Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Resumo

Pesquisadores novos no campo epigenético encontrarão no CUT&Tag uma alternativa significativamente mais fácil aos ensaios ChIP. A CUT&Tag beneficiou tremendamente os estudos epigenéticos em populações de células raras e primárias, gerando dados de alta qualidade a partir de muito poucas células. Este protocolo descreve a realização de ensaios H3K4me1 CUT&Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos posteriores de camundongos.

Resumo

Este artigo de protocolo tem como objetivo fornecer aos novos pesquisadores todos os detalhes do uso de Clivagem sob Alvos e Tagmentação (CUT&Tag) para traçar o perfil das localizações genômicas de fatores de ligação à cromatina, marcas de histonas e variantes de histonas. Os protocolos CUT&Tag funcionam muito bem com mioblastos de camundongos e células-tronco musculares (MuSCs) recém-isoladas. Eles podem ser facilmente aplicados a muitos outros tipos de células, desde que as células possam ser imobilizadas por contas de Concanavalina-A. Em comparação com o CUT&Tag, os ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) são experimentos demorados. Os ensaios ChIP requerem o pré-tratamento da cromatina antes que o material cromático possa ser usado para imunoprecipitação. Na reticulação ChIP (X-ChIP), o pré-tratamento da cromatina envolve reticulação e sonicação para fragmentar a cromatina. No caso do ChIP nativo (N-ChIP), as cromatinas fragmentadas são normalmente obtidas pela digestão da nuclease microcócica (MNase). Tanto a sonicação quanto a digestão da MNase introduzem algum viés nos experimentos ChIP. Os ensaios CUT&Tag podem ser concluídos em menos etapas e requerem muito menos células em comparação com os ChIPs, mas fornecem informações mais imparciais sobre fatores de transcrição ou marcas de histonas em vários locais genômicos. O CUT&Tag pode funcionar com apenas 5.000 células. Devido à sua maior sensibilidade e menor sinal de fundo do que os ChIPs, os pesquisadores podem esperar obter dados de pico confiáveis de apenas alguns milhões de leituras após o sequenciamento.

Introdução

O ensaio CUT&Tag foi inventado para compensar algumas falhas evidentes dos ChIPs¹. As duas principais desvantagens dos ChIPs são 1) o viés introduzido ao fragmentar a cromatina e 2) a incompetência para trabalhar com baixo número de células. Os ensaios X-ChIP dependem da sonicação ou da digestão da MNase para obter fragmentos de cromatina, enquanto o N-ChIP usa principalmente a digestão da MNase para obter nucleossomos. A sonicação mostra um viés para locais de cromatina relaxados, como regiões promotoras² e, aparentemente, a digestão da MNase também funciona de forma mais eficiente em fibras de cromatina relaxadas. Além disso, alguns relataram que a digestão da MNase também mostra um viés dependente da sequência de DNA³. Portanto, na etapa de preparação de entrada dos ensaios ChIP, é impossível obter fragmentos de cromatina de todos os tipos de locais genômicos de maneira perfeitamente aleatória. Além disso, os ensaios ChIP normalmente geram sinais de fundo mais altos em comparação com o CUT&Tag e exigem mais de 10 vezes mais leituras do que o CUT&Tag para acentuar onde os picos são ^1,4,5. Isso explica por que os experimentos ChIP têm que começar com tremendamente mais células do que o CUT&Tag. Isso não é um problema ao estudar linhagens celulares, pois elas podem ser passadas repetidamente para atingir um número de células muito alto. No entanto, o ensaio ChIP definitivamente não é uma ferramenta epigenética forte para estudar populações de células primárias raras ou preciosas, embora as células primárias obviamente tenham implicações mais práticas e médicas.

Embora o longo e complicado procedimento ChIP desencoraje alguns pesquisadores de aprender ou usar essa técnica, as pessoas se sentem mais confortáveis com ensaios mais fáceis, como imunocitoquímica (ICC) ou imunofluorescência (IF). Um ensaio CUT&Tag se assemelha essencialmente ao processo de experimentos ICC e IF, mas ocorre apenas em um tubo de ensaio. O CUT&Tag não precisa de cromatina fragmentada para começar e, em vez disso, o genoma deve estar intacto para a ligação do anticorpo¹. No primeiro dia de um experimento ChIP, os pesquisadores normalmente gastam até 4 h preparando as cromatinas fragmentadas dos núcleos com sonicação ou digestão de MNase antes que os pedaços curtos de cromatina possam ser misturados com grânulos de anticorpos ^4,5. Em contraste notável, a carga de trabalho do primeiro dia de um procedimento CUT & Tag é apenas imobilizar as células para os grânulos de concanavalina A e, em seguida, adicionar o anticorpo primário aos grânulos celulares. Isso requer apenas ~ 40 min¹.

