Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula

Summary

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

Abstract

A lente ocular é um tecido flexível transparente que altera sua forma para focalizar a luz de diferentes distâncias na retina. Além de uma membrana basal que envolve o órgão, chamada de cápsula, o cristalino é inteiramente celular consistindo de uma monocamada de células epiteliais no hemisfério anterior e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino. Ao longo da vida, as células epiteliais proliferam na zona germinativa no equador do cristalino, e as células epiteliais equatoriais migram, alongam-se e diferenciam-se em células de fibras recém-formadas. As células epiteliais equatoriais alteram substancialmente a morfologia de células em forma de paralelepípedo aleatoriamente embaladas em células alinhadas em forma de hexágono formando fileiras meridionais. As células de fibras do cristalino recém-formadas retêm a forma de célula hexagonal e se alongam em direção aos polos anterior e posterior, formando uma nova camada de células que são sobrepostas às gerações anteriores de fibras. Pouco se sabe sobre os mecanismos que conduzem a notável morfogênese das células epiteliais do cristalino para as células fibrosas. Para melhor entender a estrutura, o desenvolvimento e a função das lentes, novos protocolos de imagem foram desenvolvidos para obter imagens de estruturas periféricas usando montagens inteiras de lentes oculares. Aqui, métodos para quantificar a espessura da cápsula, a área celular epitelial, a área e a forma nuclear da célula, a ordem e o empacotamento das células da linha meridional e as larguras das células de fibra são mostrados. Essas medidas são essenciais para elucidar as mudanças celulares que ocorrem durante o crescimento do cristalino ao longo da vida e entender as mudanças que ocorrem com a idade ou patologia.

Introduction

A lente ocular é um tecido flexível e transparente situado na região anterior do olho que tem a função de focalizar a luz na retina. A capacidade de funcionamento da lente pode ser atribuída, em parte, à sua intrincada arquitetura e organização 1,2,3,4,5,6. Ao redor do tecido do cristalino encontra-se a cápsula, membrana basal essencial para a manutenção da estrutura e das propriedades biomecânicas^do cristalino ^7,8,9. O cristalino em si é inteiramente celular, consistindo de dois tipos celulares: células epiteliais e fibras. A camada epitelial é constituída por uma monocamada de células cuboidais que recobre o hemisfério anterior do^cristalino10. Ao longo da vida, as células epiteliais proliferam e migram ao longo da cápsula do cristalino em direção ao equador do cristalino. As células epiteliais anteriores são quiescentes e em corte transversal e, próximo ao equador do cristalino, as células epiteliais proliferam e passam a sofrer o processo de diferenciação em novas células^{fibrosas11,12}. As células epiteliais equatoriais transformam-se de células aleatoriamente embaladas em fileiras meridionais organizadas com células em forma de hexágono. A forma das células hexagonais é mantida na face basal dessas células diferenciadoras enquanto a face apical se contrai e ancora no fulcro do cristalino ou modíolo4,13,14,15. À medida que as células epiteliais equatoriais começam a se alongar em células de fibras recém-formadas, as pontas apicais das células migram ao longo da superfície apical das células epiteliais anteriores em direção ao polo anterior, enquanto as pontas basais se movem ao longo da cápsula do cristalino em direção ao polo posterior. Novas gerações de células de fibra sobrepõem gerações anteriores de células, criando cascas esféricas de fibras. Durante o processo de alongamento e maturação celular, as células fibrosas alteram substancialmente sua morfologia 11,12,16. Essas células fibrosas formam a maior parte da massa do cristalino 11,12,16,17,18.

Os mecanismos moleculares que contribuem para o estabelecimento de intrincadas microestruturas do cristalino, morfologia celular e organização celular única não são totalmente conhecidos. Além disso, a contribuição da cápsula da lente e da estrutura celular para a função geral da lente (transparência, mudança de forma da lente) não é clara. No entanto, essas relações estão sendo elucidadas por meio de nova metodologia de imagem e avaliações quantitativas das características estruturais e celulares do cristalino2,4,19,20,21,22. Novos protocolos para obtenção de imagens de lentes inteiras que permitem a visualização em alta resolução espacial da cápsula do cristalino, células epiteliais e células de fibras periféricas foram desenvolvidos. Isso inclui metodologia para quantificar a espessura da cápsula, o tamanho da célula, o tamanho e a circularidade do núcleo da célula, a ordem meridional da linha, o empacotamento da célula da fibra e a largura da célula da fibra. Esses métodos de visualização e quantificação de imagens permitem um exame morfométrico aprofundado e têm vantagens sobre outros métodos de visualização (imagens de montagens planas ou cortes de tecido) por preservarem a estrutura global do tecido 3D. Esses métodos têm permitido o teste de novas hipóteses e permitirão o avanço contínuo na compreensão do desenvolvimento e da função do padrão celular do cristalino.

Para os experimentos a seguir, utilizamos camundongos selvagens e Rosa26-tdTomato tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) no fundo C57BL/6J entre as idades de 6 e 10 semanas, de ambos os sexos. Os camundongos tdTomato permitem a visualização das membranas plasmáticas celulares em lentes vivas via expressão da proteína tdTomato fusionada aos 8 aminoácidos N-terminais de uma proteína MARCKS mutada que tem como alvo a membrana plasmática via miristilação N-terminal e sítios internos de cisteína-palmitoilação²³. Também usamos camundongos NMIIA^{E1841K/E1841K 24} obtidos originalmente do Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Como descrito anteriormente²⁰, camundongos NMIIA^{E1841K/E1841K} em FvBN/129SvEv/C57Bl6 de fundo que tem perda da proteína de filamento intermediário frisada CP49 (mantém a morfologia de células de fibra madura e biomecânica de lente inteira), são retrocruzados com camundongos selvagens C57BL6/J. Nós selecionamos a prole para a presença do alelo selvagem CP49.

