Permitindo estudos de expressão de transgenes de alto rendimento usando manuseio automatizado de líquidos para protoplastos de folhas de milho estiolado

Resumo

Este protocolo descreve a criação de um layout de transfecção aleatório usando um manipulador de líquido automatizado, um protocolo de isolamento de protoplastos para folha de milho estiolada e um procedimento de transfecção de 96 poços usando um manipulador de líquido.

Resumo

O campo da biotecnologia vegetal testemunhou avanços notáveis nos últimos anos, revolucionando a capacidade de manipular e projetar plantas para vários fins. No entanto, à medida que a pesquisa neste campo aumenta em diversidade e se torna cada vez mais sofisticada, a necessidade de soluções de triagem transitória precoces, eficientes, confiáveis e de alto rendimento para restringir as estratégias que prosseguem para uma transformação estável é mais aparente. Um método que ressurgiu nos últimos anos é a utilização de protoplastos vegetais, para os quais métodos de isolamento e transfecção estão disponíveis em várias espécies, tecidos e estágios de desenvolvimento. Este trabalho descreve um protocolo automatizado simples para a preparação aleatória de plasmídeo em uma placa de 96 poços, um método para o isolamento de protoplasto foliar de milho estiolado e um procedimento automatizado de transfecção. A adoção de soluções automatizadas em biotecnologia vegetal, exemplificada por esses novos protocolos de manuseio de líquidos para transfecção de protoplastos vegetais, representa um avanço significativo em relação aos métodos manuais. Ao alavancar a automação, os pesquisadores podem facilmente superar as limitações dos métodos tradicionais, aumentar a eficiência e acelerar o progresso científico.

Introdução

A transfecção de protoplastos vegetais, a introdução de material genético estranho em células vegetais desprovidas de paredes celulares, é uma técnica fundamental e, no último meio século, abrange inúmeras espécies em apoio à pesquisa em biotecnologia vegetal. No entanto, a utilização desses métodos pode ser dolorosa e limitada em escopo, mesmo com milhões de protoplastos produzidos por isolamento. Os métodos tradicionais de transfecção de protoplastos vegetais são frequentemente trabalhosos, demorados, propensos à variabilidade e tecnicamente exigentes, levando a sistemas de nicho com baixa reprodutibilidade¹.....

Protocolo

1. Criação de placas de transfecção

1. Criação do layout do deck: Para criar um método de randomização de placas de DNA, abra o software de manipulação de líquidos. Clique no botão Novo método na barra de menus para criar um novo método. Adicione a linha de configuração do instrumento entre as linhas de início e término pressionando o botão Configuração do instrumento no painel esquerdo.
   NOTA: As capturas de tela relevantes que acompanham esse protocolo automatizado podem ser encontradas na Figura Suplementar 1, na Figura Suplementar 2 e n....

Resultados

Obter dados observacionais que comprovem que os efeitos extremos podem estar afetando as medições de resposta; Um estudo piloto foi realizado para confirmar essas suspeitas. Para este estudo, os métodos acima foram aplicados a três placas replicadas de 96 poços com apenas um único nível de tratamento; todos os protoplastos foram transfectados usando pSYN11250¹⁹, um plasmídeo que expressa constitutivamente ZsGreen, com o objetivo de mostrar que existem diferenças sistemáticas no nível de resposta p.......

Discussão

Este manuscrito descreve um protocolo para automatizar a criação de placas de transfecção e o isolamento de protoplastos foliares de milho estiolado com uma transfecção automatizada. Para a conclusão bem-sucedida da parte de criação da placa de transfecção do protocolo, é necessário um robô automatizado de manuseio de líquidos equipado com um pod de 8 canais. Para o protocolo de transfecção, recomenda-se uma cápsula de 96 poços para transfecção completa e uniforme de placas de 96 poços. .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(2)β-mercaptoetanol	Sigma	M6250
2-(N-Morfolino)ácido etanossulfônico (MES) monohidratado	Sigma	69892
Tubos de centrífuga de 50mL com tampa plana estéril	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Preto com Tampa Cultura de Células Estéril PS .4mL Well	Pontas Robóticas Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX, não estéreis, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Pontas Robóticas Axygen Filtro de 30uL, estéril, com rack	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Dessecadores a Vácuo Estilo Redondo	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Parafilme de Laboratório de Rolo	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Cloreto de cálcio dihidratado	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Hemocitômetro Descartável	Fisher	50-131-1352
Clorox Alvejante Germicida, Concentrado	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well blocos de ensaio, 2mL, 96 poços padrão	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Seringa de Plástico Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL	Fisher	14-955-461
Filtro de Células Estéreis Fisherbrand 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand com Tampa Transparente, Empilháveis, 100 mm x 25 mm, Caixa de 325	Fisher	FB0875711
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma	M2670
Unidade de Filtro Acionada por Seringa Millex Estéril 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Unidade de Filtro Acionada por Seringa Millex Estéril 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Unidades de Filtro de Vácuo Descartáveis Estéreis 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poli(etilenoglicol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Mistura de Mudas	Wyatt Quarles	GP92747
aço traseiro .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Cloreto de sódio	Sigma	S7653
Bandeja de Inserção - 36 Células - 6x6 Aninhado	Hummert	11635000
Tween-20	Bomba de vácuo Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 Hz, plugue US	VWR	97058-164

Placas de Petri Lâminas de Barbear de Borda Única de Serviço Regular