Cirurgia de Bypass Duodenal-Jejunal em Camundongos Diabéticos Obesos Induzidos por Dieta

A obesidade e o diabetes tipo 2 são as doenças crônicas mais comuns no mundo, e sua prevalência está aumentando entre os jovens¹. A cirurgia bariátrica é o tratamento mais eficaz para obesidade e diabetes, facilitando a estabilidade da glicose no sangue a longo prazo, além de melhorar as complicações associadas à obesidade ^2,3. Existem vários tipos de cirurgia bariátrica, classificadas por reduzirem o volume gástrico ou a absorção intestinal; estes incluem restritivo, malabsortivo e combinação ^4,5.

O bypass duodenal-jejunal (DJB) foi desenvolvido pela primeira vez por Rubino e Marescaux, que demonstraram que o diabetes tipo 2 poderia ser aliviado conectando o duodeno e o jejuno, em vez de reduzir o volume gástrico ^6,7. O DJB preserva todo o estômago e contorna todo o duodeno e jejuno proximal. O intestino é dividido em membros biliopancreáticos, digestivos e comuns ^6,8. O DJB compartilha algumas semelhanças com as cirurgias bariátricas, incluindo bypass gástrico em Y de Roux (BGYR), minibypass gástrico, bypass biliopancreático, desvio duodenal e gastrectomia vertical com DJB^{mais 9}. Comparado ao BGYR, o DJB não requer anastomose gastrointestinal, o que reduz o tempo operatório e melhora a taxa de sucesso do procedimento. O DBI é semelhante ao BGYR na melhora do metabolismo da glicose, mas não afeta o peso corporal¹⁰. Após a cirurgia de DJB, a entrega rápida de alimentos ao intestino delgado distal estimula a secreção do peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1), resultando em melhora do metabolismo da glicose^11,12.

O uso de modelos animais é essencial para a compreensão das vias metabólicas, celulares e moleculares. Modelos animais de cirurgia bariátrica têm contribuído para a compreensão dos potenciais mecanismos subjacentes à obesidade e ao diabetes^13,14. No entanto, devido às diferenças fisiológicas entre as espécies, é impossível replicar perfeitamente as doenças humanas em modelos animais¹⁵. Entre os vários modelos animais disponíveis para fins de pesquisa, o modelo de camundongo com obesidade induzida por dieta (DIO) se assemelha mais à obesidade humana e à síndrome metabólica¹⁶. Os camundongos foram selecionados para a cirurgia de DJB para determinar a viabilidade da cirurgia e fornecer técnicas para pesquisas futuras. Este manuscrito fornece um resumo abrangente dos aspectos técnicos e detalhes experimentais da cirurgia DJB.

Todas as etapas do protocolo descritas abaixo seguem as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral do Comando do Teatro Sul sob o número de aprovação 2020112501.

1. Preparação geral pré-operatória

NOTA: Trinta camundongos C57BL/6 machos de 6 semanas de idade foram comprados. Os camundongos foram alojados em um laboratório Specific Pathogen-Free (SPF) sob um ciclo claro/escuro de 12 h; temperatura de 22 ± 2 °C; e umidade, 55-65%. Os ratos tiveram acesso gratuito à água e foram alimentados com uma dieta de 60% de gordura por 6 semanas para induzir a obesidade. Uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina 40 mg/kg foi administrada por 5 dias para induzir diabetes¹⁷. Entre os trinta camundongos, vinte e dois camundongos foram rastreados para glicemia aleatória > 300 mg / dL e aleatoriamente designados para os grupos DJB (n = 15) e cirurgia simulada (n = 7). Oito camundongos foram excluídos do experimento devido à glicemia abaixo do padrão.

1. Jejue os camundongos por 8 h antes da cirurgia. Retire a água 2 h antes da cirurgia.
2. Administre solução de pentobarbital sódico a 1% (6 mL / kg) e buprenorfina (1 mg / kg) por via intraperitoneal. Toque os dedos dos pés ou caudas dos ratos com uma pinça e certifique-se de que os ratos não apresentem espasmos ou tremores óbvios. Sob anestesia adequada, os camundongos podem respirar livremente sem oxigênio suplementar.
3. Colocar os ratinhos em decúbito dorsal sobre um quadro esterilizado e sob um estereomicroscópio. Aplique pomada para os olhos nos olhos. Use um cobertor elétrico para manter os ratos aquecidos durante todo o procedimento. Use procedimentos estéreis, incluindo aventais cirúrgicos, luvas estéreis e instrumentos autoclavados.
4. Em camundongos controle simulado, faça as duas incisões respectivamente no duodeno 1 cm abaixo do piloro e no jejuno 5 cm abaixo do Treitz e, em seguida, suture as incisões.