As imagens confocais foram realizadas em microscópio confocal de fluorescência a laser com aumento de 20x (NA = 0,8, distância de trabalho = 0,55mm, zoom de 1x), 40x (NA = 1,3 objetiva de óleo, distância de trabalho = 0,2mm, zoom de 1x) ou 63x (NA = 1,4 objetiva de óleo, distância de trabalho = 0,19mm, zoom de 1x). Todas as imagens foram adquiridas usando um tamanho de orifício, que é um determinante da espessura da seção óptica, para 1 Unidade Airy (as espessuras ópticas resultantes são indicadas nas legendas das figuras). As imagens foram processadas no software Zen. As imagens foram exportadas para .tif formato e importadas para o software FIJI ImageJ (imageJ.net).

Protocol

Os camundongos são alojados na instalação animal da Universidade de Delaware, mantidos em um ambiente livre de patógenos. Todos os procedimentos em animais, incluindo a eutanásia por inalação de CO₂ , foram conduzidos de acordo com protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware (IACUC).

1. Preparação e imagem da montagem completa da lente

1. Fixação de lentes para imagens de montagem completa
   1. Após a eutanásia, enuclear os olhos e dissecar as lentes como descrito anteriormente²⁵. Após a dissecção, transfira as lentes imediatamente para solução salina tamponada com fosfato 1x fresco (PBS; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO_{4-7H 2}O; pH 7,4) à temperatura ambiente.
      NOTA: A morfologia celular pode ser alterada se as lentes forem armazenadas em PBS por um longo período de tempo, portanto, recomenda-se corrigir imediatamente dentro de ~10 min de dissecção.
   2. Para imagens de montagem inteira da região anterior do cristalino, fixe as lentes inteiras imergindo em 0,5 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% recém-fabricado em 1x PBS em um tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente. Após 30 min, lave as lentes 3x (5 min por lavagem) com 1x PBS. Prossiga para a etapa 1.2 ou armazene em 1x PBS a 4 °C. As lentes fixas podem ser armazenadas por até 5 dias.
   3. Para imagens de montagem completa da região equatorial da lente, fixe lentes inteiras imergindo em 0,5 mL de PFA 4% recém-feito em 1x PBS em um tubo de microcentrífuga à temperatura ambiente. Após 1 h, lave as lentes 3x (5 min por lavagem) com 1x PBS. Prossiga para a etapa 1.3 ou armazene em 1x PBS a 4 °C. As lentes fixas podem ser armazenadas por até 5 dias.
2. Montagem completa da região anterior do cristalino (fixa ou viva)
   1. Para obter imagens de montagem completa de lentes fixas, prossiga para a etapa 1.2.3.
   2. Para imagens de montagem inteira de lentes vivas, transfira as lentes para um poço de uma placa de 48 poços contendo 1 mL de Meio 199 (livre de fenol vermelho) contendo 1% de antibiótico/antimicótico. Incubar as lentes a 37 °C e 5% CO₂ até obter imagens. Antes da obtenção de imagens, incubar as lentes em uma solução contendo aglutinina de gérmen de trigo fluorescente (WGA-640, 1:500) e Hoechst 33342 (1:500) em meio 199 por pelo menos 10 min. Prossiga para a etapa 1.5.
   3. Para corar a cápsula do cristalino, a F-actina e os núcleos das lentes fixas, coloque as lentes em uma solução de 500 μL contendo WGA-640 (1:500), rodamina-faloidina (1:50) e Hoechst 33342 (1:500) em tampão de permeabilização/bloqueio (1x PBS contendo 0,3% de Triton, 0,3% de albumina de soro bovino (Fração V) e 3% de soro de cabra) em um tubo de microcentrífuga. Manchas de lentes a 4 °C durante a noite.
   4. Após a incubação durante a noite, lavar as lentes 3x (5 min por lavagem) com 1 mL de 1x PBS. Prossiga para as lentes de imagem.
   5. Para estabilizar a lente fixa para aquisição de imagens confocais, crie divots de imobilização da lente em agarose em uma placa de imagem, como descrito anteriormente²¹ (Figura 1).
      1. Aqueça e misture suavemente a agarose a 2% em PBS usando um micro-ondas até que a solução seja liquificada. Pipetar 250 μL de agarose liquefeito a 2% para uma placa de fundo de vidro (Figura 1A) e achatar a agarose em toda a placa usando uma lamínula plástica flexível (Figura 1B). Uma vez que a agarose esteja resfriada e totalmente solidificada, remova a lamínula usando pinça de ponta fina (Figura 1C) e use um punch de biópsia de 3mm para criar um orifício em agarose no centro da placa (Figura 1D).
      2. Remova o excesso de agarose usando uma limpeza de tarefa delicada (Figura 1E). Manter o molde de agarose hidratado com 1x PBS e manter a 4 °C até o uso. Os moldes de agarose foram armazenados com sucesso por até 1 semana.
   6. Usando pinça de embrião, transfira suavemente a lente viva ou fixa para a divot na agarose (Figura 1F), contendo ~2 mL de 1x PBS (lente fixa) ou Medium 199 livre de fenol vermelho (lente viva), e então coloque a placa em um estágio de microscópio invertido. Para confirmar se o cristalino está situado com a região anterior voltada para a objetiva, visualize a coloração dos núcleos. Se nenhum núcleo for observado, a região posterior pode estar voltada para o objetivo.
   7. Para inverter a lente, use pinça curva e gire suavemente a lente ~180° para que a região anterior fique voltada para a objetiva. Adquirir imagens usando um microscópio confocal.
   8. Para visualização das cápsulas das lentes, adquira imagens z-stack usando uma objetiva de 40x com um tamanho de passo de 0,3 μm. Adquirir a primeira imagem antes da superfície da cápsula do cristalino (indicada pela coloração WGA) e a última imagem após a superfície apical das células epiteliais. Para visualizar as células epiteliais, adquira imagens z-stack usando uma objetiva de 63x com um tamanho de passo de 0,3 μm para visualização das células epiteliais do cristalino.
      NOTA: Estes parâmetros microscópicos permitem a reconstrução tridimensional (3D) adequada das imagens, o que é essencial para a quantificação da espessura da cápsula ou da área celular epitelial. Também é possível obter imagens de suturas em lentes tdTomato de lente viva por meio de imagens passadas da monocamada de células epiteliais, como descrito^{anteriormente4}.
3. Coloração do epitélio equatorial e das células de fibras do cristalino
   1. Colocar as lentes fixas em uma solução de 0,5 mL de rodamina-faloidina (1:300), WGA-640 (1:250) e Hoechst 33342 (1:500) em solução de permeabilização/bloqueio (BSA 3%, soro de cabra a 3% e Triton a 0,3%) dentro de um tubo de microcentrífuga. Manter a 4 °C durante a noite.
   2. Após a incubação durante a noite, lavar as lentes 3x em 1mL 1x PBS (5 min por lavagem).
   3. Criar cunhas de agarose de imobilização do cristalino conforme descrito anteriormente ^4,10.
      1. Resumidamente, crie cunhas de agarose em pratos com fundo de vidro (FD35-100, WPI) despejando ~5-6 mL de agarose 2% derretida em 1x PBS em pratos (Figura 2A). Uma vez que a agarose se solidifique (Figura 2B), crie uma divot triangular com uma lâmina afiada (Figura 2C). Retire a cunha de agarose e coloque 1 mL de PBS 1x na placa de agarose (Figura 2D).
      2. Aspirar qualquer agarose residual que possa ser deixada para trás do corte da agarose. Várias cunhas podem ser criadas por prato para caber em vários tamanhos diferentes de lentes (não mostradas). Para armazenar o molde de agarose, coloque 1mL de 1x PBS no molde de agarose e mantenha a 4 °C. As cunhas podem ser mantidas por até 1 semana.
   4. Com pinça curva, coloque a lente dentro de uma cunha de agarose contendo 1mL de PBS 1x e ajuste de modo que a região equatorial da lente fique voltada para o vidro do microscópio acima da objetiva confocal (Figura 2E-F). Para confirmar que a região equatorial está em foco, visualize os núcleos e certifique-se de que os núcleos estejam alinhados em fileiras no equador. As células epiteliais equatoriais também podem ser identificadas por estarem irregularmente embaladas e formadas. Além disso, as células da linha meridional são precisamente alinhadas e com forma hexagonal, indicada pela coloração de F-actina nas membranas celulares.
   5. Se os núcleos no campo de visão são aleatoriamente empacotados, o lado anterior da lente está voltado para a objetiva. Se os núcleos não puderem ser observados, então o lado posterior da lente provavelmente está voltado para a objetiva. Se a lente não estiver sentada em seu equador, reoriente-a e use a pinça curva para girar a lente até que os núcleos precisamente alinhados no equador da lente sejam observados.
   6. Imagem do epitélio equatorial e das células de fibras do cristalino usando um microscópio confocal de varredura a laser (objetiva de 20x, NA = 0,8, tamanho do passo de 0,5 μm e/ou objetiva de óleo de 40x, NA = 1,3, tamanho do passo de 0,4 μm). Gire as imagens antes da coleta da pilha z, na qual as células epiteliais equatoriais estão na parte superior, seguidas pela linha meridional e células de fibra logo abaixo.

