Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Resumo

As vesículas extracelulares são imensamente promissoras para aplicações biomédicas, mas os métodos de isolamento atuais são demorados e impraticáveis para uso clínico. Neste estudo, apresentamos um dispositivo microfluídico que permite o isolamento direto de vesículas extracelulares de grandes volumes de biofluidos de forma contínua com passos mínimos.

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) têm imenso potencial para várias aplicações biomédicas, incluindo diagnóstico, entrega de medicamentos e medicina regenerativa. No entanto, as metodologias atuais de isolamento de EVs apresentam desafios significativos, como complexidade, consumo de tempo e necessidade de equipamentos volumosos, o que dificulta sua tradução clínica. Para resolver essas limitações, nosso objetivo foi desenvolver um sistema microfluídico inovador baseado em copolímero de olefina cíclica-off-estequiometria tiol-eno (COC-OSTE) para o isolamento eficiente de EVs de amostras de grande volume de forma contínua. Ao utilizar a separação baseada em tamanho e flutuabilidade, a tecnologia usada neste estudo alcançou uma distribuição de tamanho significativamente mais estreita em comparação com as abordagens existentes de amostras de urina e meios celulares, permitindo o direcionamento de frações específicas de tamanho de EV em aplicações futuras. Nosso projeto inovador de dispositivo microfluídico COC-OSTE, utilizando a tecnologia de fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico bifurcado, oferece uma abordagem de isolamento EV direta e contínua para amostras de grande volume. Além disso, o potencial de fabricação em massa deste dispositivo microfluídico oferece escalabilidade e consistência, tornando viável integrar o isolamento de EV em diagnósticos clínicos de rotina e processos industriais, onde alta consistência e rendimento são requisitos essenciais.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas ligadas à membrana derivadas de células que compreendem dois tipos principais: exossomos (30-200 nm) e microvesículas (200-1000 nm)¹. Os exossomos formam-se através do brotamento interno da membrana endossômica dentro de um corpo multivesicular (BVM), liberando vesículas intraluminais (ILVs) para o espaço extracelular após fusão com a membrana plasmática¹. Em contraste, as microvesículas são geradas pelo brotamento externo e fissão da membrana celular². Os EVs desempenham um papel crucial na comunicação intercelular, transportando proteínas, ácidos nucléicos, lipídios e metabólitos, refletindo o estado fisiológico da célula, incluindo crescimento, angiogênese, metástase, proliferação e resistência à terapia³. Como resultado, têm emergido como promissores biomarcadores e alvos terapêuticos para doenças, incluindo o câncer, destacando seu potencial em sistemas diagnósticos e de liberação de^fármacos4.

Para utilizar plenamente os EVs no diagnóstico e na terapêutica de doenças, o isolamento eficiente de vários biofluidos é crucial⁵. Métodos comuns incluem ultracentrifugação (UC), centrifugação por gradiente de densidade, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), filtração e imunoisolamento⁶. A RCU é uma técnica amplamente utilizada, mas pode produzir partículas de densidade semelhante que não são EVs e podem gerar agregados de EV⁷. A SEC ganhou popularidade devido à sua capacidade de fornecer amostras de maior pureza, excluindo partículas com base no tamanho em vez da densidade⁸. No entanto, a seleção cuidadosa do tamanho apropriado dos poros para a coluna SEC e a otimização das condições cromatográficas são essenciais para minimizar o co-isolamento de partículas indesejadas como quilomícrons e lipoproteínas de baixa densidade⁸. Apesar de sua eficácia, ambos os métodos são demorados e desafiadores de automatizar, especialmente para amostras de maior volume, como meio celular ou urina, limitando sua escalabilidade para aplicações industriais⁹.

Nos últimos anos, o fracionamento assimétrico do campo de fluxo (A4F) evoluiu como uma poderosa técnica de separação para a separação de partículas de tamanho e empuxo de micro e nanométricas¹⁰. O princípio operacional da A4F baseia-se em um canal microfluídico dotado de uma membrana porosa em sua base, gerando uma força exercida em direção à membrana denominada fluxo^{cruzado 10}. Quando combinado com o movimento browniano e o fluxo de Poiseuille inerentes ao sistema, o fluxo cruzado facilita a separação eficiente das partículas devido à variação da posição das partículas dentro da dinâmica do fluxo¹¹. Apesar dos benefícios, esse método é limitado a volumes de amostra dentro da faixa de microlitros¹² e requer uma etapa adicional de focalização, estendendo a duração do processo¹⁰.

Na última década, a microfluídica ganhou destaque como uma ferramenta para separação rápida, eficiente e clinicamente confiável^{de EV 13}. No entanto, a maioria dos métodos microfluídicos projetados para separação de EV são otimizados para amostras de EV de pequeno volume e alta concentração ou dependem de procedimentos de separação complexos¹⁴. Além disso, no campo da microfluídica, o polidimetilsiloxano (PDMS) é reconhecido como o material padrão-ouro devido à sua transparência óptica, biocompatibilidade e facilidade de uso¹⁵. No entanto, sua conhecida propensão a absorver pequenas moléculas lipofílicas, incluindo EVs, pode ser problemática para sua aplicação no campo dos^EV13.

