O estabelecimento de um modelo ortodôntico murino maxilar

Resumo

Demonstramos passo-a-passo um protocolo de movimentação ortodôntica manejável operado em um modelo maxilar murino. Com a explicação explícita de cada passo e demonstração visual, os pesquisadores podem dominar esse modelo e aplicá-lo às suas necessidades experimentais com algumas modificações.

Resumo

Devido à falta de protocolos reprodutíveis para o estabelecimento de um modelo ortodôntico murino de maxila, apresentamos um protocolo confiável e reprodutível para fornecer aos pesquisadores uma ferramenta viável para analisar a remodelação óssea associada à carga mecânica. Este estudo apresenta um fluxograma detalhado, além de diferentes tipos de diagramas esquemáticos, fotos de operação e vídeos. Realizamos este protocolo em 11 camundongos adultos tipo largo C57/B6J e colhemos amostras nos dias 3, 8 e 14 de pós-operatório. A micro-TC e os dados histopatológicos comprovaram o sucesso da movimentação dentária aliada à remodelação óssea utilizando este protocolo. Além disso, de acordo com os resultados da micro-TC nos dias 3, 8 e 14, dividimos a modelagem óssea em três etapas: fase de preparação, etapa de reabsorção óssea e etapa de formação óssea. Espera-se que essas etapas ajudem os pesquisadores preocupados com diferentes etapas a definir o tempo de coleta da amostra de forma razoável. Este protocolo pode equipar os pesquisadores com uma ferramenta para realizar análises regenerativas da remodelação óssea.

Introdução

O osso é um tecido reconstruído altamente ativo que adapta seu tamanho, forma e propriedades ao longo da vida do indivíduo ^1,2. Além dos hormônios, do envelhecimento, da nutrição e de outros fatores biológicos ou bioquímicos³, a ideia de que a carga mecânica é o fator mais determinante tem ganhado aceitação geral ^4,5. Em algumas circunstâncias com carga mecânica anormal, o desequilíbrio entre a reabsorção óssea e a formação óssea pode levar a remodelação óssea anormal e distúrbios ósseos. Doenças ósseas como osteoporose por desuso e perda óssea durante repouso prolongado no leito ou na presença de microgravidade em voo espacial têm estreita relação com carga mecânica anormal ^6,7,8.

A carga mecânica também tem sido utilizada no tratamento de doenças relacionadas ao osso, como o tratamento por distração e o tratamento ortodôntico. O tratamento por distração tem sido amplamente utilizado em doenças do desenvolvimento, como craniossinostoses e hipoplasias mandibulares9,10, enquanto o tratamento ortodôntico tem sido amplamente utilizado para corrigir anormais de posição dos dentes e qualquer má oclusão11. O cerne do tratamento ortodôntico é também o gerenciamento da carga mecânica. Quando o tecido ósseo é submetido a carga mecânica, um processo de remodelação óssea altamente coordenado é induzido pelo acoplamento da reabsorção óssea seguida da formação óssea, que pode mover os dentes para atingir o objetivo ortodôntico12,13.

Embora o tratamento ortodôntico tenha sido amplamente aplicado na prática clínica, como nosso conhecimento sobre os efeitos biológicos da carga mecânica é limitado, os resultados do tratamento ortodôntico são incontroláveis. Para superar essas limitações, vários modelos animais como camundongo, rato, coelho, gato, cão, macaco e porco foram estabelecidos para investigar o mecanismo subjacente da remodelação óssea induzida por carga mecânica (Tabela 1)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24^, 25,26,27,28,29,30,31,32. Animais de grande porte, como cães, macacos e porcos, têm algumas vantagens em relação aos pequenos animais na operação ortodôntica – eles têm dentes e dentição mais semelhantes aos humanos, de modo que o procedimento cirúrgico é fácil de replicar em humanos. Além disso, uma visão ampla pode reduzir a dificuldade da operação e possibilitar a aplicação de uma variedade de esquemas ortodônticos^33,34. No entanto, animais de grande porte são de difícil obtenção, levando a desafios relacionados ao tamanho da amostra, estando sujeitos a restrições éticas³⁵. Além disso, procedimentos rotineiros de extração e instrumentos complexos dificultam a realização de experimentos, devido aos quais animais de grande porte raramente são utilizados.