2. Metodologia de análise de imagens

1. Medição da espessura da cápsula da lente
   1. Usando imagens z-stack obtidas com uma objetiva de 40x (tamanho de passo de 0,3 μm) de lentes tdTomato vivas marcadas com WGA ou lentes fixas marcadas com WGA e rho-faloidina, obtenha uma projeção óptica 2D na visualização XZ da reconstrução 3D e salve em .tif formato. Processe imagens usando o software Zen.
   2. Abra imagens de fatia XZ (.tif) no software FIJI ImageJ.
   3. Para medir a espessura da cápsula da lente, use a função de linha reta (representada na Figura 3A,B). Defina a largura da linha para 50 pixels selecionando Editar opções de > > Largura da linha. Essa largura de linha foi determinada empiricamente para fornecer uma alta relação sinal-ruído com os ajustes do microscópio. A largura ideal da linha pode diferir em outros microscópios/configurações de microscópio ou ao usar lentes de outras espécies. Em seguida, traçar uma linha da superfície superior da cápsula até abaixo da região basal das células epiteliais.
   4. Salve a linha como uma região de interesse pressionando Ctrl + T.
   5. Separe os canais em guias para canais de imagem, cor e divisão.
   6. Meça a intensidade ao longo da linha do canal da cápsula pressionando Ctrl + K.
   7. Em planilha, plotar valores de intensidade em função da distância e determinar picos de intensidade para a cápsula e F-actina, que representam a superfície da cápsula e a região basal das células epiteliais, respectivamente. No eixo x está a distância da linha.
   8. Em seguida, calcule a espessura da cápsula determinando a distância entre os picos de intensidade fluorescente da cápsula e do epitélio (Figura 3C, D).
2. Análise da área celular
   1. Usando imagens z-stack obtidas usando uma lente objetiva de 63x (NA = 1,4; 0,3 μm de tamanho de passo) em lentes tdTomato vivas ou lentes fixas marcadas com faloidina, analise um corte de visão XY a partir de uma imagem confocal z-stack correspondente a onde a região média (lateral) das células epiteliais está em foco. Observe que as membranas laterais são visíveis usando o corante tdTomato ou visualizando faloidina que estão presentes nas membranas celulares laterais.
      NOTA: Devido à curvatura da lente (como visto em uma visão XZ; Figura 4A-C), nem todas as células epiteliais estarão em foco na imagem. A região média do epitélio corresponde à região onde se concentram as membranas laterais das células (Figura 4D-E) e os núcleos (Figura 4G-I).
   2. Exporte a imagem como um .tif e abra-a no FIJI ImageJ.
   3. Para definir a escala no FIJI ImageJ para análise, use a ferramenta de linha para criar uma linha que seja o comprimento de uma barra de escala da imagem confocal.
   4. Registre o comprimento do pixel da linha e o comprimento da barra de escala. Vá para Analisar no menu da barra de ferramentas e selecione Definir escala. Insira o número de pixels que é o comprimento da linha em Distância em Pixels e na Distância Conhecida insira o comprimento conhecido da barra de escala.
   5. Usando a coloração tdTomato ou rodamina-faloidina como uma indicação de limites celulares, contorne manualmente uma população de células que estão em foco dentro da imagem usando a ferramenta poligonal. Somente células traço onde as membranas laterais são visíveis (Figura 4E) e evitar o rastreamento de células parcialmente visíveis (ou seja, na borda das imagens). Salve o ROI pressionando Ctrl+T. Vá para Editar no menu da barra de ferramentas e selecione Limpar fora. Agora meça a área total da célula (ROI) pressionando Ctrl + M no FIJI ImageJ.
   6. Calcule a área média da célula dividindo a área de ROI pelo número total da célula. Uma maneira simples de determinar o número de células é contando o número de núcleos. Vá para o canal dos núcleos (azul). No menu ROI, selecione o contorno de ROI salvo das células (Figura 4G). Limpe fora do ROI indo para Editar e clicando em Limpar fora (Figura 4H). Usando a ferramenta Multiponto, conte os núcleos clicando em núcleos individuais.
3. Análise da área nuclear celular e da forma
   1. Para análise da área e forma dos núcleos, analise uma seção óptica de visão plana XY a partir de uma imagem confocal z-stack correspondente a onde a região média (lateral) das células epiteliais tdTomato está em foco. Analise um corte z-stack a partir de uma imagem confocal onde a área nuclear é maior (Figura 5A); este representa a porção média dos núcleos.
      NOTA: Observe que devido à curvatura da lente, nem todos os núcleos estarão em foco, como pode ser visto na visão XZ (Figura 4G e Figura 5A).
   2. Selecione uma subpopulação de núcleos que estão em foco e salve um ROI.
   3. Use a função Limpar Exterior . Dentro da ROI, usando a ferramenta de seleção à mão livre (quarto botão de menu à esquerda), trace cuidadosamente as bordas dos núcleos (Figura 5B). Salve cada traço nuclear na janela ROI pressionando Ctrl+T. Apenas os núcleos delineados onde os núcleos completos podem ser vistos, e os núcleos não estão se tocando.
