Avaliação microbiológica rápida no local para doenças infecciosas pulmonares

Resumo

O protocolo aqui demonstra um fluxo de trabalho rápido de avaliação microbiológica rápida no local (M-ROSE) rápido e padronizado, incluindo três etapas: confecção de lâminas, coloração e interpretação. Este protocolo ajudará os médicos a tomar decisões clínicas rápidas.

Resumo

O início imediato da terapia anti-infecciosa empírica é crucial em pacientes que apresentam infecção pulmonar inexplicada. Embora a aquisição de imagens seja relativamente simples na prática clínica, sua falta de especificidade geralmente requer testes adicionais demorados, como cultura de escarro, cultura de fluido de lavagem broncoalveolar ou sequenciamento genético para identificar a etiologia subjacente da doença com precisão. Além disso, a eficácia limitada do tratamento anti-infeccioso empírico pode contribuir para o uso indevido de antibióticos. Avanços recentes na interpretação do histórico microbiano em lâminas de avaliação rápida no local (ROSE) permitiram que os médicos obtivessem amostras prontamente por meio de broncoscopia (por exemplo, lavagem alveolar, escovação da mucosa, pinça de tecido), facilitando a coloração e a interpretação à beira do leito que fornece informações essenciais sobre o histórico microbiano. Consequentemente, isso estabelece uma base para o desenvolvimento de tratamento anti-infeccioso direcionado e planos individualizados de terapia medicamentosa. Com uma melhor compreensão de quais patógenos estão causando infecções em tempo real, os médicos podem evitar antibióticos desnecessários de amplo espectro que contribuem para a resistência aos antibióticos. O estabelecimento de um fluxo de trabalho M-ROSE rápido e padronizado nos departamentos de medicina respiratória ou unidades de terapia intensiva ajudará muito os médicos a formular estratégias de tratamento precisas para os pacientes, o que tem implicações clínicas significativas.

Introdução

A técnica de avaliação rápida no local (ROSE) é um método altamente eficiente empregado no campo dos procedimentos de doenças pulmonares. Permite amostragem em tempo real e intervenção diagnóstica, facilitando a análise citológica imediata¹. Essa abordagem inovadora envolve a impressão de uma parte da amostra de tecido em uma lâmina, preservando sua integridade. Uma das principais vantagens do ROSE reside em sua capacidade de facilitar a interpretação imediata das informações clínicas por meio de técnicas especializadas de microscopia. Isso abrange a análise da morfologia celular, classificação, quantificação, determinação de proporções constituintes, avaliação de arranjo, análise de correlação, avaliação de fundo e identificação de objetos estranhos. Ao integrar todos esses dados com as informações clínicas do paciente, o ROSE desempenha um papel fundamental na avaliação da adequação da amostragem e na orientação de procedimentos e técnicas de intervenção em tempo real².

Como subsidiária da tecnologia ROSE, a tecnologia M-ROSE se concentra principalmente na aquisição do histórico microbiológico das lesões-alvo, em vez de discernir entre células benignas e malignas ^3,4. Por um lado, o M-ROSE permite a identificação microscópica de patógenos como Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis e Candida⁵. Por outro lado, tem implicações orientadoras significativas na avaliação da qualidade da amostra respiratória, distinguindo doenças infecciosas de não infecciosas, discriminando infecção de contaminação, bem como avaliando a gravidade e o prognóstico da infecção ^6,7. Por exemplo, dentro de uma amostra respiratória, a coexistência de bactérias exibindo morfologia idêntica ao lado de células inflamatórias infiltrantes indica uma infecção; Por outro lado, a presença de múltiplas bactérias morfologicamente diversas acompanhadas por células epiteliais sugere contaminação. A capacidade de analisar informações clínicas de forma abrangente e prever resultados torna o M-ROSE uma ferramenta inestimável em procedimentos de doenças pulmonares.