Nessas circunstâncias, os roedores são utilizados principalmente para estabelecer modelos ortodônticos. Dentre esses modelos, ratos e coelhos apresentam menor dificuldade operacional e mais esquemas de movimentação dentária em comparação com camundongos. No entanto, o modelo murino tem a vantagem única de haver um grande número de camundongos geneticamente modificados disponíveis, o que é especialmente crucial para investigar os mecanismos subjacentes³⁶. No entanto, o modelo murino é o modelo mais difícil de manipular devido ao seu pequeno tamanho. Revendo os métodos atuais, mover o primeiro molar na direção mesial é o único método prático para um modelo ortodôntico. Dois dispositivos são usados principalmente para mover a mola dental-bobina e faixa elástica. O uso de faixa elástica é mais fácil, mas a força ortodôntica varia muito, o que dificulta a obtenção de resultados estáveis.

Xu et ^al.15 estabeleceram um modelo murino com mola helicoidal na mandíbula. No entanto, devido à mobilidade da mandíbula e à natureza obstrutiva da língua, a operação na maxila é sempre a primeira escolha para considerações intra e pós-operatórias. Taddei et ^al.16 descreveram um protocolo mais detalhado sobre a maxila murina há 10 anos e mais detalhes visuais e pelúcidos devem ser adicionados. Em resumo, esse protocolo tem descrito sistematicamente um protocolo detalhado de movimentação ortodôntica em modelo murino de maxila para auxiliar os pesquisadores a dominarem o método de modelagem de forma padronizada e possibilitar a avaliação comparativa entre diferentes estudos.

Protocolo

Os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Camundongos adultos C57BL/6 foram utilizados neste estudo (ver Tabela de Materiais). Este protocolo adiciona carga mecânica ao primeiro molar superior direito (M1) para o movimento mesial, onde um processo de remodelação óssea altamente coordenado é induzido pelo acoplamento da reabsorção óssea e formação óssea (Figura 1).

1. Preparo pré-operatório

1. Itens cirúrgicos
   1. Preparar os seguintes itens cirúrgicos para a operação: plataforma cirúrgica (Figura 2A), fixador (Figura 2B), instrumental cirúrgico (Figura 2C e Figura Suplementar S1), material ortodôntico (Figura 2C) e material restaurador dentário (Figura 2D).
      NOTA: A mola helicoidal personalizada é feita sob medida e fornece uma força de 10cN quando esticada até 10 mm.
2. Esterilização
   1. Esterilizar os instrumentais cirúrgicos em autoclave e todos os itens cirúrgicos com irradiação ultravioleta por pelo menos 30 min.
3. Anestesia
   1. Anestesiar o camundongo administrando cetamina (100 mg/kg) e diazepam (5 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
   2. Aplique pomada veterinária nos olhos da murina com um palito de algodão para evitar o ressecamento dos olhos.
   3. Prossiga com a cirurgia apenas quando o rato não responder quando os dedos dos pés são pinçados com pinças.

2. Processo cirúrgico

1. Espalhe e tape os membros do camundongo anestesiado em decúbito dorsal até a plataforma cirúrgica com fita adesiva.
2. Fixe uma agulha de 27 G de cada lado acima da cabeça e outra agulha de 27 G de cada lado abaixo da axila.
3. Enrole um elástico ao redor das duas agulhas acima e dos incisivos superiores e outro ao redor de outras duas agulhas e dos incisivos inferiores. Trocar a posição da agulha para controlar o grau de abertura e a orientação da boca (Figura 3A).
   OBS: Para a operação de movimentação ortodôntica, mantenha a boca aberta ao máximo antes que o bucinador fique completamente apertado. A língua deve ser tracionada para o lado não operatório para expor o campo cirúrgico e prevenir isquemia.
4. Dobre a extremidade de 1,5 mm de um fio de aço inoxidável 304 cm e empurre a extremidade dobrada através do espaço interproximal entre M1 e o segundo molar superior (M2) do lado vestibular com pinça oftálmica curva (Figura 3B). Quando a extremidade palatal do fio de ligadura for vista do lado palatino, puxe-o até cerca de metade de seu comprimento e passe-o por uma extremidade da mola helicoidal personalizada.
5. Amarre um nó quadrado com as duas extremidades do fio da ligadura no sentido mesial da M1 maxilar até que a mola esteja firmemente fixada ao dente (Figura 3C). Subtraia o excesso de fio.
6. Da mesma forma, perfure um segundo fio de aço inoxidável 304 de 3 cm através da outra extremidade da mola helicoidal.
7. Limpe e seque as superfícies dos incisivos com bolas de algodão. Aplique adesivos em todas essas superfícies com palitos de algodão e cure-os à luz.
8. Empurrar o segundo fio de aço inoxidável através do espaço interproximal entre os incisivos superiores e amarrar um nó deslizante no sentido labial (Figura 3D). Subtraia o excesso de fio e faça com que o restante do fio fique próximo à superfície do dente.
9. Injetar resina fotopolimerizável para cobrir o nó e incisivos; fotopolimerizar a resina (Figura 3E).

