<ol><li> Construir uma câmara de fluxo, como mostrado no vídeo. Certifique-se que o selo parafilme é apertado e use lamínulas lavadas. </li><li> Incubar agente de ligação de actina na câmara para &#39;5-10. </li><li> Bloco não-específicos sítios de ligação na lamela de vidro com uma proteína de bloqueio. </li><li> Polimerizar actina no interior da câmara de fluxo em G-actina na polimerização buffer. </li><li> Washout actina unpolymerized fluindo em tampão em excesso. </li></ol>

monitoramento actina desmontagem com a time-lapse microscopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Ok, então o que gostaria de fazer hoje é mostrar como construir uma câmara de fluxo, uma câmara de fusão para imagens em um microscópio invertido. Em seguida, crio dois espaços usando filme. Para isso, pego o filme de parafina e o corto em tiras pequenas.Em seguida, vou fazer isso, o que basicamente formará os canais para as paredes, e eu os seco com um fluxo de ar inclinado. Coloco a lamínula sobre o para, e aqui está o produto final. Depois, aqueço em um bloco térmico para derreter o para e, essencialmente, criar um selamento.O que temos aqui é o vidro de cobertura, e acima desse vidro de cobertura há duas camadas de phim, como você vê bem aqui. E acima disso, novamente, há um lamínula de 22 por 22 milímetros. Este aqui, que pressionei contra o param para formar o selo.Ok, então o líquido entra em uma direção aqui e posso removê-lo com um papel filtro nesta direção. Vou mostrar como fazer isso em breve. O que gosto de fazer é colocá-lo em uma câmara umidificada, o que é muito simples.Utilize dois tipos de tiras elevadas e coloque um filtro de papel por baixo. E para mantê-lo instável, como eu faço, coloque a lamínula na câmara de fluxo. Agora, a maneira de introduzir uma solução na câmara é simplesmente posicionar a ponta da pipeta na entrada da câmara e depositar a solução.Agora, o que faço é incubar a câmara com a tampa fechada por 10 minutos. O que geralmente faço para aspirar o líquido do outro lado é usar um papel filtro cortado em tiras finas como esta. Pego uma dessas tiras finas e, simultaneamente, aplico a solução na entrada enquanto coloco o papel filtro na saída para aspirar a troca, a solução.Então você verá o líquido fluindo pela solução. E então espero cinco minutos para o fechamento intermediário. Agora, estou pronto para colocar a actina, que preciso polimerizar; realizo a polimerização dentro da câmara de fluxo, usando exatamente os mesmos procedimentos anteriores.Então, por isso, e agora que a ação está polimerizada, lavo todo o excesso de ação não polimerizada usando um grande volume de tampão apenas. Aqui, tenho cerca de cem microlitros, o que equivale a algumas volumes da câmara de reação de tampão. Sabe, quando o papel de filtro fica saturado, preciso mudar a direção. Está claro?E então estou pronto para realizar a imagem com isso. Então, câmara de perfusão com actina ligada a ela. Agora pego a lâmina, coloco-a sob o microscópio e, como estou obtendo imagens com uma objetiva de imersão em óleo, vou colocar um pouco de óleo de imersão na superfície superior da lamínula, toque leve, de forma a avaliar a solução ou proteína ou qualquer coisa na actina interna.O que faço é trocar a solução do meio enquanto realizo a aquisição de imagens com lapso de tempo. Assim.

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