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Artigo de método

Permitindo estudos de expressão de transgenes de alto rendimento usando manuseio automatizado de líquidos para protoplastos de folhas de milho estiolado

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DOI:

10.3791/65989

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16 de fevereiro de 2024

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1Syngenta Crop Protection, LLC

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a criação de um layout de transfecção aleatório usando um manipulador de líquido automatizado, um protocolo de isolamento de protoplastos para folha de milho estiolada e um procedimento de transfecção de 96 poços usando um manipulador de líquido.

Resumo

O campo da biotecnologia vegetal testemunhou avanços notáveis nos últimos anos, revolucionando a capacidade de manipular e projetar plantas para vários fins. No entanto, à medida que a pesquisa neste campo aumenta em diversidade e se torna cada vez mais sofisticada, a necessidade de soluções de triagem transitória precoces, eficientes, confiáveis e de alto rendimento para restringir as estratégias que prosseguem para uma transformação estável é mais aparente. Um método que ressurgiu nos últimos anos é a utilização de protoplastos vegetais, para os quais métodos de isolamento e transfecção estão disponíveis em várias espécies, tecidos e estágios de desenvolvimento. Este trabalho descreve um protocolo automatizado simples para a preparação aleatória de plasmídeo em uma placa de 96 poços, um método para o isolamento de protoplasto foliar de milho estiolado e um procedimento automatizado de transfecção. A adoção de soluções automatizadas em biotecnologia vegetal, exemplificada por esses novos protocolos de manuseio de líquidos para transfecção de protoplastos vegetais, representa um avanço significativo em relação aos métodos manuais. Ao alavancar a automação, os pesquisadores podem facilmente superar as limitações dos métodos tradicionais, aumentar a eficiência e acelerar o progresso científico.

Introdução

A transfecção de protoplastos vegetais, a introdução de material genético estranho em células vegetais desprovidas de paredes celulares, é uma técnica fundamental e, no último meio século, abrange inúmeras espécies em apoio à pesquisa em biotecnologia vegetal. No entanto, a utilização desses métodos pode ser dolorosa e limitada em escopo, mesmo com milhões de protoplastos produzidos por isolamento. Os métodos tradicionais de transfecção de protoplastos vegetais são frequentemente trabalhosos, demorados, propensos à variabilidade e tecnicamente exigentes, levando a sistemas de nicho com baixa reprodutibilidade1. No entanto, o potencial introduzido pelas soluções automatizadas nos últimos anos ilumina a possibilidade de dar nova vida a essa técnica jovem de 60 anos 2,3. Com o potencial de automatizar etapas cruciais, mas repetitivas, como preparação de materiais, incubação de polietilenoglicol (PEG) e subsequente distribuição de reagentes de transfecção, os pesquisadores podem reduzir significativamente os requisitos de manuseio físico e outras fontes potenciais de erro humano4. Além disso, o controle preciso e a uniformidade oferecidos pelos sistemas automatizados de manuseio de líquidos garantem resultados de transfecção consistentes e reprodutíveis.

Embora o isolamento do protoplasto seja um processo meticuloso que envolve corte, digestão, incubação, filtração e centrifugação, a parte de transfecção desses protocolos é feita sob medida para manipuladores automatizados de líquidos. O procedimento para a maioria dos protocolos de transfecção de protoplastos é mediado por PEG, e misturar o protoplasto isolado na presença de PEG e DNA de plasmídeo purificado por um período especificado em uma concentração precisa (dependendo da espécie e do tecido) permite que essas células absorvam o DNA do plasmídeo5. Essa transfecção é seguida por uma série de etapas de lavagem, culminando em uma incubação noturna6. Após o período de incubação, se tudo foi projetado e entregue adequadamente, o experimento resulta na expressão do componente de interesse e/ou no potencial de avaliação de diferentes componentes regulatórios7. Todas as etapas de aspiração, dispensação e agitação/mistura associadas a este procedimento normalmente seriam tratadas por uma pipeta manual. A execução manual de tal protocolo, uma reação individual de cada vez, é trabalhosa e introduz variações desnecessárias entre as amostras, ao mesmo tempo em que limita a capacidade que pode ser avaliada a qualquer momento. Protocolos automatizados para manipulação de células de mamíferos ou insetos e síntese química na indústria farmacêutica estão em prática há vários anos 4,8,9. A utilização de protoplastos e protocolos envolvendo o manuseio automatizado de líquidos de materiais vegetais estão aumentando 10,11,12,13.