   4. Uma vez que todos os núcleos estejam delineados, meça a área nuclear e a forma das células individuais (isto é, circularidade) pressionando Ctrl+M.
   5. Copie e cole os dados em uma planilha e calcule a área nuclear média e a circularidade (Figura 5C).
4. Empacotamento epitelial da fileira meridional
   1. Para medir a desordem da fileira meridional, adquira imagens usando uma objetiva de 20x (tamanho do passo de 0,5 μm).
   2. Identificar o fulcro/modíolo da lente nas imagens. O fulcro é a região onde as pontas apicais das células epiteliais alongadas se contraem para formar um ponto de ancoragem durante a diferenciação e alongamento inicial das células fibrosas no equador. Identifique o fulcro com base na intensidade brilhante da F-actina (indicada pela ponta de seta na vista XZ na Figura 6A; indicada por uma linha tracejada vermelha na Figura 6B) e na mudança na organização celular em uma única seção óptica na visualização XY.
      NOTA: Além disso, a coloração de F-actina das regiões basal e apical das células epiteliais é aparente acima do fulcro, enquanto apenas a região basal das células alongadoras é aparente abaixo do fulcro (Figura 6A). As células epiteliais acima da linha do fulcro são irregularmente compactadas e tendem a formar rosetas, enquanto as células fibrosas abaixo do fulcro estão dispostas em fileiras paralelas, indicadas pela coloração brilhante de F-actina na membrana (Figura 6B).
   3. Uma vez identificado o fulcro em camundongos com 2 meses de idade, selecione a única seção óptica ~4,5-5 μm periférica ao fulcro (em direção à cápsula da lente) no plano XY. Essa distância é selecionada com base na observação de que todos os núcleos das células da fileira meridional em camundongos de 2 meses de idade estão em foco quando são ~5 μm periféricos ao fulcro. Salve a única seção óptica (.tif). Abra a imagem no FIJI.
      NOTA: Esta análise só foi realizada em ratinhos com 2 meses de idade e, portanto, não se pode concluir se esta distância muda com a idade.
   4. Antes de realizar a análise das imagens, defina a escala para μm no ImageJ usando a etapa 2.2.2.
   5. Delineie manualmente todas as regiões da linha meridional usando a ferramenta de linha livre (região de interesse/ROI) identificando o alinhamento nuclear, como mostrado na Figura 7A. Salve o ROI pressionando Ctrl+T. Vá para Editar no menu da barra de ferramentas e selecione Limpar fora. Meça a área total da célula (ROI) pressionando Ctrl + M no FIJI ImageJ.
   6. Identifique quaisquer regiões de desordem indicadas pela coloração de F-actina delineando usando a ferramenta de linha à mão livre no FIJI ImageJ. Os critérios para regiões desordenadas incluem ramificação de linhas, empacotamento irregular e desalinhamento de linhas (Figura 7B), como mostrado anteriormente²⁰.
   7. Meça a área desordenada delineada/corrigida pressionando Ctrl + M no FIJI ImageJ. Somar a área total desordenada em uma planilha.
   8. Divida a área total desordenada pela área de ROI e, em seguida, multiplique por 100 para obter um percentual de área desordenada. Se nenhum distúrbio for observado, coloque um valor de 0% para a área desordenada.
5. Número de linhas meridionais de células vizinhas
   1. Para medir o número de células vizinhas, utilizar imagens coradas com F-actina adquiridas com objetiva de óleo de 40x (tamanho de passo de 0,4 μm).
   2. Identificar uma seção óptica (plano XY) na região basal das células da fileira meridional para dentro da cápsula da lente, onde a F-actina é enriquecida em torno de todo o perímetro das células da fileira meridional, todas as células da fileira meridional estão em foco e estão no mesmo plano.
   3. Conte o número de células adjacentes que cada célula de linha meridional tem (Figura 8). Meça a porcentagem média de células com seis células adjacentes em uma planilha.
      Observação : determine o número de células adjacentes com uma objetiva de 20x. No entanto, é significativamente mais fácil observar a forma do hexágono com uma objetiva de 40x.
6. Análise de imagens de células de fibras equatoriais
   1. Tome imagens confocais z-stack de lentes coradas com rodamina faloidina com uma objetiva de 20x (tamanho de passo de 0,5 μm).
   2. Identificar o fulcro conforme indicado no passo 2.4.2. Uma vez identificado o fulcro, selecione uma única seção óptica. Para fins de padronização e comparação entre as lentes, quantificar a largura das células de fibra ~10 μm para dentro do fulcro no plano XY (Figura 9A).
   3. Exporte imagens brutas para o FIJI ImageJ. No FIJI ImageJ, desenhe uma linha (geralmente ~300-400 μm de comprimento) através de várias células de fibra adjacentes para medir a distância entre os picos corados com F-actina (análise de varredura de linha; Figura 9A; linha rosa).
   4. Obtenha a intensidade fluorescente sobre a distância de varredura de linha em FIJI pressionando Ctrl+K. Em seguida, exporte os dados para a planilha para calcular a distância interpico (exemplo mostrado na Figura 9A-B). Isso corresponde às larguras das células de fibra.

