Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas de cromatina semelhantes a teias extrudadas de neutrófilos em resposta a vários estímulos inflamatórios. As NETs são compostas por DNA, histonas e várias proteínas/peptídeos antimicrobianos, que aprisionam e matam patógenos infecciosos e invocam respostas inflamatórias¹.

Embora os TNEs sejam benéficos para a defesa do hospedeiro contra patógenos, eles têm chamado a atenção como um potencial impulsionador de várias doenças autoimunes², trombose³, doenças metabólicas⁴ e crescimento metastático de cânceres⁵. Como tal, a inibição da formação de NET é uma opção terapêutica potencial para estas doenças. No entanto, apesar de algumas moléculas promissoras de TNEs terem como alvo em desenvolvimento⁶, ainda não há uma terapia aprovada que afete especificamente esse mecanismo. Isso é, pelo menos parcialmente, atribuível à falta de métodos de quantificação objetivos, imparciais, reprodutíveis e de alto rendimento para a formação de NET.

Estabelecemos e relatamos um novo método utilizando uma plataforma de imagem de células vivas de duas cores ^7,8. Imagens de lapso de tempo de neutrófilos corados com corante nuclear permeável à membrana e corante de DNA impermeável à membrana são analisadas pelo software, e os números de neutrófilos pré e pós-formadores de NETs são contados em vários pontos de tempo. Uma vez que a integridade da membrana plasmática é perdida durante a formação de NET pela regulação da desmontagem de Lamin B mediada por PKCα e Lamin A/C mediada por CDK4/6⁹, os neutrófilos formadores de NET são corados por corante de DNA impermeável à membrana, enquanto os neutrófilos saudáveis não o são. Esse método supera os problemas das técnicas relatadas anteriormente para quantificar a formação de NET e fornece quantificação de NET imparcial, de alto rendimento, reprodutível e precisa de maneira automatizada.

Os neutrófilos de indivíduos humanos saudáveis foram obtidos após o consentimento informado fornecido de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do National Institutes of Health (NIH). O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do NIH.

1. Coloração dos neutrófilos e preparação da placa de ensaio

1. Tomar sangue periférico com consentimento informado por escrito apropriado, seguindo as diretrizes de cada instituto e isolar neutrófilos usando qualquer método desejado. Por exemplo, o método Ficoll-dextran ^10,11 é um método comumente utilizado para isolamento de neutrófilos do sangue periférico humano.
   NOTA: Embora o método discutido aqui use neutrófilos humanos, os neutrófilos de camundongo também podem ser analisados usando um protocolo semelhante.
2. Ressuspenda os neutrófilos no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI; ver Tabela de Materiais) 1640 a 2,0 x 10⁶ neutrófilos/mL e coloque a suspensão de neutrófilos em tubo centrífugo de 1,5 mL.
   NOTA: Geralmente não adicionamos soro fetal bovino (SFB) ao meio de cultura porque a albumina no SFB pode reduzir a formação de NET¹² e nucleases estáveis ao calor no SFB podem degradar os TNEs¹³.
3. Adicionar corante de ADN vermelho permeável à membrana (ver Tabela de Materiais) a 1 μL por 1,5 ml de suspensão de neutrófilos.
4. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos no escuro. Centrifugar a 2500 x g durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
5. Ressuspender os neutrófilos em 1 mL de RPMI, centrifugar a 2500 x g por 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Repita 2x (lave total 3x).
6. Ressuspender os neutrófilos em 1 mL de RPMI e contar usando um contador de células. Diluir a suspensão de neutrófilos para 1,5 x 10⁵ neutrófilos/mL.
7. Adicionar 4 μL de corante de ADN verde impermeável à membrana 1:100 pré-diluído (ver Tabela de Materiais) por 1 ml de suspensão de neutrófilos.
8. Colocar 100 μL de suspensão de neutrófilos por poço em uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos transparente (ver Tabela de Materiais). Defina cada condição em triplicata.
   NOTA: Mostramos anteriormente⁷ que não há diferença na formação e quantificação de NET com este método se os neutrófilos forem colocados em placas com ou sem revestimento de poli-L-lisina. Portanto, o uso de cultura de tecidos em placa tratada é suficiente para esse método.
9. Adicionar 100 μL de RPMI contendo reagentes de estímulo com ou sem inibidor, ou qualquer outro reagente de interesse nos respectivos poços. Sempre use poços de controle positivo adicionando 500 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) ou 2,5 μM de ionóforo de cálcio (A23187), 30 μM inibidor de AKT foi usado aqui.
10. Coloque a placa no sistema de análise de células vivas (ver Tabela de Materiais) que está alojada em uma incubadora de CO₂ a 5%.
    NOTA: A condensação pode aparecer na parte superior e inferior da placa alguns minutos após esta etapa. Isso pode inibir a imagem adequada. Limpe e remova completamente a condensação antes do início da digitalização. Coloque a placa na máquina, inicie o software, insira o protocolo de digitalização e, em seguida, limpe a placa imediatamente antes da primeira digitalização.