O copolímero de olefina cíclica (COC) é um material frequentemente utilizado em microfluídica devido à biocompatibilidade, pequena absorção de moléculas e alta resistência química¹⁵. No entanto, a fabricação de dispositivos de AOC frequentemente envolve processos complexos ou equipamentos especializados¹⁶. Alternativamente, a estequiometria tiol-eno (OSTE) é uma alternativa promissora ao PDMS devido à diminuição da absorção de pequenas moléculas, estabilidade química superior, facilidade de fabricação e processo de fabricação escalável^17,18. No entanto, devido às conexões complexas com a tubulação, os dispositivos podem ser propensos a vazamentos¹⁹.

O objetivo deste estudo foi projetar e fabricar um dispositivo microfluídico combinando OSTE e COC e o princípio A4F bifurcado para separação de EV de amostras de grande volume, como urina ou meios celulares.

Protocolo

A coleta de amostras foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Ciências da Vida e Ciências Médicas da Universidade da Letônia (decisão N0-71-35/54)

NOTA: Os materiais utilizados neste estudo estão incluídos no arquivo Tabela de Materiais .

1. Fabricação de molde impresso tridimensional (3D)

1. Projete um molde duplo negativo em forma de serpentina em software CAD com as seguintes dimensões para o canal superior: altura de 0,5 mm, largura de 1 mm e comprimento de 210 mm. Para o canal inferior, use o mesmo design com largura de 1,5 mm, altura de 0,6 mm e comprimento de 210 mm. Dimensões como largura do molde, comprimento, altura e ilustração isométrica do projeto são mostradas na Figura 1. Salve o design como arquivo .stl.
2. Preparar o arquivo no Z-Suite; nenhum suporte precisa ser adicionado. Imprima os moldes usando uma impressora 3D com display de cristal líquido ultravioleta (UV LCD) com resina preta resistente.
3. Após a impressão, remova cuidadosamente os moldes da superfície da impressora. Lavar os moldes em isopropanol (IPA) em sonicação por 20 min.
4. Secar as formas com N₂.
5. Exponha os moldes à exposição à inundação usando um filtro ND33 por 810 s e, em seguida, coloque-os em um forno a 60 °C por 48 h.

2. Preparação dos moldes PDMS

1. Peso PDMS na proporção 10:1 p/p (para cada molde, use 16 g de base de elastômero e 1,6 g de reticulante). Misture os componentes em um misturador centrífugo planetário, misturando por 1 min a 500 RPM.
2. Lançar o PDMS misto nos moldes impressos em 3D e desgaseificar em um exsicador a vácuo a -800 mbar por 30 min ou até que nenhuma bolha seja observada.
3. Coloque cuidadosamente um forro de cloreto de polivinila de 100 μm de espessura sobre o PDMS líquido.
   NOTA: Aplique o forro lentamente de um lado para outro para evitar a formação de bolhas.
4. Insira o molde com PDMS em um gabarito molde no local e aperte o gabarito usando uma chave de torque ajustada para 0,3 Nm.
5. Coloque o gabarito em um forno de 60 °C por 3 h para curar o PDMS.
6. Desmonte o gabarito usando uma chave hexadecimal e remova o molde impresso em 3D do gabarito.
7. Desmolde cuidadosamente os moldes PDMS dos moldes mestres impressos em 3D, correndo ao redor das bordas do molde com um bisturi e, em seguida, removendo o molde com uma pinça.
   NOTA: Para facilitar a remoção do molde, o IPA pode ser usado; no entanto, os moldes precisam ser aquecidos a 60 °C por 10 min depois para evaporar o excesso de IPA.

3. Preparação do canal superior OSTE-COC

1. Peso OSTE na proporção de 1,09:1 w/w (para 5 dispositivos, são necessários 1,56 g de parte A e 1,44 g de parte B). Misture os componentes em um misturador centrífugo planetário: misture por 5 min a 750 RPM, depois desgaseifique por 5 min a 750 RPM.
2. Transfira o OSTE misto para um tubo de centrífuga e desgaseifique a -800 mbar em um exsicador a vácuo por 30 min.
3. Limpe as corrediças COC com 2 x 16 mini conectores Luer por sonicação em IPA por 10 min. Seque cuidadosamente as lâminas com N₂.
4. Coloque o COC limpo desliza no asher de plasma para que a superfície plana seja colocada para cima e trate a superfície com plasma de oxigênio 800 SCCM por 2 min a 700 W de potência com pressão de 0,133 mbar.
5. Coloque a lâmina de COC oxidada no molde de PDMS para o canal superior de modo que a superfície tratada fique em contato com a superfície estruturada do PDMS. Coloque o conjunto em um gabarito Mold-in-Place, apertando o gabarito com uma chave de torque ajustada para 0,3 Nm.
6. Conecte o sistema de pressão à linha de ar comprimido a 6 bar. Pegue o tubo da centrífuga com OSTE desgaseificado e monte-o de acordo com as instruções do sistema de pressão usando tubos de politetrafluoretileno (PTFE) com 0,8 mm de diâmetro interno (ID).
7. Conecte o tubo de PTFE à entrada do molde PDMS e, usando pressão de 1000 mbar mantida por uma bomba piezoelétrica localizada no sistema de pressão, encha o dispositivo. Coloque o gabarito com o lado de vidro para cima no alinhador da máscara e exponha com dose de 850 mJ usando o filtro ND33.
8. Após a exposição, desmonte o gabarito usando uma chave hexadecimal e remova cuidadosamente a lâmina COC com a camada OSTE estruturada do molde PDMS.
9. Coloque o OSTE estruturado em contato com uma membrana de 25 mm x 75 mm com poros de 50 nm e densidade de poros de 11,8% para que os canais sejam totalmente cobertos com a membrana.
   NOTA: É particularmente importante manter a membrana o mais reta possível durante o processo de aplicação.
10. Coloque o conjunto em uma placa quente regulada para 60°C com o lado da membrana para cima, coloque uma lâmina de vidro limpa sobre a membrana e aplique uma pressão de 1,6 kPa a partir da parte superior para garantir uma colagem uniforme. Aqueça o conjunto durante a noite.
    NOTA: Após esta etapa, é especialmente importante avaliar o desempenho da colagem e a deformação do canal.