Results

Cápsula anterior do cristalino, área celular epitelial e área nuclear
Para analisar a espessura da cápsula do cristalino, foram coradas as cápsulas do cristalino, em lentes vivas ou fixas, com WGA. Identificamos células epiteliais do cristalino marcando membranas com tdTomato em lentes vivas (Figura 2A), ou via coloração de rodamina-faloidina para F-actina nas membranas celulares em lentes fixas (Figura 2B). Em uma projeção ortogonal (XZ), a coloração para WGA e tdTomato/rodamina-faloidina nos permite realizar análise de varredura de linha pico-a-pico da intensidade de fluorescência. O pico maior no canal WGA indica superfície capsular, enquanto o pico maior no canal tdTomato/rodamina-faloidina indica a região basal das células epiteliais. Calculando-se a distância entre esses picos, pode-se obter a espessura capsular. A análise de varredura de linha mostra que as cápsulas de uma lente viva de camundongos de 9 semanas tinham uma espessura de 11,2 μm, e as cápsulas de uma lente fixa de camundongos de 9 semanas tinham uma espessura de 12,5 μm. Essas espessuras de cápsulas observadas são representativas de achados prévios ^2,4.

A imagem de montagem inteira de lentes transgênicas de camundongo marcadas com tdTomato (ou lentes coradas com rodamina-faloidina; não mostradas) permite a visualização ao vivo da morfologia das células epiteliais. A projeção ortogonal (XZ) fornece uma visão lateral da célula epitelial do cristalino, enquanto a visão plana (XY) nas regiões laterais permite a visualização da forma poligonal epitelial. Em lentes saudáveis, não observamos lacunas entre as células. Podemos calcular a área celular média traçando uma população de células em uma imagem e dividindo a área pelo número de células dentro da ROI. O número de células é determinado pela contagem do número de núcleos corados com Hoechst em uma dada ROI. A análise demonstra uma área celular média de 260^μm2, o que está de acordo com estudos prévios ^2,4.

A coloração Hoechst dos núcleos também permite o exame da morfometria nuclear das células epiteliais do cristalino em células epiteliais. As projeções ortogonais (XZ) permitem uma visão lateral dos núcleos. A vista planar (XY) demonstra as formas circulares/elipsoides dos núcleos. O rastreamento de núcleos permite calcular a área nuclear de células individuais e outros parâmetros de forma, como circularidade. A análise demonstra uma área nuclear média de 64 μm² com circularidade média de 0,8. Circularidade valores próximos a 1 indicam um círculo perfeito, enquanto valores próximos a 0 indicam uma morfologia mais alongada.

Empacotamento de células epiteliais equatoriais, empacotamento hexagonal de células de fibra e larguras de células de fibra
A visão planar (XY) da região equatorial do cristalino demonstra células epiteliais do cristalino em forma de hexágono e regularmente embaladas que convergem para o fulcro. O fulcro é onde as pontas apicais das células epiteliais alongadas se contraem para formar um ponto de ancoragem durante a diferenciação e alongamento inicial das células fibrosas no equador 4,13,14,15 (Figura 6B, indicada por uma linha tracejada vermelha). O fulcro pode ser localizado a partir do aumento da coloração de F-actina formando uma linha contínua separando as células epiteliais equatoriais e as células fibrosas (Figura 6B, linha tracejada vermelha). A coloração de F-actina nas membranas celulares também demonstra mudanças na forma celular, na qual as células abaixo do fulcro estão precisamente alinhadas e dispostas em fileiras paralelas (Figura 6). Os núcleos celulares também estão alinhados abaixo do fulcro.