A adoção de protocolos automatizados de manuseio de líquidos para transfecção de protoplastos de plantas é uma grande promessa para aplicações de pesquisa. Os pesquisadores podem explorar bibliotecas genéticas maiores, rastrear funções genéticas específicas em um ritmo acelerado e investigar interações genéticas complexas relacionadas ao estresse das plantas de forma mais abrangente14. A escalabilidade de abordagens automatizadas utilizando cápsulas de 96 poços combinadas com triagem de fluorescência permite experimentação de alto rendimento e permite que os cientistas gerem rapidamente dados e insights que podem alimentar avanços na biotecnologia vegetal11. No entanto, com esse aumento na taxa de transferência, levando à geração de centenas, senão milhares de pontos de dados, deve haver um controle de qualidade adicional que leve em conta quaisquer fontes de erro que possam confundir os resultados15. Um elemento que foi identificado como um fator contribuinte em várias disciplinas científicas é o efeito de borda. Algumas estratégias mitigadoras sugerirão a melhor placa para usar ou preencher o espaço entre poços ou os poços mais externos com água para combater esse fenômeno16,17. No entanto, essas estratégias aumentam o tempo e, se um descartável específico não estiver disponível, a única opção é se contentar com menos ou adiar. Como alternativa, observar estratégias que levam em conta esse efeito por meio de um esquema de bloqueio não sacrifica a taxa de transferência ou o atraso na execução.

Este protocolo de protoplastos foliares de milho estiolado e seus dois métodos automatizados ilustrados na Figura 1 buscam abordar a variabilidade inerente aos experimentos de protoplastos automatizando várias porções do método canônico de protoplastos, a alocação de material de plasmídeo ao vaso usado para transfecção e a própria transfecção. Esses métodos são demonstrados para a plataforma de protoplastos foliares de milho estiolados, pois é uma plataforma de protoplastos bem caracterizada, simples e eficiente. Todas as etapas detalhadas são imediatamente acessíveis aos protocolos de transfecção de protoplastos, que utilizam soluções tampão semelhantes ou iguais. No entanto, atenção especial às características únicas do tecido e das espécies de origem de protoplastos deve ser considerada antes da adoção dessas técnicas. Essas melhorias por meio da automação simplificam a preparação de material para experimentos individuais e melhoram significativamente o rendimento, de uma a uma transfecção sequencial para 96 transfecções tratadas simultaneamente. Este trabalho também mostrará justificativa para a utilização de blocos incompletos casualizados para explicar o viés posicional da placa.