2. Bypass jejunal duodenal: Procedimento cirúrgico

1. Aplique a pasta depilatória do xifóide no abdômen para remover os pelos dessa região. Limpe o creme e certifique-se de que a pele esteja limpa. Esfregue a área três vezes com esfoliação alternada de soluções de iodo e álcool.
2. Cubra o camundongo com um campo estéril, deixando a área operacional exposta, e faça uma incisão de 2 cm do xifóide ao abdômen.
3. Use um afastador abdominal para expor a cavidade abdominal. Afaste a gordura abdominal usando um cotonete úmido e mova o fígado para o lado cefálico para expor totalmente o estômago e os intestinos.
4. O estômago e o piloro estão abaixo do fígado, e o ligamento de Treitz está no duodeno distal. Dupla ligação do jejuno, 5 cm distal ao ligamento de Treitz com sutura de seda 6-0 (Figura 1A). Corte o jejuno no ponto médio das duas ligaduras e suture o coto jejunal com uma sutura de seda 10-0 (Figura 1B).
   NOTA: Evite torcer os vasos sanguíneos mesentéricos.
5. Puxe a incisão jejunal proximal 5 cm ao longo do intestino até o jejuno para criar uma anastomose jejunal-jejunal. Alinhe os dois intestinos horizontalmente e, em seguida, use uma sutura de seda 10-0 para criar a anastomose lateral (Figura 1C).
   NOTA: Durante a cirurgia, mantenha o intestino úmido com solução salina para reduzir a perda de água. Isso evitará que o intestino se enrole e facilitará a sutura.
6. Prenda ambas as extremidades do intestino e corte a incisão no mesmo comprimento (Figura 1D). Suturar a segunda camada da parede intestinal posterior com uma sutura contínua de espessura total.
   NOTA: O comprimento da incisão é de aproximadamente 0.5-0.6 cm e a distância da agulha é de ~0.5 mm.
7. Prenda as duas extremidades do intestino e suture a parede anterior do intestino. Suturar a primeira camada da parede anterior com uma sutura contínua simples e a segunda camada com uma sutura horizontal em varo (Figura 1E-F).
   NOTA: Limpe o conteúdo intestinal com cotonetes para evitar infecção da cavidade abdominal.
8. Puxe a incisão jejunal distal no duodeno 1 cm abaixo do piloro para criar uma anastomose duodenal-jejunal (Figura 1G). Suture-o usando o mesmo método das etapas 2.6-2.7 (Figura 1H-K).
   NOTA: Verifique a sutura no canto da anastomose para reduzir o vazamento da anastomose.
9. Ligue o intestino com a micro pinça e corte o intestino com a micro tesoura. Ligar duplamente o duodeno com uma sutura de seda 6-0, a 2 mm da extremidade distal da anastomose duodenal-jejunal. Corte no ponto médio com microtesoura e suture o coto com uma sutura de seda 10-0 (Figura 1L).
   NOTA: Os vasos gastroduodenais ramificam-se perpendicularmente à cabeça do pâncreas e são adjacentes ao piloro, exigindo exploração cuidadosa dos vasos na seção transversal. A confluência do ducto colédoco e duodeno foi localizada, tomando cuidado para não danificar o pâncreas ou o ducto colédoco.
10. Enxágue a cavidade abdominal com solução salina a 30 °C. Retorne o intestino para a cavidade abdominal. Suturar o músculo e a pele separadamente com uma seda 6-0. Em seguida, desinfete a pele com iodóforo.
11. Após a cirurgia, injete solução salina a 30 °C (30 mL/kg) por via subcutânea nas costas para evitar a desidratação. Injete penicilina (10 mg / kg) por via intramuscular para prevenir a infecção.

Figura 1: Procedimento de bypass duodenal-jejunal. (A) Localização do jejuno 5 cm distal ao ligamento de Treitz. (B) Ligue duas vezes o jejuno com seda 6-0, cortada no meio da ligadura. (C) Anastomose jejunal-jejunal. (D) Faça uma incisão de 0,5-0,6 cm e suture a parede posterior. (E-F) Anastomose jejunal-jejunal completa. (G) Puxe o jejunal distal para o duodeno 1 cm abaixo do piloro. (H) Anastomose duodenal-jejunal. (I) Corte a anastomose duodenal-jejunal com uma incisão de 0,5-0,6 cm e suture a parede posterior com uma sutura contínua simples. (JK) Anastomose duodenal-jejunal completa. (L) A 2 mm da anastomose distal à duodenal-jejunal, ligar duas vezes o duodeno com seda 6-0 e cortar no meio da ligadura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cuidados gerais pós-operatórios