Para visualizar as células epiteliais da fileira meridional do cristalino e as células de fibras, uma imagem de 4,5-5 μm periférica ao fulcro (em direção à cápsula do cristalino) no plano XY, onde a região basal das células da fileira meridional está em vista, é selecionada conforme descrito anteriormente²⁰. Para medir o distúrbio da fileira meridional, uma região de interesse (ROI) é delineada (Figura 7A; caixa amarela). A área da ROI na imagem da lente wildtype é de 15.833 μm². Como não há transtorno observável, a área de porcentagem de desordem é 0. O papel crítico que a miosina IIA não muscular (NMIIA) desempenha no empacotamento hexagonal celular usando camundongos com mutação NMIIA-E1841K foi descrito anteriormente²⁰. A Figura 7A mostra uma imagem equatorial representativa da lente^{NMIIA E1841K/E1841K} para demonstrar distúrbio das células da fileira meridional. O ROI da linha meridional foi de 20.757μm2. Em seguida, foi traçada a área total das manchas desordenadas. A área total de desordem foi de 3.185 μm². O percentual calculado de transtorno foi determinado em 15,3% (área desordenada x 100/ROI total; Figura 7B). Esse percentual de área desordenada está dentro da faixa de um estudo anterior²⁰.

Em seguida, foi demonstrado um exame do empacotamento hexagonal em células selvagens da fileira meridional²⁰. Como a F-actina é enriquecida ao redor de todo o perímetro das células da fileira meridional e em todos os seis vértices das regiões basais das membranas celulares em lentes selvagens (ou seja, NMIIA^+/+), a coloração com F-actina foi usada para avaliar as formas celulares e a organização do empacotamento. Na imagem representativa 1, as células foram marcadas e o número de células adjacentes ao redor de cada célula foi contado. Na imagem 1, todas as dez células possuem seis células adjacentes, o que sugere que essas células estão dispostas em uma organização de empacotamento em favo de mel (Figura 8). Em contraste, oito em cada 10 células (80% das células) têm seis células adjacentes na imagem 2 que indicam que as células estão irregularmente embaladas (Figura 8).

Finalmente, para medir a largura das células fibrosas, as células fibrosas periféricas localizadas ~10 μm para dentro do fulcro em lentes fixas do tipo selvagem marcadas com rodamina-faloidina foram examinadas (Figura 9A)^2,4. Vale ressaltar que também é possível medir a largura das células de fibra usando camundongos tdTomato vivos, no entanto, o sinal de lentes heterozigotas para tdTomato tende a ser fraco nas regiões equatoriais. Portanto, o uso de camundongos homozigotos para tdTomato é recomendado, pois eles foram encontrados para ter fluorescência mais forte (não mostrado). A distância entre os limites celulares corados com F-actina usando análise de varredura de linha foi medida como descrito anteriormente para indicar a largura da célula de fibra ^2,4 (Figura 9B). Esta análise revelou que a distância média entre picos em lentes selvagens é de 11,45 ± 2,11 μm (N=117 células de fibra de 4 diferentes imagens de lentes de camundongo, Figura 9B).