4. Preparação do canal inferior OSTE-COC e montagem do dispositivo

1. Misture OSTE na proporção de 1,09:1 w/w (para 5 dispositivos são necessários 1,56 g de parte A e 1,44 g de parte B). Misture os componentes em um misturador centrífugo planetário: misture por 5 minutos a 750 RPM, depois desgaseifique por 5 minutos a 750 RPM.
2. Transfira o OSTE misto para um tubo de falcão e desgaseifique a -800 mbar em um exsicador a vácuo por 30 min.
3. Limpe as lâminas de COC por sonicação em IPA por 10 minutos. Seque cuidadosamente as lâminas com N₂.
4. Coloque as lâminas de COC limpas no asher de plasma e trate a superfície com plasma de oxigênio de 800 SCCM por 2 min a 700 W de potência com pressão de 0,133 mbar.
5. Coloque a lâmina de COC oxidada no molde de PDMS para o canal inferior de modo que a superfície tratada fique em contato com a superfície estruturada do PDMS. Coloque o conjunto em um gabarito Mold-in-Place, apertando o gabarito com uma chave de torque ajustada para 0,3 Nm.
6. Pegue o tubo de falcão com OSTE desgaseificado e monte-o de acordo com as instruções do sistema de pressão usando tubulação de PTFE com ID de 0,8 mm.
7. Conecte o tubo de PTFE à entrada do molde PDMS e usando 1000 mbar de pressão preencha o dispositivo. Coloque o gabarito com o lado de vidro para cima no alinhador da máscara e exponha com dose de 1100 mJ usando o filtro ND33.
8. Após a exposição, desmonte o gabarito usando uma chave hexadecimal e remova cuidadosamente a lâmina COC com a camada OSTE estruturada do molde PDMS.
9. Combine a camada OSTE estruturada com o conjunto do canal superior para que o design da camada superior e inferior esteja alinhado entre si e que a camada inferior OSTE esteja em contato com a membrana.
10. Insira o desenho em um gabarito Mold-in-Place e, usando clipes de buldogue, aplique uma pressão de 1,6 kPa no dispositivo uniformemente. Coloque o gabarito em um forno a 60°C durante a noite.
    NOTA: A colocação irregular dos clipes pode levar a uma ligação irregular.

5. Avaliação do dispositivo

1. Após a colagem, avalie visualmente os dispositivos com um microscópio para defeitos visuais, por exemplo, deformação do canal ou colagem malsucedida.
2. Teste os dispositivos sem defeitos passando 0,02 μm de água deionizada filtrada através dos canais com pressão de 30 mbar. Observe se há vazamentos no canal de fluxo e na porta Luer e no fluxo de água.
   NOTA: Se nenhum vazamento puder ser detectado e o fluxo do canal for ininterrupto, os dispositivos serão considerados utilizáveis para experimentos posteriores.

6. Configuração do dispositivo

1. Encha duas seringas de 5 mL com 2 mL de 20 nm filtradas a 3% H₂O₂ e encaixe-as em uma bomba de seringa (use as setas de movimento para a distância necessária, insira seringas e fixe-as no lugar com a barra superior).
   CUIDADO! Tenha sempre cuidado ao manusear H₂O₂. Use jaleco, luvas de borracha protetoras e proteção para os olhos.
2. Conecte a tubulação de PTFE ID de 800 μm de 14 cm de comprimento às seringas usando as agulhas da seringa e às entradas do dispositivo usando conectores Luer.
3. Conecte tubos de 20 cm de comprimento e 200 μm de poliéter éter cetona (PEEK) ID às tomadas.
4. Conecte a outra extremidade da tubulação PEEK a um contêiner de resíduos. A configuração pode ser vista na Figura 3.
5. Ligue a bomba de seringa à velocidade de fluxo de 500 μL/min para cada entrada (no ecrã do instrumento: Definições > Sistema Set > seringa (fabricante: seringa médica, seringa: 5 ml) > Botão Voltar > Parâmetros (Selecionar: infundir, Repetir: 1, Volume: 1,5 mL, Fluxo: 500 μL/min) > Botão Voltar > botão Voltar ). Recolha o fluxo num contentor de resíduos.
6. Encher duas novas seringas de 5 mL com 2 mL de etanol 70% filtrado a 20 nm.
7. Substitua as seringas anteriores pelas seringas cheias de etanol e ligue a bomba de seringas utilizando os mesmos parâmetros descritos no passo 6.5.
8. Use seringas novas de 5 mL e preencha-as com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato filtrado (PBS) de 20 nm.
9. Substitua as seringas anteriores pelas seringas cheias de PBS e lave o dispositivo com 4 ml de PBS repetindo os passos 6.1. e 6.5.
   NOTA: Certifique-se de alterar os parâmetros de configuração do sistema para Volume: 4 mL (na tela do instrumento: Configurações > Parâmetros > (Selecione: Volume: 4 mL).
10. Desconecte a tubulação do dispositivo e feche cada entrada e saída com plugues Luer.
    NOTA: Deixe o PBS no dispositivo e evite prender qualquer ar adicionando PBS adicional em cada entrada e saída usando uma micropipeta antes de fechar.
11. Deixe o dispositivo durante a noite em um lugar escuro à temperatura ambiente (TR).
12. No dia seguinte, lave o dispositivo preenchido com PBS com 4 mL de PBS filtrado a 20 nm (conforme descrito na etapa 6.8).
13. Recolher o último 1 ml do fluxo de ambas as saídas num tubo de baixa ligação de proteínas de 2 ml e armazenar a 4 °C como um vazio para as partículas introduzidas pelo dispositivo.
14. Remova as seringas cheias de PBS e substitua-as por novas seringas de 5 mL cheias de ar.
15. Purgar o dispositivo com 4 mL de ar até que todo o líquido tenha saído do dispositivo e da tubulação.

