépticos. A utilização do solo também ajudará a manter os custos baixos em relação ao uso de meios de crescimento especiais ou à compra de recipientes descartáveis estéreis de uso único. O protocolo em vários estágios pode ser dimensionado para acomodar vários níveis de taxa de transferência. Aproximadamente 2 g de tecido da primeira folha resultam em entre 5 x 10⁶ - 10 x 10^{6 protoplastos} . Como são necessários 5 x 10⁶ protoplastos por transfecção de placa de 96 poços, o protocolo de isolamento, como está escrito, pode acomodar 2 execuções do protocolo de transfecção. Este protocolo também utiliza MMg como solução de lavagem em vez da solução W5 canônica. Isso foi derivado originalmente de publicações para protoplastos radiculares de Arabidopsis como um meio de reduzir o número de soluções tampão usadas para qualquer etapa do procedimento de transfecção de protoplastos²¹. No entanto, também foi empregado para protoplastos de folhas de milho estiolado em 2022²². Uma melhoria adicional no isolamento e transfecção de qualquer protocolo de protoplastos seria a simplificação e redução das soluções tampão. Atualmente, esse protocolo alterna entre o tampão de digestão canônico, o tampão W5, o tampão MMg e o tampão WI. Simplificar as soluções seria muito benéfico para melhorar a reprodutibilidade dos experimentos com protoplastos e reduzir a variabilidade de pessoa para pessoa ou lote para lote entre os experimentos. Visivelmente, a última novidade do protocolo é a falta de remoção completa para soluções tampão após a transfecção de PEG. A razão pela qual a automação é possível é porque o protoplasto, milho estiolado mostrado aqui e outros que testamos, é que eles parecem tolerar a diluição como um meio de extinguir a reação, em vez da remoção completa das diferentes soluções tampão¹¹. A produção do repórter, conforme indicado por nosso controle de transfecção de GFP usado aqui, indica que o protoplasto pode tolerar até 5% de PEG sem impacto negativo na intensidade de fluorescência (Figura Suplementar 6). Esse valor é mais do que o dobro do que a concentração de PEG prevista seria após a conclusão do protocolo descrito aqui.

Figura 1: Esquema ilustrativo do procedimento de isolamento e transfecção de protoplastos. As etapas em que a automação foi introduzida são indicadas pelas linhas vermelhas tracejadas e pelas caixas azuis que as acompanham. Os números cercados por um círculo vermelho correspondem aos três métodos descritos. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Efeito de borda e o impacto da mitigação de layouts de replicação. (A) Mapas topográficos mostrando a mudança de dobra da intensidade de fluorescência para placas de 96 poços transfectadas com pSYN11250 em relação à média da placa para 3 experimentos de replicação independente (Rep). A média desses experimentos também é mostrada com o esquema de bloqueio, indicado pelas diferentes linhas pontilhadas de cores colocadas por cima. (B) Gráficos de faixa mostrando as médias dos blocos como uma porcentagem da média geral das placas para as placas replicadas 1, 2 e 3 da esquerda para a direita. Os círculos semitransparentes representam os pontos de dados brutos após a divisão pela média da placa. As barras de erro são intervalos de confiança de 95% no nível 0,05, com o traço central denotando a média. As cores marrom, dourado e cinza indicam a borda, a segunda linha e a parte interna da placa, respectivamente. A linha vermelha tracejada em 100% representa a média geral da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Buffer	Reagente
Digestão	1,5% de Celulose Rs
	0,3% de macroenzima
	0,6 M Manitol
	MES de 10 mM (ph 5,7)
	1 mM CaCl2
	0,1% (p/v) BSA
	0,5 nM β-mercaptoetanol ou 0,5 mM DTT
Mmg	0,6 M Manitol
	15 mM MgCl2
	MES de 4 mM, pH 5,7
W5	154 mM NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM KCl
	2 mM MES, pH 5,7
WI	0,6 M Manitol
	MES de 4 mM, pH 5,7
	4 mM KCl
GANCHO	30% PEG (w/v)
	0,6 M Manitol
	100 mM CaCl2

Tabela 1: Soluções tampão para isolamento e transfecção de protoplastos de milho estiolados.

Representante	Fonte	Df	Soma Quadrada	Mn Quadrado	Valor F	Pr (>F)
Replicar 1	Bloquear	2	0.26	0.13	10.64	<0,001
	Residual	93	1.135	0.012
Replicar 2	Bloquear	2	0.507	0.25	21.41	<0,001
	Residual	93	1.102	0.012
Replicar 3	Bloquear	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	Residual	93	1.861	0.02

Tabela 2: Tabela ANOVA unidirecional para as três réplicas do experimento de transfecção pSYN11250 de 96 poços. Para cada placa replicada: a coluna Fonte denota a fonte de variação, Df denota graus de liberdade, Soma Sq denota soma de quadrados, Mn Sq denota quadrados médios (Soma Sq/Df), valor F denota a razão entre Mn_Sq (bloco) e Mn_Sq (erro) e Pr(>F) denota o valor-p do teste F global.