Em conclusão, o ROSE serve como um transportador citológico crucial que aumenta significativamente a eficiência e a precisão do diagnóstico de doenças pulmonares. Seus recursos multifacetados contribuem para melhorar os resultados dos pacientes, garantindo uma intervenção oportuna e facilitando o diagnóstico preciso por meio de amostragem em tempo real e técnicas de intervenção diagnóstica. No entanto, é importante observar que esses avanços dependem da obtenção de amostras qualificadas. Aqui, apresentamos um protocolo M-ROSE padronizado que engloba a preparação da lâmina, técnicas de coloração e diretrizes de interpretação. Este protocolo serve como uma referência inestimável para os médicos estabelecerem planos precisos de avaliação e tratamento, facilitando a tomada de decisões sobre o manuseio subsequente de espécimes-alvo.

Protocolo

O ensaio clínico foi aprovado pelo Comitê de Aprovação do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Chongqing (nº 2022-ky-31). O caso típico envolveu um paciente diagnosticado com pneumonia por Pneumocystis, e o consentimento informado foi obtido do paciente.

1. Requisitos de equipamentos e materiais para ROSE

1. Equipamento: Consulte o arquivo Tabela de Materiais para o equipamento usado neste protocolo.
   NOTA: A utilização de um microscópio citológico dedicado e um sistema de imagem gráfica é imperativa (Figura 1A).
2. Preparação de materiais (ver Tabela de Materiais).
   1. Prepare lâminas de cultura de células estéreis (com forte adesão celular), papel absorvente, luvas de látex sem pó, agulhas de seringa descartáveis de 2,5-5 mL e coloque o conjunto completo de soluções de coloração Diff Quik (DQ) em frascos de coloração de vidro com tampas seladas para facilitar o manuseio (Figura 1).

2. Fluxo de trabalho M-ROSE

1. Preparação de lâminas citológicas
   NOTA: Existem muitas maneiras de preparar slides, e a seguir estão vários métodos de preparação comumente usados.
   1. Rolar slides
      NOTA: Garanta uma perda mínima de amostra de tecido durante este processo.
      1. Extraia as partículas de tecido usando uma agulha de seringa descartável com capacidade de 2,5-5 mL (Figura 2A).
      2. Espalhe uma área circular, de aproximadamente 1 cm de diâmetro e espessura moderada, da seção interna para a externa de um terço da extremidade corada (a extremidade exibindo forte fixação celular) na lâmina de citologia estéril.
   2. Escovar slides
      NOTA: Este método é aplicável a amostras obtidas usando escovas de células convencionais, escovas de células antipoluição ou escovas de células ultrafinas, bem como amostras semilíquidas, como escarro e fluidos corporais viscosos.
      1. Estenda a cabeça da escova e aplique-a no terço distal da lâmina de vidro citológica estéril (a lâmina tem fortes propriedades de adesão celular) para obter uma área retangular de cerca de 2 cm x 1 cm com espessura moderada.
   3. Lâminas de pulverização
      1. Posicione a agulha de punção a um terço da extremidade corada de uma lâmina de citologia estéril com adesão celular robusta.
      2. Aplique pressão de ar na ponta da agulha perfurante e insira-a do lado interno para fora, formando uma área circular com espessura média medindo aproximadamente 1 cm de diâmetro.
2. Coloração citológica da lâmina
   NOTA: A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda a coloração rápida da lâmina citológica ROSE usando o corante de Diff⁵. O corante Diff pode ser reutilizado, mas não repetido muitas vezes. Se houver sedimentos, eles devem ser filtrados após o uso. O tingimento muito profundo pode ser adequadamente descolorido por metanol ou álcool, de preferência não mais tingido. Se o tingimento for muito profundo ou muito raso, o tempo de tingimento ou a concentração do líquido de trabalho devem ser ajustados; o valor do pH tem uma certa influência no tingimento, e a lâmina deve estar limpa e livre de poluição ácida e alcalina. Tanto a solução Diff A quanto a solução Diff B são voláteis e devem ser seladas e armazenadas após o uso.
   1. Mergulhe a lâmina em solução de Diff A por 10-30 s ( Figura 2B ) e, em seguida, enxágue-a no banho de corante PBS para remover o excesso de solução de Diff A e sacuda suavemente qualquer tampão restante ( Figura 2C ).
   2. Em seguida, mergulhe a lâmina na solução Diff B por 20-40 s (Figura 2E).
   3. Por fim, limpe a lâmina no tanque de tingimento de água (Figura 2F), seque e limpe o líquido residual da lâmina com papel absorvente (Figura 2D) e termine de tingir.
      NOTA: O M-ROSE permite a visualização direta de microrganismos patogênicos e facilita a avaliação da qualidade da amostra respiratória, permitindo a discriminação entre infecção e não infecção, bem como infecção e contaminação, o que tem significado orientador para a avaliação da gravidade e prognóstico da infecção. A seção de discussão cobrirá esse aspecto, pois não envolve nenhum procedimento experimental.