7. Teste do dispositivo com esferas de látex padronizadas

1. Preparar uma amostra de contas padronizada usando esferas de poliestireno de 1,0 μm e carboxilato de 0,1 μm. A um tubo de 15 mL, adicionar 500 μL de padrões de esferas de poliestireno de 1,0 μm, 1 μL de padrões de esferas de carboxilato de 0,1 μm e 9499 μL de PBS filtrado de 20 nm (a concentração final de mistura de contas de 1,0 e 0,1 μm será de 5 × 108 contas/mL e 3,6 × 1010 contas/mL respectivamente).
2. Vórtice a amostra de contas por 30 s e armazene-a a +4 °C enquanto não estiver em uso.
3. Encher uma nova seringa de 5 mL com 1,5 mL da mistura padronizada de contas e outra com 1,5 mL de PBS filtrado a 20 nm.
4. Retire as seringas previamente fixadas e fixe a seringa de mistura de contas à primeira tubulação de entrada e a outra à segunda entrada.
5. Remova o recipiente de resíduos e prepare pelo menos cinco tubos de microcentrífuga de 0,5 mL para cada tubo de saída.
6. Altere os parâmetros de partida do sistema de bomba de seringa para Volume: 1 mL; Vazão: 250 μL/min.
   NOTA: Dependendo das necessidades do usuário, diferentes velocidades de fluxo como 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min e 50 μL/min podem ser definidas. Recomenda-se um estudo preliminar para escolher a velocidade mais favorável para o resultado desejado.
7. Ligue a bomba de seringa e colete a saída - 5 a 6 gotículas em cada tubo de microcentrífuga.
   Observação : se o mesmo dispositivo for usado várias vezes, lave o dispositivo conforme descrito na etapa 6.8 e altere todos os conectores, plugues e agulhas. Lave os conectores, plugues e agulhas usados, deixando-os em etanol 70% filtrado a 20 nm por pelo menos 30 min. Em seguida, mova todas as partes para um tubo contendo água deionizada filtrada de 20 nm, agite o tubo completamente e transfira-as para uma placa de Petri contendo 20 mL de água deionizada filtrada de 20 nm. Deixe a placa de Petri na coqueteleira por pelo menos 30 min a 100 rpm, depois deixe as coisas secar em uma placa de Petri seca (por pelo menos 12 h) antes de reutilizar.

8. Teste do dispositivo com amostras de urina

1. Prepare o dispositivo conforme descrito nas etapas 6.1-6.15.
2. Coletar 100 mL de urina matinal por doador utilizando recipientes estéreis de urina e entregá-la ao laboratório para processamento em até 2 horas após a coleta.
3. Separe cada amostra de urina em dois tubos de 50 mL e centrifuja a 2.000 x g por 15 min no RT.
4. Recolher o sobrenadante e descartar o pellet.
5. Centrifugar o sobrenadante a 10.000 x g por 30 minutos em RT para se livrar de partículas grandes e detritos celulares.
6. Recolher o sobrenadante e descartar o pellet.
7. Lavar o dispositivo conforme descrito no ponto 6.6.
8. Troque as seringas de 5 mL por uma seringa de 20 mL preenchida com a amostra de urina preparada para a entrada da amostra e outra de 20 mL preenchida com 20 mL de DEPC-PBS filtrada a 20 nm para a entrada do tampão. Altere as configurações da bomba de seringa para BDPlastipak; Seringa: cc; Volume: 20 mL; Fluxo: 250 μL/min (caudal óptimo), da mesma forma que descrito no passo 6.2. Ligue a bomba de seringa e colete o fluxo de cada saída em tubos separados de 50 mL.
9. Concentrar cada fluxo separadamente utilizando 100.000 tubos de concentração de peso molecular a 100 μL cada a 3.000 x g a 4 °C.
10. Transfira os concentrados para tubos de microcentrífuga de 0,5 mL.
11. Vórtice as amostras concentradas por 30 segundos e, em seguida, gire por 10 segundos.
12. Aliquotar as amostras transferindo 25 μL de amostra por tubo, rotulá-las e congelar a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

