A aplicação de camadas de suporte a grades de microscopia eletrônica criogênica (crioEM) pode aumentar a densidade de partículas, limitar as interações com a interface ar-água, reduzir o movimento induzido pelo feixe e melhorar a distribuição das orientações das partículas. Este artigo descreve um protocolo robusto para o revestimento de grades de crioEM com uma monocamada de grafeno para melhorar a preparação de amostras criogênicas.
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Artigo de método
Aplicação do Grafeno Monocamada em Grades de Microscopia Crio-Eletrônica para Determinação de Estruturas de Alta Resolução
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na microscopia eletrônica criogênica (crioEM), macromoléculas purificadas são aplicadas a uma grade contendo uma folha de carbono holey; As moléculas são então borrifadas para remover o excesso de líquido e rapidamente congeladas em uma camada de gelo vítreo de aproximadamente 20-100 nm de espessura, suspensas em furos de folha de aproximadamente 1 μm de largura. A amostra resultante é imageada usando microscopia eletrônica de transmissão criogênica e, após o processamento da imagem usando software adequado, estruturas de resolução quase atômica podem ser determinadas. Apesar da adoção generalizada do cryoEM, a preparação de amostras continua sendo um gargalo severo nos fluxos de trabalho do cryoEM, com os usuários frequentemente encontrando desafios relacionados ao comportamento inadequado das amostras no gelo vítreo em suspensão. Recentemente, métodos têm sido desenvolvidos para modificar grades crioEM com uma única camada contínua de grafeno, que atua como uma superfície de suporte que frequentemente aumenta a densidade de partículas na área fotografada e pode reduzir as interações entre partículas e a interface ar-água. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para a aplicação de grafeno em grades crioEM e para avaliar rapidamente a hidrofilicidade relativa das grades resultantes. Adicionalmente, descrevemos um método baseado em ME para confirmar a presença de grafeno visualizando seu padrão de difração característico. Finalmente, demonstramos a utilidade desses suportes de grafeno reconstruindo rapidamente um mapa de densidade de resolução de 2,7 Å de um complexo Cas9 usando uma amostra pura em uma concentração relativamente baixa.
Introdução
A microscopia eletrônica criogênica de partícula única (crioEM) evoluiu para um método amplamente utilizado para visualizar macromoléculas biológicas1. Alimentado pelos avanços na detecção direta de elétrons 2,3,4, aquisição de dados5 e algoritmos de processamento de imagens 6,7,8,9,10, o cryoEM é agora capaz de produzir estruturas 3D de resolução quase atômica de um número crescente de macr....
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Protocolo
1. Preparação do grafeno CVD
- Prepare a solução de corrosão de grafeno conforme descrito abaixo.
- Dissolver 4,6 g de persulfato de amônio (APS) em 20 mL de água de grau molecular em um copo de 50 mL para uma solução de 1 M e cobrir com papel alumínio. Permitir que a SAF se dissolva completamente enquanto prossegue para a etapa 1.2.
- Preparar uma seção de grafeno CVD para revestimento de metacrilato de metila (MMA). Corte cuidadosamente uma seção quadrada de grafeno CVD. Transfira o quadrado para uma lamínula (50 mm x 24 mm) dentro de uma placa de Petri limpa e cubra durante o transporte para o revestidor de spin.
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Resultados
A fabricação bem-sucedida de grades crioEM revestidas com grafeno usando o equipamento (Figura 1) e o protocolo (Figura 2) aqui descritos resultará em uma monocamada de grafeno cobrindo os orifícios da folha, o que pode ser confirmado pelo seu padrão de difração característico. Para promover a adsorção de proteínas na superfície do grafeno, o tratamento UV/ozônio pode ser usado para tornar a superfície hidrofílica através da instalação de grupos funcionais conte.......
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Discussão
A preparação de amostras CryoEM envolve uma série de desafios técnicos, com a maioria dos fluxos de trabalho exigindo que os pesquisadores manipulem manualmente grades frágeis com extremo cuidado para evitar danificá-las. Além disso, a possibilidade de qualquer amostra ser vitrificação é imprevisível; As partículas frequentemente interagem com a interface ar-água ou com a folha de suporte sólida que sobrepõe as grades, o que pode levar as partículas a adotarem orientações preferenciais ou a não entrarem nos orifícios de .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos a revelar.
Agradecimentos
Os espécimes foram preparados e fotografados no CryoEM Facility em MIT.nano em microscópios adquiridos graças à Fundação Arnold e Mabel Beckman. Dispositivos de imagem de ângulo de contato foram impressos no MIT Metropolis Maker Space. Agradecemos aos laboratórios de Nieng Yan e Yimo Han, e à equipe do MIT.nano por seu apoio durante toda a adoção deste método. Em particular, estendemos nossos agradecimentos aos Drs. Guanhui Gao e Sarah Sterling por suas discussões perspicazes e feedback. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e 2046778 de bolsas NSF-CAREER. A pesquisa no laboratório Davis é apoiada pela Fundação Alfred P. Sloan, p....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Copo de 250 mL (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| Copo de 50 mL (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetona | Fisher | A949-4 | |
| Folha de alumínio | Fisher | 15-078-292 | |
| Persulfato de amônio | Fisher | (I17874 | |
| Lamínulas 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| Grafeno CVD | Graphene Supermarket | CVD--2x2 | |
| easiDescarga de brilho | Ted-Pella | 91000S | |
| Etanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Pinças de ponta plana | Fisher | 50-239-60 | |
| Grainger | 21UE26 | ||
| Placa e tampa de vidro petri | VWR | 75845-544 | |
| Pipeta sorológica de vidro | Fisher | 13-676-34D | |
| Estojo de armazenamento de grade | EMS | 71146-02 | |
| Placa quente | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Tesoura de laboratório | Fisher | 13-806-2 | |
| Metacrilato de Metila EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Corning | 46-000-CM | de água de grau molecular | |
| (2x) | Pipeta Fisher | 50-242-78 | |
| P20 | Pipeta Rainin | 17014392 | |
| P200 Rainin | 17008652 | ||
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pontas de pipeta | Rainin | 30389291 | |
| Grades Quantifoil com carbono furado | EMS | Q2100CR1 | |
| Revestidor de Spin | SetCas | KW-4A | com mandril SCA-19-23 |
| Termômetro | ULINE | H-6560 | |
| de Borda Reta | Limpador UV | 3LRD1 | |
| BioForce | SKU: PC440 | ||
| Dessecador a vácuo | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Papel Whatman | VWR | 28297-216 |
Referências
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife
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Reimpressões e permissões