Figura suplementar 1: Capturas de tela do painel do software. Categorias de seleção que dizem respeito à criação de um novo método, bem como os layouts de deck para protocolos de randomização e transfecção. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Principais etapas na configuração do protocolo de criação da placa de transfecção. Capturas de tela tiradas durante a criação do protocolo de criação de placas de transfecção. O número e o título de cada painel correspondem às etapas do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Capturas de tela para manipulação de material de laboratório e carregamento de ponta para a criação do protocolo de transfecção. Estes representam etapas que ocorrem várias vezes ao longo do protocolo, portanto, para evitar menções repetidas, etapas representativas são mostradas aqui. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Mistura célula-DNA através da pausa do usuário 1. Capturas de tela tiradas durante a criação do protocolo de transfecção. O número e o título de cada painel correspondem às etapas dentro do corpo do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: Remoção do sobrenadante após a pausa do usuário 1 por meio da transferência de amostras para microplaca. Capturas de tela tiradas durante a criação do protocolo de transfecção. O número e o título de cada painel correspondem às etapas dentro do corpo do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 6: Protoplasto de folha de milho estiolado transfectado ZsGreen tratado com diferentes concentrações de PEG no curso de tempo tampão WI. Gráfico de barras mostrando a intensidade relativa de fluorescência do protoplasto após o tratamento com PEG em 24, 48 e 72 h com medição por um leitor de microplacas. Barra de erro = SD, n = 4. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este manuscrito descreve um protocolo para automatizar a criação de placas de transfecção e o isolamento de protoplastos foliares de milho estiolado com uma transfecção automatizada. Para a conclusão bem-sucedida da parte de criação da placa de transfecção do protocolo, é necessário um robô automatizado de manuseio de líquidos equipado com um pod de 8 canais. Para o protocolo de transfecção, recomenda-se uma cápsula de 96 poços para transfecção completa e uniforme de placas de 96 poços. O método de transfecção pode ser concluído usando um pod de 8 canais, mas é preciso dar atenção especial à quantidade de tempo que as etapas de aspiração e dispensação levam, bem como o tempo que pode ser atribuído à troca de pontas entre as colunas. As diferenças na duração da incubação do PEG estão bem documentadas para ter um impacto significativo na eficiência e expressão da transfecção e, portanto, atenção especial a esses fatores contribuintes deve ser considerada para evitar disparidade no manuseio da amostra¹³. Antes de iniciar o protocolo de manipulação de líquidos, é importante considerar as etapas do protocolo e se certas atividades podem ser concluídas simultaneamente. Este protocolo utiliza um dispositivo que carrega pontas no pod de 96 poços a partir de 1 posição no convés. O manipulador de líquidos para este protocolo inclui uma função em que o robô troca caixas de gorjetas durante os períodos de incubação ou durante as etapas de pausa do usuário para evitar adicionar tempo adicional ao protocolo. Ao tomar a decisão de comprar um manipulador de líquidos, pense na funcionalidade e nas possíveis conveniências de economia de tempo.

Embora este protocolo tenha sido desenvolvido para utilizar dispositivos Beckman Coulter NXp e Biomek FX, este protocolo pode ser adaptado a qualquer dispositivo de manuseio de líquidos comparável. Todos os manipuladores de líquidos têm algum meio de denotar como transferir volumes de um local para outro e quanto. Para esse protocolo, esses dispositivos usavam um comando de linha Transferir do Arquivo. Se o material de laboratório estiver definido corretamente, um usuário pode transferir de ou para qualquer embarcação. Em circunstâncias excepcionais, como se racks ou adaptadores de tubos não estiverem disponíveis comercialmente, esses conectores podem ser usados para impressão 3D. Para protocolos típicos de transfecção de protoplastos, 20 μg de DNA a uma concentração de 1 μg / μL de transfecção é um volume padrão de material para várias plataformas de protoplastos¹³_. Durante a criação da placa de transfecção, como precaução adicional, use pontas de filtro de 0,2 a 20 μL para minimizar qualquer risco de contaminação devido ao plasmídeo aerossolizado durante a transferência. A remoção do componente humano da preparação reduz a variação ao longo do tempo e melhora a reprodutibilidade desses experimentos de alto rendimento. Além disso, as placas podem ser preparadas com bastante antecedência. Esta preparação aliviará o estresse do cientista de transfecção no dia do experimento. No entanto, é importante evitar armazenar essas placas de DNA plasmidial a 4 °C por longos períodos de tempo, pois as amostras podem evaporar. As amostras devem ser armazenadas em um freezer de -20 °C e podem ser descongeladas no refrigerador a 4 °C antes da transfecção. Uma vez que este protocolo de criação de placa de transfecção é programado, ele deve ser facilmente repetível, fornecendo um novo .csv de transferência do arquivo e ocupando os mesmos locais de convés para as amostras, material de laboratório e reagentes.