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Protocolo

1. Criação de placas de transfecção

  1. Criação do layout do deck: Para criar um método de randomização de placas de DNA, abra o software de manipulação de líquidos. Clique no botão Novo método na barra de menus para criar um novo método. Adicione a linha de configuração do instrumento entre as linhas de início e término pressionando o botão Configuração do instrumento no painel esquerdo.
    NOTA: As capturas de tela relevantes que acompanham esse protocolo automatizado podem ser encontradas na Figura Suplementar 1, na Figura Suplementar 2 e na Figura Suplementar 3.
  2. Clique na linha de configuração do instrumento , encontre o material de laboratório correto no menu de categorias do material de laboratório e arraste-o para o layout do deck, conforme mostrado na Figura 1 suplementar.
    NOTA: Se o material de laboratório não estiver definido anteriormente, ele precisará ser programado no manipulador de líquidos de acordo com a especificação do fabricante, mas essas instruções estão fora do escopo deste protocolo.
  3. Configuração de transferência do arquivo: Pressione o botão Transferir do arquivo nas paletas de etapas e coloque a linha Transferir do arquivo abaixo da linha de configuração do instrumento. Certifique-se de que a seleção e a substituição da ponta sejam mostradas na Figura Suplementar 3.
  4. Verifique se o arquivo tem uma linha de cabeçalho e verifique se as informações da coluna estão corretas.
  5. Pressione a área de origem para ativá-la e clique na placa de origem no layout do deck, defina a placa de destino e insira a quantidade de DNA a ser pipetada.
  6. Pressione o botão Personalizar para definir a técnica de pipetagem em detalhes, como toques de ponta na parede.
  7. Especifique a quantidade de DNA plasmidial a ser transferida. Este protocolo usa 20 μL de DNA plasmidial de 1 μg/μL por transfecção (poço).
    NOTA: a quantidade de DNA de plasmídeo que é transferida para a placa de transfecção antes da transfecção do protoplasto dependerá da plataforma de protoplasto que está sendo usada.
  8. Crie uma transferência do arquivo .csv documento.
    1. Este documento é composto por duas colunas. Prepare a primeira coluna, ou seja, a coluna De, que indica a localização do DNA do plasmídeo de estoque dentro do rack de tubos, ou seja, para a amostra 1; isso seria bem A01. Como essa transferência acontece três vezes (três repetições), três linhas devem indicar A01 na coluna De.
    2. Prepare a segunda coluna, ou seja, a coluna Para, usada para especificar o poço de destino da construção do plasmídeo da placa de 96 poços. Por exemplo, a amostra 1 (A01) pode ser B02, D04 e H07. Salve-o como um arquivo .csv para ser compatível com o software manipulador de líquidos.
  9. Antes de executar o protocolo, verifique se as posições do convés estão carregadas, se o material de laboratório está definido corretamente, se o documento de randomização inclui a localização dos poços para todo o DNA da amostra no rack de tubos e se há amostra de plasmídeo suficiente nos tubos para executar o protocolo.
  10. Expanda o menu Propriedades do arquivo da etapa Transferir do arquivo, selecione o arquivo .csv criado e execute o protocolo.
  11. Cubra as placas de transfecção com um selo de papel alumínio quando o protocolo for concluído com sucesso. Armazene as placas de transfecção a -20 °C até que estejam prontas para uso. O protoplasto isolado da folha de milho estiolado será adicionado a esta placa de transfecção na etapa 3.3.

2. Isolamento de protoplastos de folha de milho estiolado

  1. Para iniciar o isolamento do protoplasto foliar de milho estiolado, obtenha um fundo genético compatível com o protoplasto, como NP222, que foi usado aqui18. Preparar apenas 3 tampões, nomeadamente tampões MMg, W5 e WI, enumerados no quadro 1 antes do início da experiência e manter a 4 °C. Prepare a solução de digestão e o PEG no dia do experimento para obter melhores resultados.
  2. Esterilize 25 sementes na superfície submergindo-as primeiro em uma solução de alvejante comercial a 25% e agitando-as em um agitador de plataforma rotativa por aproximadamente 15 a 20 min em temperatura ambiente.
  3. Após agitação, enxágue bem as sementes com água estéril (DI). Repita a etapa de enxágue 5x. Beba as sementes em água estéril durante a noite em temperatura ambiente.
  4. Semeie a semente em solo úmido e autoclavado no dia seguinte. Adicione pellets de argila seca para absorver o excesso de umidade do solo e evitar a contaminação por fungos.
  5. Cultive as mudas de milho em uma câmara de crescimento leve de 16 h a 28 ° C (umidade relativa (UR) de 30%) por aproximadamente 3 dias até que o coleóptilo esteja 1-2 cm acima do solo e, em seguida, transfira para uma câmara escura com a mesma temperatura e UR por mais 5 a 7 dias.
  6. Colha o primeiro tecido foliar verdadeiro cortando-o logo acima do primeiro colarinho.
  7. Esterilize o tecido foliar brevemente em alvejante comercial a 25% e 250 μL de solução Tween 20 a 20% por 1 min. Enxágue bem o material da folha 5x com água DI.
  8. Seque (suavemente) o tecido da folha do milho com tecidos sem fiapos e, usando uma lâmina afiada, remova ~ 1,5 cm da ponta e da base de cada lâmina foliar.
  9. Corte o tecido foliar restante em tiras transversais estreitas (0,5 mm - 1 mm) e coloque em uma placa de Petri de 100 x 25 mm.
  10. Filtre-esterilize 25 mL da solução de digestão através de um filtro de seringa de 0,22 μm diretamente na placa de Petri contendo o tecido fatiado.
  11. Infiltre a vácuo o tecido foliar com solução de digestão aplicando vácuo por 30 min à temperatura ambiente em um dessecador a vácuo a aproximadamente -75 mbar de pressão.
    NOTA: A pressão de vácuo da casa para vários laboratórios acadêmicos e privados deve ser suficiente para esta etapa.
  12. Colocar num agitador de plataforma rotativa e agitar a 25 °C no escuro a 60 RPM durante 2,5 a 3 h. Quando faltarem 10 minutos para o final do período de digestão, aumente a velocidade para 90 RPM.
  13. Despeje a solução de digestão e qualquer material vegetal não digerido através de um funil em cima de um filtro de peneira de 40 μm em um tubo de 50 mL.
  14. Centrifugue a solução dentro do tubo de 50 mL a 150 x g por 4 min para pellet o protoplasto. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 - 15 mL de solução tampão MMg.
  15. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante. Ressuspenda em 5 - 10 mL de tampão MMg fresco.
  16. Usando um hemocitômetro, meça cuidadosamente a densidade do protoplasto isolado. Ressuspenda para uma densidade aproximada de 5 x 105 protoplastos por mL.
  17. Deixe o isolado descansar no gelo por ~ 30 min antes da transfecção. Durante este tempo, prepare a solução PEG. Dissolva completamente o PEG em uma solução usando um banho-maria a 37 ° C e deixe-o lá até a transfecção.

