<ol><li> Construir uma câmara de fluxo, como mostrado no vídeo. Certifique-se que o selo parafilme é apertado e use lamínulas lavadas. </li><li> Incubar agente de ligação de actina na câmara para &#39;5-10. </li><li> Bloco não-específicos sítios de ligação na lamela de vidro com uma proteína de bloqueio. </li><li> Polimerizar actina no interior da câmara de fluxo em G-actina na polimerização buffer. </li><li> Washout actina unpolymerized fluindo em tampão em excesso. </li></ol>

monitoramento actina desmontagem com a time-lapse microscopia

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Ok, então o que eu gostaria de fazer hoje é mostrar a vocês como construir uma câmara de fluxo, uma câmara de fusão para imagens em um microscópio vertical. O que então eu faço é criar dois espaços usando filme. Então o que eu faço é pegar o filme para, cortá-lo em pequenas tiras.Em seguida, isso basicamente formará os canais para as paredes, e eu os seco com ar inclinado. Coloquei a lamínula em cima do parágrafo, e aqui está o final. Então eu aqueço em um bloco de calor para derreter o parâmetro e basicamente criar um selo.Então, o que é isso é o vidro de cobertura aqui, e então em cima do vidro de cobertura há duas camadas de phim, como você vê aqui. E então, além disso, novamente, há uma lamínula de 22 por dois metros de dois metros. Este aqui, que eu pressionei contra o param para derrubar o selo.Ok, então o líquido entra em uma direção aqui e eu posso sugá-lo com um papel de filtro aqui nessa direção. E eu vou te mostrar como fazer isso daqui a pouco. Então, o que eu gosto de fazer é colocá-lo em uma câmara umidificada, o que é muito simples.Pegue dois tipos de tiras elevadas e tenha um filtro de papel embaixo. E para mantê-lo barulhento enquanto eu, coloco a tampa, a lamínula na câmara de fluxo. Agora, a maneira como você introduz uma solução na câmara é que você apenas coloca a ponta da pipeta na entrada da câmara e você simplesmente divide.Agora o que eu faço é incubar a câmara com a tampa fechada por 10 minutos. O que eu costumo fazer para sugar o líquido do outro lado é usá-lo, pegar um papel de filtro e cortá-lo em tiras finas assim. E eu pego uma dessas tiras finas e simultaneamente aplico a solução na entrada enquanto coloco o papel de filtro na saída para sugar a troca, a solução.Então você verá o líquido fluindo através da solução. E então eu espero por cinco minutos para o meio do fechamento. Agora, o que estou pronto para fazer é realmente colocar a actina e a actina, eu realmente tenho que polimerizar, eu polimerizo dentro da câmara de fluxo e são os mesmos procedimentos anteriores.Então, porque assim, e agora que a ação é polimerizada, eu lavo toda a ação não polimerizada em excesso usando um grande volume de apenas tampão. Então aqui eu tenho cerca de cem microlitros e são alguns volumes de câmara de reação de buffer. Apenas, você sabe, quando o papel de filtro fica saturado, eu tenho que mudar a direção. Okey?E então estou pronto para fazer imagens com isso. Então, câmara de perfusão com actina ligada a ela. Agora eu pego a lâmina, coloco sob o microscópio e, como estou fazendo imagens com uma objetiva de óleo, vou colocar um pouco de óleo de imersão na superfície superior da tampa, toque de grama, para avaliar a solução ou proteína ou qualquer coisa ao agir dentro.Então, o que eu faço é realmente trocar o lado da solução enquanto estou fazendo a imagem de lapso de tempo. Como tal.

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