Para o procedimento de transfecção automatizado (etapa 3), um excedente de solução de PEG é preparado para garantir a aspiração igual do líquido viscoso da calha, normalmente um excesso de 40 mL para contabilizar o volume morto. Usar exatamente a quantidade necessária para a transfecção pode resultar em ar sendo puxado para dentro das pipetas e volumes desiguais de PEG sendo aspirados através da cabeça de 96 canais. Embora esta solução também possa ser preparada com antecedência, recomenda-se que seja preparada no dia da transfecção. A esterilização da solução de PEG pode ser feita usando um filtro de seringa, mas devido à viscosidade pode ser difícil. O uso de uma unidade de filtro a vácuo é mais rápido e pode aliviar qualquer frustração ou dor associada a essa atividade. Como a solução PEG, um excesso das outras soluções tampão de transfecção (W5, WI) também é fornecido para garantir uma pipetagem igual na cabeça de 96 canais. As soluções tampão (W5 e WI) podem ser preparadas com antecedência em massa para uso em futuras execuções de manipuladores de líquidos. Embora os reagentes não sejam caros, há uma boa quantidade de sacrifício da solução tampão. Com o aumento do número de corridas por dia, pode ser melhor usar alternativas ao reservatório que reduziriam o excesso descartado no final da corrida. Durante a execução do protocolo do manipulador de líquidos, W5 e WI podem ser adicionados aos seus respectivos vales antes do início do protocolo, durante a incubação de 15 minutos ou durante as etapas de pausa do usuário no protocolo. Seja cauteloso ao adicionar buffers durante o período de incubação devido a recursos de segurança, como uma cortina de luz. Certifique-se de limpar todas as mensagens de aviso do software para evitar qualquer interrupção não intencional do protocolo.

Este protocolo reflete uma melhoria confiável, repetível e amplamente aplicável em protocolos automatizados previamente documentados para o manuseio de protoplastos^12,13. Este método é adaptável ao repertório aparentemente interminável de protocolos de protoplastos, pois muitos dependem da mesma série de etapas de manipulação de buffer. A mitigação do efeito de borda por meio do RICBD durante a criação automatizada da placa de transfecção reduz simultaneamente a quantidade de esforço e variabilidade enquanto aplica uma correção estatisticamente significativa do efeito de borda. Uma transfecção de cápsula de 96 poços de protoplasto elimina a possibilidade de qualquer variação associada ao tempo de incubação do PEG, conduzindo a reação em todos os 96 poços simultaneamente. Embora o protocolo tenha como objetivo realizar a automação completa das etapas de transfecção, as pausas do usuário exigirão intervenção física do cientista de transfecção. Nos últimos anos, houve muitos avanços em centrífugas tolerantes a desequilíbrios e compatíveis com automação. Com este equipamento, seria possível automatizar todo o método sem o envolvimento do usuário. Alternativamente, outros protocolos evitaram a centrifugação, permitindo que o protoplasto se depositasse no fundo do poço após a transfecção^12,13. No entanto, isso adicionará tempo adicional ao procedimento de transfecção e um excesso de tempo de incubação no tampão W5 antes da incubação noturna em WI.

Em vários locais do método de transfecção, ele descreve o manuseio de volumes superiores a 200 μL onde o manuseio de líquidos deve ser feito usando múltiplas transferências. Dependendo da idade e do modelo do manipulador de líquidos, esta etapa pode e deve ser feita como um único volume. Para os manipuladores de líquidos mais antigos, como o modelo descrito aqui, o máximo que pode ser aspirado usando uma cabeça de 96 poços é de 200 μL. Uma melhoria óbvia para o método em eficiência e precisão seria reduzir o número de transferências para minimizar qualquer risco potencial de derramamento, gotejamento ou contaminação. Outras considerações para a melhoria dos protocolos de manuseio de líquidos são descritas em revisões dessas tecnologias e sua utilização no campo da biotecnologia²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoetanol	Sigma	M6250
2-(N-Morfolino)ácido etanossulfônico (MES) monohidratado	Sigma	69892
Tubos de centrífuga de 50mL com tampa plana estéril	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Preto com Tampa Cultura de Células Estéril PS .4mL Well	Pontas Robóticas Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX, não estéreis, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Pontas Robóticas Axygen Filtro de 30uL, estéril, com rack	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Dessecadores a Vácuo Estilo Redondo	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Parafilme de Laboratório de Rolo	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Cloreto de cálcio dihidratado	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Hemocitômetro Descartável	Fisher	50-131-1352
Clorox Alvejante Germicida, Concentrado	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well blocos de ensaio, 2mL, 96 poços padrão	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Seringa de Plástico Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL	Fisher	14-955-461
Filtro de Células Estéreis Fisherbrand 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand com Tampa Transparente, Empilháveis, 100 mm x 25 mm, Caixa de 325	Fisher	FB0875711
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma	M2670
Unidade de Filtro Acionada por Seringa Millex Estéril 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Unidade de Filtro Acionada por Seringa Millex Estéril 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Unidades de Filtro de Vácuo Descartáveis Estéreis 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poli(etilenoglicol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Mistura de Mudas	Wyatt Quarles	GP92747
aço traseiro .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Cloreto de sódio	Sigma	S7653
Bandeja de Inserção - 36 Células - 6x6 Aninhado	Hummert	11635000
Tween-20	Bomba de vácuo Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 Hz, plugue US	VWR	97058-164