3. Transfecção automatizada de protoplastos

NOTA: As etapas 3.6 a 3.15 são gerenciadas completamente pelo manipulador de líquidos automatizado, exceto pelas duas pausas do usuário nas etapas 3.10 e 3.13, que requerem centrifugação manual. Capturas de tela relevantes que acompanham esse protocolo automatizado podem ser encontradas no suplemento, Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4 e Figura Suplementar 5.

  1. Prepare o layout do convés do manipulador de líquidos para transfecção de acordo com o método de transfecção de protoplastos descrito nas etapas a seguir. Monte os seguintes materiais: Placa de destino (neste caso, seria uma placa preta de 96 poços com uma microplaca de fundo transparente para medição de fluorescência), uma caixa de pontas de automação de diâmetro largo de 25 a 250 μL para a etapa de aspiração de PEG, cinco caixas de pontas de automação de pipeta de 25 a 250 μL para as etapas restantes de manuseio de líquidos, três calhas de plástico como reservatórios de reagentes, uma placa vazia de 96 poços para coleta de resíduos, soluções de lavagem de tampão de transfecção restantes, W5 e WI.
  2. Imediatamente antes do início do procedimento de transfecção, esterilize por filtro a solução de PEG através de uma unidade de filtro a vácuo descartável estéril de 0,22 μm em um tubo novo de 50 mL.
  3. A partir do protoplasto ressuspenso em tampão MMg, adicione 100 μL (aproximadamente 50.000 protoplastos) a cada poço da placa de transfecção pré-preparada e descongelada. Para fazer isso, despeje a solução tampão contendo protoplastos em uma calha estéril de 10 mL e use uma pipeta multicanal. Continue agitando suavemente a calha para evitar que o protoplasto se acumule fora da solução durante esta etapa de transferência manual.
  4. Despeje a solução de PEG na calha apropriada e coloque a placa de transfecção, agora contendo protoplasto e DNA de plasmídeo contendo placa de transfecção, preparada usando a etapa 1, no local especificado de acordo com o layout do convés.
  5. Para criar um método de transfecção de protoplasto, abra o software de manipulação de líquidos e execute as etapas descritas abaixo.
    1. Movendo material de laboratório entre decks: Substitua a caixa de ponta vazia no deck de carregamento de ponta por uma nova usando o comando Mover Material de Laboratório. Selecione os decks De e Para na visualização Configuração .
    2. Para volumes superiores a 200 μL: Não substitua as pontas entre as transferências. Carregue as pontas para a primeira etapa de transferência e descarregue após a última etapa de transferência, o que requer que as opções de Carga/Descarga sejam especificadas corretamente para cada etapa de transferência, como na Figura Suplementar 3.
  6. Criação do layout do deck: Como o método de criação da placa de transfecção, para criar um método de transfecção automatizado de DNA, abra o software de manipulação de líquidos. Clique no botão Novo método na barra de menus para criar um novo método. Adicione a linha de configuração do instrumento entre as linhas inicial e final pressionando o botão Configuração do instrumento no painel esquerdo. Crie um layout de deck de acordo com o layout de deck mostrado na Figura Suplementar 1.
  7. Mistura de células/DNA: Adicione uma etapa para misturar protoplastos e DNA antes da adição de PEG usando o botão Device Action e configurando o dispositivo (posicionador automatizado de material de laboratório ou ALP), velocidade de agitação (1500 rpm) e tempo de agitação (10 s).