2. Placa de varredura para visualizar neutrófilos formadores de NET

1. Inicie o software (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes do software). Inicie Add Vessel pressionando + no canto superior esquerdo.
2. Escolha Digitalizar na programação. Escolha Novo.
   Observação : uma vez que isso é criado, execute o mesmo protocolo de varredura escolhendo Copiar anterior e selecionando o protocolo armazenado na próxima tela.
3. Escolha Padrão. Defina as configurações de varredura como: Opções célula por célula: Nenhuma; Canais de imagem: Fase, Verde (Tempo de Aquisição: 200 ms), Vermelho (Tempo de Aquisição: 400 ms); Objetivo: 20x.
4. Escolha a placa que está sendo usada na lista. Selecione o local do recipiente onde colocar a placa na bandeja do sistema de imagem de células vivas.
5. Selecione os poços onde as amostras estão presentes e decida quantas imagens tirar por poço. Com base no número de imagens por poço, gere uma duração estimada da varredura para a placa. Normalmente, 4 imagens por poço são suficientes; no entanto, isso pode variar dependendo das condições e da frequência dos exames.
6. Insira as informações de cada poço (por exemplo, tipo de célula e composto) clicando em Criar Mapa de Placas para fornecer um nome para o estudo.
   NOTA: O mapa de placas pode ser preparado e salvo com antecedência usando o editor de mapas de placas no software. Os dados do mapa de placas salvos podem ser importados durante esta etapa. Se desejar, a inserção das informações do mapa da placa pode ser ignorada e executada posteriormente. Os dados também podem ser obtidos sem inserir informações de layout da placa. No entanto, recomenda-se inserir informações da placa para facilitar a análise subsequente.
7. Na tela seguinte, selecione Analisador Básico como o tipo de análise e escolha Protocolo de Análise na lista suspensa, que mostra as definições de análise usadas anteriormente (não os protocolos de varredura). A desmistura espectral para o verde e o vermelho pode ser deixada a 0,0 %.
   Observação : esta etapa pode ser ignorada, se desejado.
8. Agende a varredura. Para o experimento aqui, digitalize a cada 15-20 min por 8 h . Defina a hora de início da varredura arrastando a barra branca e cinza na parte superior da tela.
   NOTA: Evite a varredura com muita frequência, caso contrário, a máquina pode não funcionar bem devido ao superaquecimento. O tempo de varredura não deve exceder 12 h por 24 h. Poderá ver um alerta se a análise for demasiado frequente.
9. Verifique a configuração de digitalização na próxima tela e pressione Adicionar à programação para iniciar a digitalização. Aguarde até que o conjunto inicial de imagens seja digitalizado para confirmar se tudo está funcionando bem.
   1. Às vezes, as células podem não estar devidamente focadas. Nesse caso, verifique se a condensação está presente (e limpe de acordo), se a placa está corretamente ajustada na bandeja, ou se a posição da placa está especificada corretamente, etc. Se as células ainda estiverem flutuando e não tiverem se acomodado no fundo do poço, aguarde cerca de 5 minutos antes de digitalizar.