9. Teste do dispositivo com mídia condicionada

1. Prepare o dispositivo conforme descrito nas etapas 6.1 a 6.15.
2. Cultivo de células em ambiente umidificado de 5% de CO₂ a 37 °C até que a contagem total atinja 100 milhões de acordo com Bajo-Santos et ^al.20 Passagem das células para um único frasco de suspensão de T175 em 100 mL de meio livre de soro suplementado com suplemento substituto de soro B-27 a 2% e cultura em ambiente umidificado de 5% de CO₂ a 37 °C por mais 48 h.
3. Recolher a suspensão celular e centrifuga-lo a 300 x g por 5 min em RT para se livrar das células.
4. Coletar e centrifugar o sobrenadante novamente a 3.000 x g por 30 min a +4 °C para se livrar de partículas grandes e detritos celulares.
5. Recolher o sobrenadante e armazená-lo a +4°C até que a separação possa ter lugar, mas não mais do que 3 h.
6. Troque as seringas de 5 mL por seringas de 20 mL preenchidas com o meio condicionado preparado para a entrada da amostra e preenchidas com 20 mL de PBS filtrado a 20 nm para a entrada do tampão.
7. Defina as configurações na estação de bombeamento conforme descrito na etapa 7.8.
8. Ligue a bomba da seringa e recolha o fluxo de cada saída num tubo separado de 50 ml.
9. Concentrar cada fluxo separadamente usando 100.000 tubos de concentração de peso molecular de corte para 150 μL cada a 3.000 x g a +4 °C.
10. Transfira os concentrados para tubos de microcentrífuga de 0,5 mL.
11. Vórtice concentrou amostras por 30 s.
12. Spin concentrado de amostras por 10 s.
13. Aliquotar as amostras transferindo 25 μL de amostra por tubo, rotulá-las e congelá-las a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

10. Isolamento de EVs por ultracentrifugação

1. Centrifugar 20 mL de urina ou meio celular condicionado a 100.000 x g por 70 min a +4 °C usando uma centrífuga com rotor de ângulo fixo.
2. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 20 mL de PBS filtrado a 20 nm.
3. Centrifugar novamente, como explicado em 10.1.
4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 12 mL de PBS filtrado a 20 nm.
5. Centrifugar a 100.000 x g por 70 min a +4 °C usando um rotor oscilante.
6. Descarte o sobrenadante.
   OBS: Tenha cuidado ao descartar o sobrenadante desta vez. Recomenda-se fazê-lo com uma pipeta.
7. Ressuspender o pellet em 100 μL de PBS filtrado a 20 nm.
8. Alíquota da amostra e proceder à seção 12 para caracterização do EV. Caso contrário, conservar a -80 °C até nova utilização.

11. Isolamento de EVs por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)

1. Concentrar 20 mL de urina ou meio celular condicionado a 500 μL usando unidades filtrantes centrífugas de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa a 3.000 x g a +4 °C por 15 min.
2. Transfira o concentrado para a coluna SEC (faixa de carga de 35 nm).
3. Despeje o PBS filtrado de 20 nm na coluna e colete 15 frações de 0,5 mL.
4. Analise frações com um sistema de espalhamento dinâmico de luz (DLS) seguindo as instruções do fabricante.
5. Reúna as frações selecionadas. Escolha frações com atenuador menor que 11 e pelo menos 30% do total de partículas sendo maior que 40 nm.
6. Concentrar frações selecionadas até 100 μL usando unidades de filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 3 kDa a 14.000 x g a +4 °C por 15 min.
7. Alíquota da amostra e prossiga para a seção 12 para caracterização do EV. Caso contrário, conservar a -80 °C até nova utilização.

12. Caracterização da VE

1. Retirar a amostra a caracterizar do congelador e descongelá-la lentamente (sobre um bloco de gelo ou a +4 °C).
2. Realizar análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para determinar a distribuição e quantidade de tamanho de partícula¹³. Realizar ensaio imunoenzimático duplo sanduíche de alta afinidade T-cell membrane protein 4 (TIM-4) (dsELISA)¹⁴ para confirmar a presença de EV nas amostras.

13. NTA

1. Vórtice a amostra de EV descongelada por 30 s e gire por 10 s, em seguida, transfira 1 μL para 999 μL de PBS filtrado de 20 nm em um tubo de microcentrífuga de 2 mL para diluí-lo 1000 vezes. Salve 1 mL de PBS extra usado para diluição para verificar se não contém partículas. Guarde tudo a +4 °C até à medição.
   NOTA: Filtre o PBS através de um filtro de 0,02 nm antes de usar.
2. Vórtice a amostra de EV ou em branco por 30 s e insira-a no módulo usando uma seringa. Encher o módulo com aproximadamente 0,7 mL de amostra e colocá-lo no instrumento.
3. Meça a amostra usando o instrumento analisador de nanopartículas seguindo as instruções do fabricante.