Resultados

Em um caso típico, um homem de 63 anos se apresentou ao hospital com tosse, febre e dor no peito. O paciente foi previamente diagnosticado com síndrome nefrótica, caracterizada por proteinúria e edema, e recebeu tratamento com prednisona e tacrolimo por um longo tempo. Os achados laboratoriais iniciais demonstraram contagem de leucócitos de 10,49 x 10⁹/L, contagem de neutrófilos de 8,87 x 10⁹/L, proteína C reativa no sangue total e concentrações de (1-3)-β-D-glucano de 155,81 mg/L e 249,7 pg/mL. A tomografia computadorizada (TC) de tórax mostrou opacificação em vidro fosco com localização difusa, bilateral e central (Figura 3A). O tratamento anti-infeccioso inicial com cefoperazona tazobactam foi ineficaz e seus sintomas foram agravados por cansaço cardíaco, falta de ar e dispneia após o exercício; a repetição da TC não mostrou melhora significativa (Figura 3B). Em seguida, o paciente foi transferido para a unidade de terapia intensiva (UTI) para ventilação mecânica e submetido a broncoscopia. A amostragem de foco foi acessada sob a orientação de navegação virtual, e três amostras de biópsia de fórceps foram coletadas (Figura 4). O ROSE estava disponível para avaliação microscópica imediata do tecido, e o diagnóstico de Pneumocystis jiroveci foi confirmado (Figura 5A). O paciente recebeu imediatamente tratamento antifúngico com sulfametoxazol (1,92 g, q6h); a coloração subsequente (Figura 5B-E) confirmou esse diagnóstico. No entanto, a TC repetida ainda não mostrou melhora significativa (Figura 3C). O paciente recebeu carbofungina (no primeiro dia de 70 mg e seguido de 50 mg por dia), metilprednisolona (80 mg por dia) e imunoglobulina (10 g por dia) para infecção fúngica. Os sintomas foram aliviados rapidamente e o paciente continuou o tratamento de acompanhamento.