1. Após a cirurgia, coloque os ratos em um cobertor elétrico para evitar hipotermia. Permita que os ratos rastejem livremente até ficarem totalmente acordados antes de retornar às gaiolas.
2. No dia pós-operatório, restrinja a comida e a água e injete 2 mL de solução salina por via subcutânea no dorso dos camundongos. No primeiro dia de pós-operatório, administrar 10 mL de glicose a 10% e uma bebida funcional (proporção de 1:1) sem alimentos e injetar 1 mL de soro fisiológico por via subcutânea.
3. No segundo e terceiro dias de pós-operatório, alimentar os camundongos com uma mistura de 20 mL de glicose a 10% e uma bebida funcional. Após o quarto dia, dê aos ratos água pura e uma dieta rica em gordura. A alimentação de transição deve ser realizada de acordo com o estado de recuperação pós-operatória na seguinte ordem: solução, semilíquido ou alimento sólido.
4. Analgesia pós-operatória: injete buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h dos dias 1 a 3 e, em seguida, uma vez ao dia até o dia 5.
5. Após a cirurgia, observe as condições de alimentação, atividade, fezes e cicatrização de feridas dos camundongos.

Figura 2: O diagrama da cirurgia DJB. (A) Anastomose duodenal-jejunal. (B) Anastomose jejunal-jejunal. (C) Membro biliopancreático. (D) Membro digestivo. (E) Membro comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Anatomia da cirurgia de DJB. (A) Anastomose duodenal-jejunal. (B) Anastomose jejunal-jejunal. (C) Membro biliopancreático. (D) Membro digestivo. (E) Membro comum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Avaliação pós-operatória dos parâmetros metabólicos

1. Medição do peso corporal
   1. Jejue os camundongos por 8 h antes da medição. Pese os camundongos semanalmente na segunda-feira antes e depois da cirurgia por 8 semanas.
2. Medição da ingestão alimentar
   1. Abriga um rato em cada gaiola. Meça a quantidade de alimento sólido em cada gaiola antes e depois de 24 h. A diferença entre os dois valores representa a ingestão alimentar diária.
3. Medição aleatória da glicemia
   1. Às 8:00 da manhã da segunda-feira semanal de medição, colete uma gota de sangue da ponta da cauda do camundongo e aplique-a em uma tira de glicose inserida no glicosímetro.
4. Teste oral de tolerância à glicose
   1. Oito semanas após a cirurgia de DJB, jejuar os camundongos por 8 h antes do teste oral de tolerância à glicose. Colete uma gota de sangue da ponta da cauda do rato e coloque-a em uma tira de glicose inserida no glicosímetro. Administre uma dose oral de 20% de D-glicose (2 g / kg). Meça os níveis de glicose no sangue em 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos após a gavagem.

Condições gerais
O tempo operatório médio para o procedimento de DJB foi de 84,5 ± 2,6 min. Quinze camundongos foram submetidos à cirurgia de DJB, nove camundongos sobreviveram. Conforme mostrado na Tabela 1, a maioria dos óbitos ocorreu durante a cirurgia ou nos 7 dias seguintes. As causas de morte pós-operatória foram sangramento (n=2) no 1º dia de pós-operatório, vazamento de anastomose (n=1) no 4º dia de pós-operatório, obstrução da anastomose (n=2) no 7º dia de pós-operatório e causa desconhecida (n=1) três semanas após a cirurgia.

Durante 8 semanas antes deste experimento, realizamos a cirurgia de DJB em 10 camundongos semanalmente como um pré-experimento para simplificar a operação. Conforme mostrado na Figura 4, obtivemos uma tendência da taxa de sobrevida semanal dos camundongos durante o pré-experimento. Observamos uma melhora progressiva na taxa de sobrevida, indicando que é necessário treinamento cirúrgico intensivo para dominar a técnica de DJB.

Figura 4: A taxa de sobrevivência de camundongos sete dias após a cirurgia de DJB. Os dados mostram o benefício do pré-experimento na taxa de sobrevivência de camundongos DJB. Os dados são mostrados como a taxa de sobrevida 7 dias após a cirurgia (%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Peso corporal, ingestão alimentar e homeostase da glicose
Os camundongos tinham pesos corporais e ingestão de alimentos semelhantes antes da cirurgia e 8 semanas após a cirurgia. Os camundongos DJB não mostraram perda de peso significativa em comparação com os camundongos controle simulado 8 semanas após a cirurgia (P > 0,05; Figura 5A). A ingestão diária de alimentos foi reduzida após os 7 dias após a cirurgia de controle simulado e DJB e retornou aos níveis pré-operatórios 3 semanas depois (P > 0,05; Figura 5B). Observamos melhora nos níveis de glicemia de jejum e tolerância à glicose após a cirurgia de DJB (P < 0,01; Figura 5C, 5D).

Figura 5: Efeito do DJB no peso corporal, ingestão diária de alimentos, glicemia aleatória e teste oral de tolerância à glicose. Os dados são apresentados como a média ± DP, n=6. ns: não significativo; ** p <0,01 (testes de Mann-Whitney e ANOVA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.