14. dsELISA para marcadores EV

1. Preparar uma solução de 1 μg/mL de proteína TIM4-Fc. Revestir os poços de uma placa ELISA de 96 poços transferindo 100 μL de solução para cada poço necessário e incubar durante a noite a +4 °C agitando a 200 RPM.
2. No dia seguinte, preparar a solução de lavagem (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl₂).
3. Descarte todo o líquido em cada poço. Lave cada poço adicionando 200 μL de solução de lavagem, agitando a 200 RPM por 5 min no TR e descartando. Repita esta etapa duas vezes.
4. Preparar solução de bloqueio (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% albumina de soro bovino. Adicionar 200 μL de solução de bloqueio a cada poço e incubar em TR por 1 h agitando a 200 RPM.
5. Lave bem cada um como descrito no passo 14.3.
6. Preparar 220 μL de cada diluição da amostra em tampão de lavagem (a concentração ideal de EV é de 2,7 × 10⁵ EVs/μL). Adicionar 100 μL da amostra diluída por poço e realizar duas repetições. Incubar em TR por 90 min enquanto agita a 200 RPM.
7. Lave bem cada um como descrito no passo 14.3.
8. Adicionar 100 μL de anticorpos correspondentes a cada poço. Use marcadores de VE adequados para confirmar EVs e contaminantes⁴. Incubar em TR por 2 h agitando a 200 RPM. NOTA: Se forem utilizados anticorpos secundários, repita os passos 14.7-14.8. No entanto, reduzir o período de incubação dos anticorpos secundários para 1 h.
9. Lave bem cada um como descrito no passo 14.3.
10. Adicionar 100 μL de substrato de peroxidase de raiz forte a cada poço, misturar a placa por 1 min e incubar em RT por 30 min.
11. Adicione 1 M H₂SO₄ a cada poço para parar a reação.
12. Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância a 450 nm.

Resultados

Fabricamos um dispositivo microfluídico usando um molde duplo negativo impresso em 3D (Figura 1) via litografia suave (Figura 2A) para separação EV de alto rendimento com base no princípio A4F bifurcado (Figura 2B,C). A configuração requer uma bomba e uma estação de passagem de fluxo, como pode ser visto na Figura 3, para o isolamento dos EVs de forma automatizada. Primeiramente, para avaliar a prova de conceito dos dispositivos, foi preparada uma mistura de esferas de poliestireno com diâmetros de 100 nm e 1000 nm para representar vesículas e restos de células finas, respectivamente¹⁰. Foram conduzidos experimentos com vazões variáveis para a mistura de cordões, com e sem fluxo bifurcante, para investigar o efeito da velocidade linear na eficiência de separação. Em todos os experimentos, a recuperação de pequenas esferas permaneceu consistente e acima de 90%¹⁰, mostrando o potencial do dispositivo para recuperar EVs.

Em seguida, avaliamos e comparamos o potencial do dispositivo COC-OSTE em isolar EVs de grandes volumes (>1 mL) de biofluidos complexos com pré-processamento mínimo. Assim, urina de 10 doadores saudáveis (Figura 4) e meios celulares de duas linhagens diferentes de células prostáticas (Figura 5) foram usados como molde para isolar simultaneamente EVs seguindo três procedimentos diferentes: ultracentrifugação (UC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e o dispositivo OSTE-COC baseado em microfluídica A4F. Após o isolamento, o número total de partículas e sua distribuição de tamanho foram avaliados usando a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Em média, o dispositivo OSTE-COC apresentou melhor recuperação total de partículas de biofluidos em comparação com a RCU, mas a significância estatística só foi alcançada quando se combinaram os números de partículas de ambos os portos (Figura 4A). Para comparar o desempenho do dispositivo com outros sistemas, deve-se levar em consideração a tomada R &L em conjunto. Como mostrado na Figura 4, o desempenho da saída L & R na recuperação de EVs supera a UC e a SEC. Separadamente, a porta L foi projetada para capturar a pequena fração de EV, enquanto a porta R foi projetada para coletar a fração maior de EV com outras moléculas de tamanho semelhante. Curiosamente, a recuperação usando o R-PORT do dispositivo OSTE-COC foi ligeiramente maior do que SEC e UC isoladamente (Figura 4A). A expressão de CD63 mostrou padrão semelhante (Figura 4C). Esse achado indica que o dispositivo OSTE-COC foi mais efetivo na recuperação total da VE. Distribuição de tamanho equivalente foi encontrada entre as diferentes metodologias, com exceção da UC, que mostra uma maior distribuição granulométrica (Figura 4B).

Resultados comparáveis foram observados em culturas de meios celulares. Em ambos os cenários, a recuperação total de partículas de ambas as portas do dispositivo exibiu desempenho superior em comparação com as metodologias SEC ou UC (conforme ilustrado na Figura 5A,B). Notadamente, os EVs derivados de células PC3 demonstraram uma distribuição de tamanho distinta, com maior homogeneidade na distribuição L-PORT quando contrastados com outros grupos experimentais (Figura 5C,D). Além disso, a análise da expressão de CD63 confirmou as maiores taxas de recuperação de EV obtidas com o uso do dispositivo COC-OSTE (conforme ilustrado na Figura 5E,F). Um resumo comparando as características de isolamento das diferentes metodologias examinadas neste estudo pode ser encontrado na Tabela 1.