3. Tratamento pós-operatório

1. Após a cirurgia, injetar nos camundongos 0,05 mg/kg de buprenorfina por via intraperitoneal para analgesia pós-operatória.
2. Coloque o rato anestesiado sobre uma manta eléctrica termostática a 37 °C. Quando o murino recuperar a consciência com a deambulação, devolva-o a uma gaiola de alojamento separada.
3. Devido ao funcionamento limitado dos incisivos após a cirurgia, substitua a forragem dura regular por apenas uma dieta macia.
4. Verifique os aparelhos ortodônticos todos os dias. Se alguma condição for observada durante a inspeção que afete a condução da força ortodôntica, como deformação da mola, soltura da mola e queda do dispositivo, o camundongo deve ser excluído do experimento.
5. A fim de manter a comparabilidade dos experimentos, avaliar o peso dos camundongos diariamente pós-cirurgia. Qualquer ratinho que apresente uma perda de peso superior a 30% do seu peso pré-operatório deve ser excluído da experiência.

Resultados

Realizamos a cirurgia OTM em 11 camundongos machos adultos (C57/BL6, 3 meses de idade). Eles foram eutanasiados para resultados nos dias 3, 8 e 14 pós-operatórios. Nesses experimentos, o lado maxilar direito é o lado da operação, enquanto o lado maxilar esquerdo é o lado controle. A micro-TC mostrou que houve aumento temporal consecutivo da distância entre M1 e M2: 30 μm, 70 μm e 110 μm nos dias 3, 8 e 14 pós-operatórios, respectivamente (Figura 4). O ligamento periodontal de baixa densidade...

Discussão

Neste trabalho, procuramos descrever passo a passo o protocolo ortodôntico mais simples de movimentação dentária em modelo murino maxilar para estudar os mecanismos latentes da remodelação óssea induzida por carga mecânica. Além das pesquisas sobre remodelação óssea, existem algumas outras aplicações mainstream desse método: 1) pesquisas metodológicas sobre a aceleração da movimentação ortodôntica; 2) pesquisa sobre reabsorção radicular ortodôntica; 3) mecanismos biológicos da movimentação dentária ortodôntica e da dor; ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Modelos Experimentais: Linhas de Mouse
C57/B6J	Gempharmatech Animais Experimentais Company	C57 / B6J
< forte > ensaios comerciais críticos< / forte > kit de
coloração de hematoxilina e eosina	Biosharp	BL700B
Masson' s Kit de mancha tricrômica	Solarbio	G1340
< forte > instrumentos< / forte >
27 G agulha	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrumentos Co. LTD.	SB1-074 (IV)
Adesivos	Minnesota Mining and Manufacturing Co., Ltd.	41282
Corkboard	DELI Group Co., Ltd.	8705
Bolas de algodão	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.
Varas de algodão	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R
	Chengdu Mingxing Spring Co., Ltd.	1109-02
Fórceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	nenhuma
resina fluida fotopolimerizável	Shofu Dental Trading (SHANGHAI) Co., Ltd.
Fotopolimerizador	Liang Ya Dental Equipment Co., Ltd.	LY-A180
	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	0008-2014
Tecido não tecido médico	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.
Porta-agulhas	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	nenhum
Elásticos	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	Tesoura cirúrgica 32X1
	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	nenhuma
pinça	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	nenhum

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