  8. Adição e mistura de PEG: Para iniciar a transfecção, adicione uma etapa de transferência para adicionar 110 μL de PEG do reservatório de PEG usando uma pipeta de 96 cápsulas. Certifique-se de que as posições corretas de origem e destino sejam programadas de acordo com o layout do deck especificado. Programe a etapa de transferência para aspirar PEG 1 mm do fundo do reservatório e depositar o PEG 3 mm da base da placa de 96 poços contendo a mistura protoplast/DNA. Adicione outra etapa de agitação após a adição de PEG, copiando e colando as etapas programadas anteriormente.
  9. Incubação PEG: Adicione uma etapa de pausa selecionando o botão Pausar , selecione o agitador e insira o tempo de incubação pré-determinado, que começa com a adição de PEG.
    NOTA: O temporizador para a pausa continuará, a menos que haja interrupções ou interrupções na cortina de luz que resultem em uma mensagem de erro. Certifique-se de que, se a manipulação do deck for necessária, essas mensagens sejam apagadas antes de ir embora.
  10. Adição/mistura de tampão W5: Adicione três linhas de transferência de 200 μL para transferir um total de 600 μL de tampão W5 para a placa de transfecção para extinguir a reação de incubação de PEG. Siga a adição de tampão W5 agitando e fazendo uma pausa do usuário para permitir a centrifugação da placa de transfecção.
  11. Pausa do usuário 1: Centrifugue a placa de transfecção de protoplasto a 100 x g por 4 min. Retorne a placa de transfecção, agora com protoplasto peletizado, de volta à posição apropriada do convés. Adicione a pausa do usuário clicando no botão Pausar , exceto agora com a opção Pausar todo o sistema e exibir a mensagem selecionada.
    NOTA: O pop-up da mensagem de pausa precisa ser apagado antes que o manipulador de líquidos continue com o restante do protocolo.
  12. Remoção do sobrenadante: Adicione duas linhas de transferência para remover 400 μL de sobrenadante e transfira para a placa de resíduos. Para evitar a aspiração celular durante a remoção do sobrenadante, defina a distância do fundo como 6 mm.
  13. Adição/mistura de WI Adicione 3 linhas de transferência para transferir 580 μL de tampão WI para a placa de transfecção. Adicione outra etapa de agitação após a adição do WI, copiando e colando as etapas programadas anteriormente. Prossiga para a próxima pausa do usuário.
  14. Pausa do usuário 2: Centrifugue a placa de transfecção de protoplasto a 100 x g por 4 min. Retorne a placa de transfecção, agora com protoplasto peletizado, de volta à posição apropriada do convés.
  15. Remoção do sobrenadante: Adicione quatro linhas de transferência para remover 680 μL de sobrenadante e transfira para a placa de resíduos. Para evitar a aspiração celular durante a remoção do sobrenadante, defina a distância do fundo como 6 mm.
  16. Transferência de protoplastos para microplacas: A transferência final deste protocolo é composta por duas etapas de transferência de 150 μL. Antes de cada etapa individual, aspire repetidamente os protoplastos a 50 μL / s a 2 mm do fundo da placa de transfecção e dispense a 3 mm. Em seguida, utilizando as mesmas pontas de pipeta, transfira para a microplaca de destino.
    NOTA: A aspiração e a distribuição do volume do tampão acima do pellet antes da transferência para a microplaca perturbará quaisquer protoplastos restantes peletizados no fundo da placa de transfecção para garantir que não haja perda de amostra. Como a randomização foi feita durante a criação da placa de transfecção, isso conclui o protocolo automatizado.
  17. Incubar a microplaca à temperatura ambiente no escuro durante 24 a 48 h antes da primeira medição de fluorescência.