Figura 1: Dimensões do molde duplo negativo em forma de serpentina 3DP e visão isométrica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dispositivo microfluídico COC-OSTE. (A) Esquema das diferentes etapas principais de fabricação do dispositivo OSTE-COC. (B) Princípio de funcionamento do dispositivo. (C) Imagem do dispositivo acabado. Barra de escala: 15 mm. Esse valor foi modificado com permissão de Priedols et ^al.10 e Bajo-Santos et ^al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Configuração experimental do dispositivo. A bomba de seringa está à esquerda, o dispositivo OSTE-COC está no meio e a estação de recuperação está à direita. Esse valor foi modificado com permissão de Priedols et ^al.10 e Bajo-Santos et ^al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Distribuição do tamanho do EV urinário e recuperação de partículas de 10 doadores usando ultracentrifugação (UC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e o dispositivo COC-OSTE. (A) Quantidade de partículas recuperadas de cada método de isolamento por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Dados representados como média +/- desvio padrão. Significância estatística denotada por * (p<0,05). (B) Boxplots mostram a distribuição média do tamanho das partículas entre todas as amostras de urina avaliadas por NTA, com whiskers indicando os valores mínimo e máximo. Os valores de p foram derivados das comparações com a RCU, com **** indicando alta significância estatística (p<0,0001). (C) A mediana e o intervalo da quantidade média de CD63, avaliados pelo ensaio imunoenzimático duplo-sanduíche (dsELISA), para cada método de isolamento, foram calculados em todas as amostras. L-port: Porta esquerda; R-port: Porta direita. Esse valor foi modificado com permissão de Bajo-Santos et ^al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Caracterização dos EVs isolados de células PC3 e LNCaP utilizando diferentes métodos. (A) Quantidade de partículas recuperadas do meio PC3 usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) representada por média+/- desvio padrão. (B) Quantidade de partículas recuperadas do meio celular LNCaP usando NTA representada como média +/- desvio padrão. (C) A distribuição granulométrica mediana dos EVs das culturas de PC3, juntamente com a amplitude, foi determinada por NTA. (D) Distribuição de tamanho mediana de EVs isolados de culturas LNCaP com intervalo. (E) Mediana e amplitude da expressão de CD63 para cada método de isolamento para EV derivado de linhagem celular PC3, usando ensaio imunoenzimático duplo-sanduíche (dsELISA). (F) Mediana e amplitude da expressão de EV CD63 derivada do LNCaP por dsELISA para cada método de isolamento. UC: Ultracentrifugação; SEC: Cromatografia de exclusão de tamanho; L-port: Porta esquerda; R-port: Porta direita. Esse valor foi modificado com permissão de Bajo-Santos et ^al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	UC	SEGUNDO	COC-OSTE
Tempo de processamento/amostra	++/+++	+++	+
Throughput	++	+	+++
Custo/amostra	+	+++	++
Pureza	+	+++	++
Automatização	++	+	+++
Rendimento EV	++	++	+++
Seleção de tamanho	+	++	++

Tabela 1. Comparação das características de isolamento dos EVs com os três métodos: UC, SEC e o dispositivo COC-OSTE. UC: Ultracentrifugação; SEC: Cromatografia de exclusão de tamanho. COC-OSTE: copolímero olefínico cíclico-fora-estequiometria tiol-eno. +: baixa; ++: médio; +++: alta. * Dispositivo dependente.

Discussão

O dispositivo microfluídico apresentado oferece um método promissor para o isolamento e extração de EVs de fluidos biológicos, abordando algumas das limitações críticas dos métodos padrão-ouro existentes, como UC e SEC¹². A UC e a SEC são conhecidas por serem trabalhosas, demoradas e sofrerem de baixo rendimento, tornando-as menos adequadas para aplicações de alto rendimento, onde grandes quantidades de EVs são necessárias^21,22. Em contraste, o dispositivo microfluídico descrito pode processar continuamente um volume substancial de até 20 mL de fluido biológico com entrada mínima do usuário, tornando-o um potencial divisor de águas para ambientes industriais ou clínicos. Uma das principais vantagens deste dispositivo microfluídico é sua capacidade de padronizar o isolamento de EV e melhorar a reprodutibilidade em comparação com métodos tradicionais que envolvem etapas manuais. Ao reduzir a variabilidade da fabricação de dispositivos de isolamento de veículos elétricos por meio da fabricação em massa, o desempenho do dispositivo pode ser melhor controlado e consistente, o que é vital para aplicações como terapêuticas e diagnósticos baseados em veículos elétricos. Além disso, a compatibilidade do dispositivo com a fabricação de grande volume por meio de moldagem por injeção de reação de substratos adequados aumenta ainda mais seu potencial de escalabilidade e adoção mais ampla.

Para garantir a reprodutibilidade e o desempenho consistente, é necessário um protocolo extenso e bem definido, tanto para a produção do chip quanto para sua utilização em experimentos. O chip é projetado com a industrialização em mente. No entanto, durante a fabricação do dispositivo em ambiente de laboratório, deve-se prestar atenção para evitar a formação de bolhas, garantir uma colagem precisa e robusta e realizar testes minuciosos em velocidades de fluxo mais altas do que as esperadas em experimentos reais. Essa precaução é especialmente importante para dispositivos COC-OSTE, pois eles podem ser propensos a vazamentos devido à ligação malsucedida, especialmente em taxas de fluxo mais altas. Além disso, como o OSTE é um material fotossensível, a fabricação do dispositivo deve ser realizada em luz amarela para evitar exposição desnecessária aos raios UV. Como essa tecnologia ainda está em seus estágios iniciais, os pesquisadores devem experimentar diferentes velocidades de fluxo para identificar o ajuste ideal para sua aplicação específica, uma vez que protocolos padronizados para esse novo método ainda não foram estabelecidos, e a viscosidade do líquido pode claramente afetar a eficácia do isolamento de EV com base em nossos resultados. Seguindo essas diretrizes e abordando os desafios da padronização, o potencial deste dispositivo microfluídico para isolamento de veículos elétricos pode ser totalmente realizado em várias áreas de pesquisa e aplicações.