3. Definição da análise para quantificar as NETs

1. Abra o estudo (vaso) a ser analisado na aba Exibir. Pressione Launch Analysis à esquerda da tela. Escolha Criar nova definição de análise.
   1. Se uma análise tiver sido executada anteriormente, use a mesma definição de análise com pequenas alterações selecionando Copiar definição de análise existente. Nesse caso, vá para a etapa 3.3. Se estiver usando a análise sem qualquer alteração, selecione Usar Definição de Análise Existente; Isso não é recomendado porque o nível de fluorescência pode variar entre os ensaios em dias diferentes, e algumas pequenas correções geralmente são necessárias.
2. Selecione Analisador Básico. Use todos os canais de imagem: Fase, Verde, Vermelho e Sobreposição.
   Observação : embora geralmente usamos máscaras de objeto verde e vermelho para contar NETs, máscara de objeto de sobreposição é útil quando os detritos são importantes. Nesses casos, o número de contagem de objetos sobrepostos será usado como numeradores em vez da contagem de objetos verdes (consulte a etapa 3.9). Se a contagem de objetos sobrepostos for usada em vez da contagem de objetos verdes, todos os sinais vermelhos deverão ser contados corretamente. Ajuste a configuração do sinal vermelho para contar todos os objetos vermelhos com sinal vermelho baixo em imagens tiradas em pontos de tempo posteriores, mas não para contar detritos.
3. Escolha de 6 a 8 imagens de amostra representativas para treinamento. Para o experimento aqui, inclua as seguintes imagens:
   Imagens tiradas entre 0 a 20 min para otimizar a configuração do sinal verde para compensar sinais verdes sutis que podem ser gerados em neutrófilos não formadores de NET.
   Imagens de NETs máximas com controle positivo, tiradas entre 3-6 h (o tempo varia dependendo da estimulação utilizada) para otimizar o ajuste do sinal verde para definir neutrófilos formadores de NET
   Imagens tiradas em torno do ponto de tempo de 1 h para contar o número de células totais (coradas com corante vermelho), uma vez que o sinal vermelho nuclear é o mais forte em torno do ponto de tempo de 1 h (quando todas as células se estabeleceram no fundo do poço) e diminui gradualmente devido à morte celular.
   Imagens contendo detritos, para excluí-los de serem contados.
4. Defina a definição de análise. Objetos vermelhos e verdes correspondem aos núcleos de todos os neutrófilos e daqueles que estão formando NETs, respectivamente. Comece com o exemplo a seguir e pressione Visualizar atual ou Visualizar tudo e module cada parâmetro para otimizar os resultados:
   Para Verde: Segmentação- Subtração de fundo: Cartola; Raio: 100 μM; Limiar: 0,3 CGU; Divisão de borda: Ligado; Sensibilidade de borda: -20; Limpeza - Preenchimento de furos: 100 μm²; Ajuste o tamanho 0 pixels; Filtros- Área: min 20 μm², max 500 μm²; Excentricidade: max 0,97; Intensidade Média: min 1,00
   Para Vermelho: Segmentação- Subtração de fundo: Cartola; Raio: 10 μM; Limiar: 1,0 CGU; Divisão de borda: ON; Sensibilidade de borda: -50; Limpeza - Preenchimento de furos: 50 μm²; Ajuste o tamanho 0 pixels; Filtros- Área: min 20 μm², max 400 μm²; Intensidade média: min 1,5.
   1. Se o sinal verde excessivo aparecer em neutrófilos que não deveriam estar formando NETs (por exemplo, neutrófilos não estimulados em 0 min que têm núcleos lobulados), pode ser devido ao transbordamento do sinal vermelho detectado no canal verde. Nesse caso, retorne à etapa 3.1, abra Camadas de Imagem à esquerda da tela e remova os sinais vermelhos do canal verde usando a Desmistura Espectral.
   2. Outra opção é definir um poço para coloração única com corante vermelho nuclear para esclarecer quanto do sinal vermelho deve ser removido do canal verde. Por outro lado, geralmente o sinal verde de sangramento para o canal vermelho não afeta as análises.
      NOTA: Não importa se a sensibilidade ao sinal vermelho é baixa e nem todos os sinais vermelhos são capturados nas imagens que são tiradas em momentos posteriores (por exemplo, ponto de tempo de 6 h). O número máximo de contagens de objetos vermelhos em cada imagem é considerado como o número total de neutrófilos na imagem e será usado como denominador no passo 3.9. Geralmente, os sinais nucleares vermelhos atingem o pico em torno de 1 h e diminuem gradualmente devido à morte celular (Figura 1B). Portanto, ajuste a configuração do sinal vermelho para contar corretamente os objetos vermelhos nas imagens com o máximo de sinais vermelhos.
5. Selecione os tempos de varredura e os poços a serem analisados. Normalmente, todos os pontos de tempo e poços devem ser analisados. Forneça um rótulo para a definição de análise.
6. Confira o resumo e inicie a análise. Leva algumas horas para a conclusão da análise (a duração depende do número de pontos de tempo e poços). Uma vez lançado, o nome da definição de análise será mostrado sob o nome do estudo na guia Exibir e a data completa será mostrada quando ele for concluído.
7. Após sua conclusão, abra o estudo analisado clicando duas vezes no nome da definição da análise. Abra Camadas à esquerda da tela e verifique se cada célula está marcada corretamente. Se não estiver marcado corretamente, retorne à etapa 3.1 e repita as etapas subsequentes.
8. Clique em Métricas do gráfico à esquerda da tela para exportar os dados. Selecione Contagem Verde, Contagem Vermelha ou Contagem de Sobreposição (Por Imagem) e escolha os pontos de tempo e poços a serem exportados. Para selecionar agrupamento, selecione Replicações de mapa de placas se todos os poços estiverem especificados corretamente quando a varredura for concluída.
9. Exporte os dados. Calcule a porcentagem de células formadoras de NET para cada condição/ponto de tempo pela seguinte equação usando um software apropriado.
   