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Resultados

Obter dados observacionais que comprovem que os efeitos extremos podem estar afetando as medições de resposta; Um estudo piloto foi realizado para confirmar essas suspeitas. Para este estudo, os métodos acima foram aplicados a três placas replicadas de 96 poços com apenas um único nível de tratamento; todos os protoplastos foram transfectados usando pSYN1125019, um plasmídeo que expressa constitutivamente ZsGreen, com o objetivo de mostrar que existem diferenças sistemáticas no nível de resposta p...

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Discussão

Este manuscrito descreve um protocolo para automatizar a criação de placas de transfecção e o isolamento de protoplastos foliares de milho estiolado com uma transfecção automatizada. Para a conclusão bem-sucedida da parte de criação da placa de transfecção do protocolo, é necessário um robô automatizado de manuseio de líquidos equipado com um pod de 8 canais. Para o protocolo de transfecção, recomenda-se uma cápsula de 96 poços para transfecção completa e uniforme de placas de 96 poços. ...

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Divulgações

Todos os autores são empregados pela Syngenta, uma empresa internacional de biotecnologia agrícola, empregando rotineiramente tecnologia de transformação para a geração de produtos transgênicos (GM).

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos muitos cientistas da Syngenta que apoiam este trabalho e à nossa equipe diariamente. Um reconhecimento especial deve ser dado à família e amigos, cujo apoio muitas vezes invisível é crucial para o sucesso contínuo da Equipe de Ensaios Transitórios.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(2)β-mercaptoetanol SigmaM6250
2-(N-Morfolino)ácido etanossulfônico (MES) monohidratadoSigma69892
Tubos de centrífuga de 50mL com tampa plana estérilFisher22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Preto com Tampa Cultura de Células Estéril PS .4mL WellPontas Robóticas Fisher12-566-70
Axygen Biomek FX/NX, não estéreis, Wide BoreFisher14-222-096
Pontas Robóticas Axygen Filtro de 30uL, estéril, com rackFisher14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Dessecadores a Vácuo Estilo RedondoFisher08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Parafilme de Laboratório de Rolo Fisher13-374-16
Biomek FXPBeckman Coulter902508
Cloreto de cálcio dihidratadoSigmaC5080
Chemglass Life Sciences Hemocitômetro Descartável Fisher50-131-1352
Clorox Alvejante Germicida, ConcentradoFisherNC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher07-200-684
Corning 96-Well blocos de ensaio, 2mL, 96 poços padrãoFisher07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
D-Mannitol Seringa de Plástico SigmaM9546
Fisherbrand 60mLFisher14-955-461
Filtro de Células Estéreis Fisherbrand 40umFisher22-363-547
Fisherbrand com Tampa Transparente, Empilháveis, 100 mm x 25 mm, Caixa de 325FisherFB0875711
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigmaM2670
Unidade de Filtro Acionada por Seringa Millex Estéril 33mm PES .22umFisherSLGPR33RS
Unidade de Filtro Acionada por Seringa Millex Estéril 33mm PVDF.45umFisherSLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Unidades de Filtro de Vácuo Descartáveis Estéreis 50mL PESFisherSCGP00525
Poli(etilenoglicol) 4000 Sigma81240
Redi-Earth Plug & Mistura de MudasWyatt QuarlesGP92747
aço traseiro .009RDFisher12-640
Research Products International Corp Cellulase RSFisher50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10Fisher50-213-444
Cloreto de sódioSigmaS7653
Bandeja de Inserção - 36 Células - 6x6 Aninhado Hummert11635000
Tween-20 Bomba de vácuo SigmaP1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 Hz, plugue USVWR97058-164
Placas de Petri Lâminas de Barbear de Borda Única de Serviço Regular

Referências

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