O método de isolamento de EV usando o dispositivo microfluídico permite extensa modificação e solução de problemas para otimizar o desempenho. Para melhorar a separação de partículas, os pesquisadores podem explorar canais mais longos, diferentes porosidades de membrana e densidades de poros, e dimensões alteradas. Se houver muitas partículas grandes na saída de partículas pequenas, testar uma velocidade de entrada de buffer mais alta pode ser benéfico, enquanto se houver muitas partículas pequenas na saída de partículas grandes, recomenda-se experimentar um canal mais longo ou uma membrana com poros maiores. Abordar a absorção de partículas pode envolver o ajuste das velocidades de fluxo, modificações na superfície e composição OSTE ou alterar o tempo de exposição aos raios UV. Para dispositivos com instabilidade e vazamento, diminuir as velocidades de fluxo e garantir a colagem adequada são etapas cruciais. Para minimizar os danos do EV, os pesquisadores podem reduzir as velocidades de fluxo, lavar com PBS mais completamente após a esterilização do dispositivo e considerar o uso de poros de membrana menores ou técnicas e materiais alternativos de design de moldes. Através desses ajustes, o dispositivo microfluídico pode ser ajustado, liberando seu potencial para diversas aplicações em pesquisa de EV e campos relacionados. Além disso, para otimizar o desempenho do dispositivo, a caracterização da amostra a montante, incluindo medições de densidade e viscosidade, pode ser incorporada para ajustar os parâmetros de fluxo. Além disso, deve ser dada especial ênfase à natureza da amostra, dada a não esterilidade estabelecida dos biofluidos²³. Consequentemente, a esterilização de amostras antes de sua administração em aplicações clínicas deve ser devidamente considerada.

Apesar desses desafios, o dispositivo microfluídico possui imenso potencial em diversas áreas de pesquisa. Sua capacidade de isolar continuamente EVs de grandes volumes de amostras altamente heterogêneas abre as portas para automação, facilitando aplicações de alto rendimento e permitindo análises mais aprofundadas de EVs de diversas fontes. A integração desse módulo microfluídico em diferentes dispositivos, como cartuchos de biorreator de células ocas de fibra ou citômetros de fluxo de alta resolução, poderia tornar as aplicações de veículos elétricos mais amigáveis à indústria e impulsionar a inovação em campos como entrega de medicamentos, diagnósticos e cosméticos⁴. Em geral, este dispositivo microfluídico representa um avanço significativo no campo da pesquisa de EV, oferecendo um método eficiente e padronizado para isolamento de EV com aplicações promissoras em uma ampla gama de pesquisas e ambientes industriais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,1 µ m carboxilato FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Concentração de estoque: 3,6 x 1013 contas/mL (dependente do LOTE)
0,5 mL tubos de microcentrífuga	Starstedt	72.704
Seringa de cone Luer de 1 mL de uso único sem agulha	RAYS	TUB1ML
1.0 µ m poliestireno FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Concentração de estoque: 1 x 1010 contas/mL (dependente do LOTE)
10 mL Pipetas sorológicas	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra filtros centrífugos	Merck Millipore	UFC910024
2,0 mL Protein LoBind seringas	Eppendorf	30108132
20 mL	BD PlastikPak
250 µ Tubulação de poliéter éter cetona de identificação com m Darwin	Microfluídica	CIL-1581
3 kDa MWCO unidades de filtro centrífugo	Merck Millipore,	seringa médica de UFC200324
5 mL sem agulha	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
tubos cônicos de 50 mL	Sarstedt	62.547.254
rotor de ultracentrífuga de ângulo fixo de 70 Ti	Beckman Coulter
800 µ Tubo de politetrafluoretileno	de identificação com m Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
Microplaca de 96 poços, fundo f, ligação médica	Greiner Bio-One	655001	placa ELISA
B-27 Suplemento (50x), sem soro	Thermo Fisher Scientific	17504044
Albumina de soro bovino	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Plataforma	de lâminas de microscopia TopasPlataforma de microscopia Microfluídica	10000002
COC Topas 2 x 16 Mini Luer	Microfluídico Chipshop
Elveflow OB1 Elvesys	Group
Conectores Luer	Darwin Microfluídica	CS-10000095
Alinhador de máscara Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	analisador de nanopartículas
Microscópio óptico Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg grátis. Biorreagentes Fisher. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
PC membrana (diâmetro de poro de 50 nm, densidade de 11,8%)	it4ip SA, Louvain-La Neuve, Bélgica
Placas de Petri, estéril	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/coluna de 35 nm	Izon	SP5	SEC coluna
Kit de elastômero de silicone QSIL 216	PP & S
Resina Resistente	Preto Zortrax
SW40 Ti rotor de ultracentrífuga oscilante	Beckman Coulter	331301
Bomba de seringa	DK Infusetek	ISPLab002
T175 frasco de suspensão	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc proteína	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Substrato de peroxidase de rábano
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrífuga Optima L100XP	Beckman Coulter
Unidade de limpeza ultrassônica P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Espectrofotômetro	de microplacas universalCopo de coleta de urina Bio-Tek instruments	71777-1
, 150mL, estéril	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Sistema de	espalhamento dinâmico de luz (DLS) da Panalytical
Zortrax Inkspire	Zortrax