   NOTA: A razão pela qual o denominador é a contagem máxima de objetos vermelhos é que o número de objetos vermelhos atinge o pico em torno de 1 h e diminui gradualmente devido à morte celular.

Este método fornece contraste de fase, imagens fluorescentes vermelhas (corante permeável à membrana) e fluorescentes verdes (corante impermeável à membrana) tiradas em cada ponto de tempo. Juntamente com o processo de formação da NET, observam-se alterações morfológicas nas imagens de contraste de fase e fluorescentes vermelhas e, uma vez rompida a membrana, pode-se observar fluorescência verde (Figura 1). Neste ensaio, os neutrófilos formadores de NET são geralmente redondos, em vez de formarem uma estrutura semelhante a uma teia. Isso ocorre porque a resolução da máquina não é alta o suficiente para capturar a estrutura fina semelhante à teia e o corante verde impermeável à membrana mancha a cromatina antes de ser liberada uma vez que a membrana é rompida. Mostramos anteriormente7 que os TNEs podem ser visualizados por meio de imagens confocais nas placas de 96 poços recuperadas após 4 h de incubação.

Quando a definição de análise é apropriada, todos os neutrófilos na imagem são marcados como objeto vermelho e os neutrófilos formadores de NET são marcados como objeto verde (Figura 2). A máquina conta o número de objetos vermelhos e verdes em cada ponto de tempo. O curso temporal da formação de NET é visualizado plotando-se a porcentagem de neutrófilos formadores de NET em cada ponto de tempo (Figura 3). Moléculas potenciais que têm como alvo a formação de NET (por exemplo, inibidor de AKT) podem ser testadas de uma maneira de alto rendimento usando essa metodologia.

Figura 1: Alterações morfológicas em neutrófilos em formação de NET. (A) Neutrófilos do sangue periférico humano que foram estimulados com ionóforo de cálcio 2,5 μM por 3 h. (B) Cortes representativos de célula única da imagem de contraste de fase, canal vermelho (corante nuclear permeável à membrana), canal verde (corante de DNA impermeável à membrana) e imagem mesclada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas mostrando o reconhecimento de neutrófilos e NETs pelo software. Neutrófilos de voluntários humanos saudáveis foram estimulados com 2,5 μM de ionóforo de cálcio por 1 h. Imagens sobrepostas de imagens de contraste de fase e cada sinal ou máscara são mostradas. Os núcleos foram corados com (A) corante vermelho permeável à membrana, e o software reconheceu e contou (B) núcleos marcados em azul, enquanto os TNEs foram corados com (C) corante verde impermeável à membrana e o software os marcou como (D) roxo. Se (E) ocorrer sobredetecção ou (F) sob sensoriamento, o parâmetro pode precisar ser alterado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Evolução temporal da porcentagem de neutrófilos formadores de NET. Os neutrófilos foram estimulados por 25 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) ou 2,5 μM de ionóforo de cálcio para induzir NETs ou deixados não estimulados em RPMI. A adição de 30 μM de inibidor de AKT foi feita para bloquear a formação de NET. As imagens foram obtidas pelo software a cada 20 min durante 6 h. A porcentagem de células formadoras de NET foi calculada dividindo-se a contagem de objetos verdes (= o número de células formadoras de NET) pela contagem de objetos vermelhos (= o número de todos os neutrófilos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.