Modelagem de cirurgia de catarata em camundongos

Resumo

Este método modela a cirurgia de catarata in vivo , removendo as células da fibra do cristalino de camundongos adultos e deixando para trás a bolsa capsular com células epiteliais do cristalino (LECs) anexadas. A resposta à lesão é então avaliada em vários momentos após a cirurgia usando critérios moleculares e morfológicos.

Resumo

A cirurgia de catarata (CS) é um tratamento eficaz para a catarata, uma das principais causas de deficiência visual em todo o mundo. No entanto, a SC leva à inflamação ocular e, a longo prazo, pode resultar em opacificação capsular posterior (PCO) e/ou luxação do cristalino impulsionada pelo crescimento excessivo pós-cirúrgico de células epiteliais do cristalino (LECs) e sua conversão em miofibroblastos e/ou células de fibra aberrantes. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a CS resulta em inflamação e PCO ainda são obscuros porque a maioria dos modelos in vitro não recapitula a resposta de cicatrização de feridas de LECs vistos in vivo, enquanto modelos animais tradicionais de cirurgia de catarata, como coelhos, não permitem a manipulação genética da expressão gênica para testar mecanismos. Recentemente, nosso laboratório e outros usaram com sucesso camundongos geneticamente modificados para estudar os mecanismos moleculares que impulsionam a indução de sinalização pró-inflamatória e transição epitelial para mesenquimal do LEC, levando a uma nova visão sobre a patogênese da PCO. Aqui, relatamos o protocolo estabelecido para modelagem de cirurgia de catarata em camundongos, que permite um perfil transcricional robusto da resposta de LECs à remoção de células de fibra de cristalino via RNAseq, a avaliação da expressão de proteínas por imunofluorescência semiquantitativa e o uso de ferramentas genéticas modernas de camundongos para testar a função de genes que supostamente participam da patogênese de sequelas agudas como inflamação, bem como a conversão posterior de LECs em miofibroblastos e/ou células de fibra de lente aberrantes.

Introdução

A lente é um tecido transparente e altamente organizado que refrata a luz para produzir uma imagem claramente focada na retina ^1,2,3. Este órgão especializado é cercado por uma membrana basal ininterrupta (a cápsula), que isola o cristalino de outras partes do olho. A superfície anterior interna da cápsula ancora uma monocamada de células epiteliais do cristalino (LECs), que então se diferenciam no equador do cristalino em células de fibra do cristalino, que compreendem a grande maioria do cristalino³. A catarata ocorr....

Protocolo

O protocolo a seguir foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware sob o protocolo #1039-2021-1. Em conformidade com a Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research²⁴, todas as cirurgias de sobrevivência ocular só podem ser realizadas em um olho. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre reagentes e instrumentos usados neste protocolo. Abordagens alternativas para extração das fibras do cristalino e sutura são mostradas na Figura 2....

Resultados

Com base nos resultados deste método cirúrgico, o Duncan Lab usou este modelo de camundongo de cirurgia de catarata para construir um curso de tempo de resposta à lesão das células epiteliais do cristalino pós-cirurgia (Figura 5). Às 6 h após a cirurgia, 5% do transcriptoma epitelial do cristalino é diferencialmente expresso (Figura 6A), incluindo a regulação positiva de vários genes de resposta precoce imediata e citocinas pró-inflamatórias^23<.......

Discussão

Esta técnica cirúrgica requer manuseio avançado de camundongos e habilidades microcirúrgicas que exigem prática para se desenvolver. O mais difícil de dominar é a colocação de suturas finas na córnea para fechar a ferida. Suponha que o experimentador seja um novato total em sutura. Nesse caso, recomenda-se primeiro praticar o uso de barbante e pano e, em seguida, passar a praticar o uso de suturas de grande diâmetro em frutas pequenas para dominar os movimentos manuais necessários para f.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pomada oftálmica de eritriomicina a 0,5% USP	Baush Lomb	24208-910-55
Solução oftálmica de sulfato de atropina a 1%	Amneal	60219-1748-2
Solução optálmica de tropicamida a 1% USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Sutura de nylon	Ethicon	7707G
Solução oftálmica de cloridrato de fenilefrina a 2,5% USP	Agulhas Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 - Ponta	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° 1"	Harfington
Solução salina balanceada	Phoenix	57319-555-06
Bupranorfina (0,1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Solução		de clorexidina
Porta-agulhas 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes tesoura, reta	Ferramentas de Belas Ciências	12060-02
SMZ800 Nikon modelo microscópio	Nikon
Bisturi descartável estéril No.11	Pena	2975 # 11
Pinças # 5 Dumont	Microscopia Eletrônica Ciências	72700-D
Xilazina / Cetamina / Acepromazina (35 mg / kg, 80 mg / kg, 0,5 mg / kg) solução	APP Pharmaceticals	401730D

de dispensação dobrada