Figura 1: Passos para criar divot de agarose para imobilizar a lente durante a aquisição de imagens. (A) Usando um prato de fundo de vidro, pipeta liquefeito 2% agarose. (B) Achatar com uma tampa flexível e (C) quando resfriado, remover com pinça de ponta fina. (D) Para a divot, criar um orifício usando um punch de biópsia de 3 mm. (E) Aspirar agaros residuais, enxaguar com PBS, limpar a superfície usando um tecido livre de fiapos. (F) Monte cuidadosamente a lente inteira dentro do divot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Passos para a criação de divot de agarose para obtenção de imagens de células epiteliais e fibras equatoriais do cristalino. (A) Despeje 2% de agarose derretida na placa de cultura de tecidos. (B) Resfriar a agarose em temperatura ambiente até solidificar completamente. (C) Com uma lâmina afiada, crie uma triangularidade. (D) Colocar 1 mL de 1x PBS na placa de cultura de tecidos. (E) Coloque a lente dissecada na cunha com (F) a lente apoiada em seu equador encravado entre as paredes de agarose (seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Determinação da espessura da cápsula do cristalino. Cortes ópticos sagitais (visão plana X, Z) a partir de reconstruções de pilhas z confocais de cápsulas de lentes (A) vivas e (B) fixas. A intensidade fluorescente da varredura de linha das lentes (C) vivas e (D) fixas demonstra um único pico WGA (verde) que corresponde à superfície superior da cápsula e à região basal das células epiteliais (vermelhas) adjacentes à cápsula. A distância entre os dois picos é medida para quantificar a espessura da cápsula. Imagens adquiridas usando uma objetiva de óleo de 40x com um orifício de 1 unidade airy resultando em cortes ópticos de 1,0 μm e 1,2 μm nos canais tdTomato/Rhodamine-Phalloidin e WGA, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Quantificação da área celular epitelial. (A) Vista plana X, Z das células epiteliais do cristalino marcadas com (B) tdTomato para membranas celulares e (C) Hoechst para núcleos. (D) Vista plana X, Y da região média das células epiteliais do cristalino. (E) o sinal tdTomato é usado como um guia para definir uma região de interesse correspondente a um grupo de células que estão em foco. (F) A área da região definida é determinada. (G) A coloração Hoechst para núcleos é usada para determinar o número de células dentro da região definida. (H) O número de núcleos é contado usando (I) a ferramenta multiponto do FIJI ImageJ. Para calcular a área celular média, divida a área total da região de interesse definida pelo número total de células. Imagens adquiridas usando uma objetiva de óleo 63x com um orifício de 1 unidade arejada resultando em seções ópticas de 0,7 μm e 1,0 μm nos canais Hoechst e tdTomato, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Determinação da área e forma nuclear. (A) Vista plana XY da região média dos núcleos. (B) Foi definida uma região de interesse onde os núcleos estão em foco. Os núcleos dentro da ROI são delineados. (C) A área e circularidade dos núcleos das células individuais foram tabuladas e médias de área e circularidade foram calculadas. Imagens adquiridas usando uma objetiva de óleo de 63x com um orifício de 1 unidade arejada resultando em uma seção óptica de 0,7 μm no canal Hoechst. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Identificação do fulcro do cristalino. A F-actina e os núcleos podem ser usados para identificar o fulcro e as fileiras meridionais. (A) A incidência XZ mostra coloração de faloidina enriquecida para F-actina que corresponde ao fulcro. (B) Seção óptica única de visão plana XY com o fulcro da lente em foco. A coloração de Hoechst para núcleos mostra que os núcleos acima do fulcro estão irregularmente compactados, enquanto os núcleos abaixo do fulcro estão precisamente alinhados (canto superior direito). A coloração de faloidina para F-actina mostra que as células acima do fulcro têm forma irregular, enquanto as células abaixo do fulcro são embaladas em fileiras paralelas (canto inferior esquerdo). A linha tracejada vermelha mostra a localização do fulcro. Imagens adquiridas com objetiva de 20x com orifício de 1 unidade arejada, resultando em cortes ópticos de 1,5 μm, 2,0 μm e 2,2 μm nos canais Hoechst, Rhodamine-Phalloidin e WGA-640, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Determinação do distúrbio da fileira meridional. (A) Seção óptica de visão plana XY única do wildtype e células da linha meridional NMIIA^{E1841K/E1841K} ~5 μm de distância do fulcro (em direção à cápsula da lente). Todas as células da linha meridional são delineadas em azul com base no alinhamento nuclear. A coloração de F-actina (vermelha) na lente selvagem mostra que as células da fileira meridional estão precisamente alinhadas sem sinais de desordem (0%). Uma região ordenada representativa em wildtype é delineada (laranja). Em lentes com células desordenadas, delineamos as regiões desordenadas (amarelo). (B) Alta ampliação da região ordenada do wildtype (caixa laranja em A). (C) Alta magnificação de áreas desordenadas mostrando diferentes tipos de desordem, incluindo (I) ramificação de linhas, (II) forma celular irregular e perda de embalagem de favo de mel, e (III) desalinhamento de linhas. Imagens da lente NMIIA^{E1841K/E1841K} mostram 15,3% de desordem das células da fileira meridional. Imagens adquiridas com objetiva de 20x com orifício de 1 unidade arejada, resultando em cortes ópticos de 1,5 μm e 2,0 μm nos canais Hoechst e Rodamina-Faloidina, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Análise do empacotamento do favo de mel de células da fileira meridional da lente. (A) Cortes ópticos XY únicos de células da fileira meridional corados com rodamina-faloidina para F-actina. Imagens de baixa ampliação (painel superior), mostram as células sendo avaliadas (numeradas em rosa). A região delineada em amarelo é ampliada (painel inferior). Os algarismos romanos amarelos são as contagens das células adjacentes. A Figura 1 mostra células que são todas hexágonas em forma, cada uma com 6 células adjacentes. A Figura 2 apresenta irregularidades com as células número 1 e 5 com 5 e 7 células adjacentes, respectivamente. (B) Os dados são registrados e tabulados com a porcentagem de células hexagonais calculada. Imagens adquiridas com objetiva de 40x com orifício de 1 unidade arejada, resultando em corte óptico de 1,0 μm no canal Rodamina-Faloidina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Análise da largura das células de fibra. (A) Seção de visão óptica XY única das células de fibra da lente ~10 μm do fulcro. As células foram coradas com rodamina-faloidina para visualização da F-actina nas membranas celulares. Uma linha (rosa; traço) é desenhada sobre um número de células de fibra. (B) Varredura de linha representativa das intensidades de F-actina em função da distância. A distância interpico representa a largura da célula da fibra. Imagens adquiridas com objetiva de 40x com orifício de 1 unidade arejada, resultando em corte óptico de 1,0 μm nos canais Rodamina-Faloidina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os protocolos descritos permitem a visualização em alta resolução espacial das estruturas e células periféricas do cristalino nas regiões anterior e equatorial do cristalino. Neste estudo, métodos para a visualização das estruturas periféricas das lentes usando lentes intactas (vivas ou fixas) onde a arquitetura geral da lente 3D é preservada foram mostrados. Adicionalmente, métodos simples para análise morfométrica quantitativa usando o software FIJI ImageJ disponível publicamente foram fornecidos. Os métodos de visualização e quantificação de toda a montagem foram utilizados em estudos prévios. Esses métodos permitiram compreender a resposta da cápsula anterior e das células à mudança de forma do cristalino ou ao envelhecimento ^2,4. Esses métodos também têm sido usados para examinar a expansão celular das fibras equatoriais devido à mudança da forma do cristalino ou ao envelhecimento ^2,4 e para determinar o papel do NMIIA no estabelecimento de formas hexagonais precisas e na organização celular periférica das fibras²⁰.

A imagem de montagem inteira permite imagens de alta resolução espacial na face da estrutura da lente. Na região anterior do cristalino, a imagem de montagem total é vantajosa em relação à imagem de montagem plana, evitando danos que podem alterar a integridade da estrutura da cápsula e/ou a morfologia celular epitelial. Além disso, a interface entre células epiteliais e fibras é preservada. Este método oferece vantagens sobre a visualização dos cortes do cristalino, pois a imagem em face proporciona maior resolução espacial e permite a análise da área celular epitelial e da área/forma nuclear da região selecionada (ou seja, médio-lateral, como mostrado aqui) ou de outras regiões das células. Além disso, os métodos de imagem permitem quantificar as características morfológicas em pontos específicos ao longo das regiões equatoriais do cristalino, permitindo a visualização de formas hexagonais, empacotamento de células da fileira meridional, fulcro e largura das células de fibra, o que não seria facilmente alcançável por cortes corados por imagem devido à falta de resolução espacial e distorção tecidual que pode ocorrer durante a secção.