Figura 1: Equipamentos e materiais. (A) Microscópio citológico e sistema de imagem gráfica. (B) Solução de coloração Diff Quik (DQ) A. (C) Solução de coloração Diff Quik (DQ) B. (D) Luvas de látex sem pó. (E) Lâminas de cultura de células estéreis. (F) Agulhas de seringa descartáveis de 2,5-5 mL. (G) Papel absorvente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho M-ROSE. (A) Imprimindo o slide. (B) Mergulhe a lâmina em solução de Diff A por 10-30 s. (C) Enxágue a lâmina no banho de corante PBS para remover o excesso de solução de Diff A. (D) Seque e limpe o líquido residual da lâmina com papel absorvente. (E) Mergulhe a lâmina na solução Diff B por 20-40 s. (F) Limpe a lâmina no tanque de tingimento de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens de TC de tórax. (A) Na admissão. (B) No dia da transferência para a UTI. (C) Após o tratamento com sulfametoxazol , clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Localização do segmento basal posterior do lobo inferior do pulmão direito por VBN. (A) Brônquio principal direito. (B) Brônquio médio direito. (C) Segmento basal posterior do brônquio do lobo inferior do pulmão direito. (d) Mapa 3D do VBN. (E) Mapa coronal da TC de tórax. (F) Mapa axial da TC de tórax. (G) Mapa sagital da TC de tórax Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Fotos documentando a aparência de pneumocystis em vários métodos de coloração. (A) ROSE 100 x 10; Seta branca: cistos contendo ascósporos. (B) Hematoxilina e eosina (H-E), 60 x 10. (C) Azul Alcian, 60 x 10. (D) GIEMSA, 40 x 10. (E) Prata Hexam, 20 x 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A pneumologia intervencionista é um ramo valioso da doença respiratória moderna; em particular, tem sido amplamente utilizado no diagnóstico de doenças pulmonares ^8,9. Nos últimos anos, a pneumologia intervencionista diagnóstica tem prosperado devido ao aumento da prevalência de tumores malignos pulmonares, infecções por patógenos mais resistentes a medicamentos que ocorrem no trato respiratório inferior e solicitações exigentes de diagnóstico de doenças respiratórias desconcertantes e críticas 10,11,12. A eficiência do diagnóstico intervencionista depende de fatores como tamanho e localização anatômica das áreas focais, taxas de complicações e número de locais de biópsia e doenças subjacentes, promovendo o uso clínico de inúmeras tecnologias e instalações avançadas¹³. O ROSE recebeu atenção notável e emergiu rapidamente como uma "técnica de acompanhamento em tempo real" para diagnóstico em pneumologia intervencionista.

O ROSE foi projetado para avaliação rápida, diagnóstico preliminar e priorização da satisfação da amostra durante procedimentos como punção, biópsia e escovação. Ele fornece feedback para orientar os avanços tecnológicos subsequentes 14,15,16,17. O M-ROSE, um ramo do ROSE, concentra-se principalmente na avaliação do fundo microbiano, em vez de avaliar a malignidade das células teciduais⁵. O método M-ROSE é uma técnica de avaliação rápida e não uma ferramenta diagnóstica, portanto, sua eficácia diagnóstica não deve ser exagerada. Sua aplicação clínica engloba principalmente os seguintes aspectos: identificação visual de certos microrganismos patogênicos, diferenciação entre infecção e contaminação e discriminação entre infecção e não infecção⁷.

Após a coloração rápida, o núcleo celular do tecido exibiu uma tonalidade vermelho-arroxeada, enquanto o citoplasma exibiu uma cor roxo-azulada. Bactérias e fungos apareceram em azul, resultando em um contraste distinto entre células de tecido e patógenos⁷. O M-ROSE, pode demonstrar um certo nível de capacidade na identificação de bactérias e fungos. Especificamente, exibe uma alta taxa de positividade para Aspergillus, cryptococcus, Pneumocystis jiroveci e outros fungos ^3,18. No entanto, apresenta limitações quando se trata de reconhecer patógenos com pequeno volume e diâmetro ou agentes patogênicos intracelulares. É fundamental ressaltar que o diagnóstico de qualquer doença deve ser baseado em uma avaliação abrangente que englobe a condição fundamental do paciente, manifestações clínicas, exames de imagem e outros fatores, em vez de depender apenas da identificação microscópica de microrganismos patogênicos.