Os protocolos delineados também permitem a obtenção de imagens de lentes vivas para rastrear estruturas e células específicas da lente ao longo do tempo. O protocolo de imagem em lente viva foi fundamental em um estudo anterior, onde foi realizada análise de medidas repetidas da espessura da cápsula e da área celular epitelial de uma subpopulação de células da mesma lente antes e após a compressão do cristalino para induzir o achatamento do cristalino⁴. Determinou-se que a compressão do cristalino induziu diminuição da espessura da cápsula e aumento da área das células epiteliais. Devido à variação substancial na espessura da cápsula e na área das células epiteliais entre as lentes individuais e a magnitude dos efeitos sobre esses parâmetros causados pela compressão do cristalino, seria difícil detectar diferenças se um desenho de medição independente fosse usado (isto é, comparando lentes individuais não comprimidas versus lentes comprimidas individuais). Usando os métodos de imagem ao vivo, imagens de montagem inteira em lentes vivas de camundongos que expressam endogenamente LifeACT-GFP²⁶ para visualizar a F-actina em células epiteliais²², que permite o rastreamento da reorganização da F-actina em células epiteliais vivas, foram conduzidas.

Enquanto os protocolos delineados foram desenvolvidos para imagens de lentes de camundongos e podem ser adaptados para visualizar estruturas de lentes em outras espécies, os protocolos de coloração para visualizar as estruturas periféricas anteriores e equatoriais em outras lentes de roedores (rato, cobaia), bem como em outras lentes de mamíferos (vaca, macaco e humano; dados não mostrados). A visualização das estruturas em lentes maiores requer fixação mais longa (4% PFA, no gelo, 4 h), bloqueio (1 h) e coloração (durante a noite, 4 °C). Vale ressaltar que as imagens em diferentes espécies foram realizadas apenas em lentes fixas. Imagens ao vivo de lentes de outras espécies podem ser desafiadoras, pois o protocolo de imagens ao vivo usa lentes de camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorogênicas. Portanto, esta imagem pode impedir a obtenção de lentes de outras espécies onde modificações genéticas não são comuns. No entanto, conseguimos realizar a visualização ao vivo das membranas celulares epiteliais do cristalino ou da F-actina por lentes de camundongo com a sonda lipofílica, FM4-64 ou uma sonda ligadora de F-actina, SiR-Jasplakinolide (SiR-actina), respectivamente (não mostrado). Pode ser possível usar essas sondas para obter imagens de lentes vivas de outras espécies. No entanto, deve-se ter cuidado ao usar essas sondas para evitar efeitos fora do alvo; por exemplo, SiR-Jasplakinolide pode levar a alteração da dinâmica da F-actina²⁷. Outra limitação dos métodos de coloração, seja em lentes vivas ou fixas, é que tais sondas têm penetração limitada. Portanto, os exames de imagem são limitados às regiões periféricas. É possível obter imagens de regiões internas (i.e., células de fibras profundas) usando lentes de camundongos transgênicos tdTomato⁴, que novamente dependem da expressão transgênica de proteínas fluorogênicas. A expressão também deve ser alta o suficiente para sinais brilhantes em células de fibras profundas.

No entanto, os protocolos delineados têm possibilitado a quantificação morfológica efetiva das características periféricas do cristalino2,4,20. As metodologias de quantificação são eficazes e usam software FIJI ImageJ de código aberto e disponível publicamente. Embora ferramentas de rastreamento manual tenham sido utilizadas para identificar regiões de interesse, pode ser possível automatizar a identificação de regiões de interesse. A automação pode ser tão simples quanto aplicar limiares fluorescentes para melhorar o contraste para a identificação baseada em FIJI ImageJ de estruturas específicas (ou seja, limites de núcleos), ou algoritmos de aprendizado de máquina mais complexos para detectar diferenças de forma de células (ou seja, formas irregulares de células epiteliais ou fibras). Análises mais complexas podem exigir plugins especializados ou software de geração de imagens. Plugins ou softwares especializados também podem permitir a obtenção de medidas morfológicas volumétricas 3D a partir de z-stacks adquiridos. Em geral, enquanto os métodos de quantificação descritos são facilmente acessíveis, custo-efetivos e adequados para^{muitas medidas de} desfecho úteis2,4,20, a plataforma de protocolos de imagem, em combinação com análises sofisticadas de software, poderia fornecer uma riqueza de medidas morfológicas adicionais para estudos futuros.

O cristalino é um tecido biológico intrincado com funções especializadas que dependem da localização e geometrias dependentes da profundidade das células e suas estruturas associadas. O uso dos protocolos de imagem e métodos de quantificação aqui demonstrados permitirá uma maior compreensão de como as estruturas do cristalino e a organização complexa do cristalino são estabelecidas. Além disso, os protocolos de imagem e os métodos de quantificação ajudarão a delinear as relações entre a estrutura e as funções do cristalino.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Punção de Biópsia de 3 mm	Acuderm Inc	NC9084780
Agarose	Apex BioResearch Products	20-102GP
Antimicótico/Antibiótico	Cytiva	SV30079.01
Albumina de Soro Bovino (Fração V)	Prometheus	25-529
Toalhetes de tarefa delicada	Kimwipe
( Fluorodish)World	Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Microscópio confocal de varredura a laser 880	Zeiss
MatTek Imaging Dish	MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldeído	Ciências de Microscopia Eletrônica	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Meio sem vermelho de fenol 199	Gibco	11043023
Rodamina-Faloidina	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R