O M-ROSE, também oferece vantagens na identificação de infecção e contaminação, como a avaliação da qualidade das amostras de fluido de lavagem alveolar. Nos departamentos onde as condições permitem, a avaliação do fluido de lavagem à beira do leito pode ser realizada por centrifugação e coloração. Amostras qualificadas de lavado alveolar demonstram que a proporção de células escamosas entre todas as células (excluindo hemácias) sob microscopia de baixa potência é inferior a 1%, as células epiteliais colunares são inferiores a 5% e as hemácias são inferiores a 10% (excluindo fatores relacionados a trauma ou sangramento)¹⁹. O exame microscópico do histórico citológico nos facilitará a fazer avaliações oportunas.

Além disso, o M-ROSE pode auxiliar na distinção entre lesões infectadas e não infectadas⁵. Nas lesões infectadas, muitas vezes há infiltração de neutrófilos, macrófagos e linfócitos pelas células inflamatórias, com observação ocasional de fagocitose de neutrófilos. Por outro lado, as lesões não infectadas geralmente não apresentam infiltração de células inflamatórias.

O protocolo aqui apresentado demonstra o processo de operação do M-ROSE; Através da interpretação do fundo microbiológico, o diagnóstico preliminar pode ser feito ou o diagnóstico diferencial pode ser reduzido. Como nossos achados sugerem, o diagnóstico de PPC requer evidências confirmadas de Pneumocystis jiroveci, que não devem ser baseadas em manifestações clínicas e de imagem, mesmo em pacientes sintomáticos de alto risco. A identificação microscópica das formas asco e trófica é a evidência mais intuitiva. A eficiência diagnóstica é amplamente determinada pelo método de coloração da amostra. Historicamente, as colorações convencionais, como Wright's-Giemsa, prata hexaamina e azul de toluidina, estão disponíveis para PCP, mas são demoradas e têm menor sensibilidade. Neste caso, o diagnóstico imediato de PPC foi confirmado no primeiro dia de transferência do paciente para a UTI com o uso de ROSE. O Diff-quick mostrou sua vantagem na identificação de pneumocystis, caracterizado por uma estrutura clara, contraste acentuado e fácil identificação do asco (Figura 5A).

Na aplicação da medicina étnica, o ROSE também tem um valor significativo. Por exemplo, em doenças supurativas, os médicos podem identificar uma gama diversificada de células inflamatórias dominadas principalmente por neutrófilos dentro do fundo microbiológico⁵. Consequentemente, medicamentos com propriedades de limpeza de calor e desintoxicantes podem ser selecionados como tratamentos potenciais para essas condições, como madressilva, dente-de-leão e patrinia, entre outros.

Como o ROSE é um programa adicional que não precisa ser selecionado em pneumologia intervencionista, a realização do ROSE deve aumentar os custos econômicos e de mão de obra. É discutível que o ROSE deva ser usado regularmente. Em termos de benefícios da economia, o tempo e os custos trabalhistas são o que nos preocupa. A principal necessidade de mão de obra adicional é o avaliador. A avaliação ROSE pode ser realizada por um citotecnólogo, patologista ou clínico. Os citotecnólogos são o pessoal mais provável para o procedimento ROSE. No entanto, na prática clínica, os clínicos substituem o papel, mas isso pode exigir uma certa base de treinamento¹⁵. Um estudo anterior mostrou que um programa de treinamento poderia ajudar a melhorar a precisão da avaliação de adequação realizada pelos médicos e eliminar variáveis de confusão²⁰. Além disso, o M-ROSE, como técnica de diagnóstico morfológico, possui fatores subjetivos em seu relato de resultados. Os médicos devem fazer uma avaliação abrangente com base em informações clínicas adicionais.

Recomendamos que hospitais com instalações adequadas e profissionais treinados considerem a implementação do procedimento ROSE em seus departamentos respiratórios ou UTIs, pois pode facilitar a avaliação precoce de doenças respiratórias críticas desafiadoras e orientar o tratamento clínico de forma eficaz.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio citológico	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) soluções de coloração	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Agulhas de seringa descartáveis de 2,5-5 mL	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Luvas de látex sem pó	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Célula estéril indústria	de Jinan Preret e comércio Co., LTD	7101