Vale ressaltar que o Clivage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) é uma alternativa importante ao CUT&Tag. O CUT&RUN foi estabelecido com base em um mecanismo de trabalho semelhante ao CUT&Tag. No CUT&Tag, os anticorpos guiam a transposase pA/G-Tn5 para todos os locais onde a enzima cortará um pedaço de cromatina e, enquanto isso, o marcará com adaptadores de criação de bibliotecas, enquanto no CUT&RUN, o papel de pA/G-Tn5 é desempenhado pela pA/G-MNase, que executa apenas a parte de corte do trabalho⁶. Portanto, em comparação com o CUT&Tag, o CUT&RUN requer uma etapa adicional que é colar os adaptadores de criação de bibliotecas nas peças de DNA fragmentadas por pA/G-MNase ^7,8. Devido às altas semelhanças entre o CUT&Tag e o CUT&RUN, os pesquisadores familiarizados com o CUT&Tag se adaptarão facilmente para realizar o CUT&RUN com proficiência. No entanto, deve-se notar que existem algumas pequenas diferenças entre o CUT&Tag e o CUT&RUN. Os protocolos CUT&RUN normalmente usam a concentração física de sal (~150 mM) nas etapas de lavagem, enquanto no CUT&Tag, o tampão de lavagem 300-Dig é rico em sal. Portanto, o CUT&Tag é bom para controlar o fundo ao traçar o perfil de marcas/variantes de histonas ou fatores de transcrição, pois essas proteínas se ligam direta e fortemente ao DNA¹. A CUT&Tag pode ter problemas ao traçar o perfil de fatores associados à cromatina que não se ligam diretamente ao DNA e mostram fraca afinidade com a cromatina. Etapas de lavagem com alto teor de sal no CUT&Tag podem remover fatores associados à cromatina e não causar sinais na saída final. Embora existam casos bem-sucedidos em que o CUT&Tag pode ser usado para traçar o perfil de^{algumas proteínas 9} não histonas/não fator de transcrição, ainda recomendamos o CUT&RUN em vez do CUT&Tag para traçar o perfil de proteínas associadas à cromatina fracamente ligadas.

Depois que os mamíferos atingem a idade adulta, seus tecidos musculares esqueléticos ainda contêm células-tronco musculares. Durante a lesão muscular, essas células-tronco podem ser ativadas e sofrer expansão e diferenciação do número de células para regenerar as fibras musculares danificadas¹⁰. Essas células-tronco são conhecidas como células-tronco / satélites musculares (MuSCs). Depois que os MuSCs são isolados de animais ou uma vez ativados por lesão muscular, eles começam a proliferar e se tornam mioblastos.

Para obter MuSCs da digestão do músculo esquelético de camundongos, marcadores de superfície MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 e α7-integrina (Itga7) são frequentemente usados individualmente ou em combinações para enriquecer MuSCs durante a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ¹¹ . Foi demonstrado que Cd31^-/Cd45^-/Sca1^-/Vcam1⁺ é provavelmente a melhor combinação de marcadores para obter MuSCs >95% puros¹². O FACS pode isolar MuSCs puros logo após a digestão dos músculos frescos. No entanto, se o projeto experimental não exigir MuSCs puros logo em seu isolamento, o pré-plaqueamento é mais econômico do que o FACS para obter mioblastos >90% puros (progênie MuSC).

MuSCs recém-isolados de camundongos não proliferam eficientemente em meio F10 de Ham suplementado com soro fetal bovino (FBS). Para expandir melhor o número de células de MuSCs e obter mioblastos suficientes, deve-se usar soro de crescimento bovino (BGS) em vez de FBS. No entanto, se o BGS não estiver disponível, o meio completo F10 de Ham (contendo cerca de 20% de FBS) pode ser misturado com um volume igual de meio condicional de células T para promover drasticamente a expansão do mioblasto¹³. Portanto, este protocolo também descreverá a preparação de meios MuSC condicionados por meio de células T.

Mais importante ainda, este protocolo fornece um exemplo completo da realização de ensaios H3K4me1 CUT&Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos dos membros posteriores de camundongos. Observe que este protocolo também se aplica a outros tipos de células e marcas de histonas e variantes de histonas, e os leitores só precisam otimizar o número de células ou quantidades de anticorpos para seus casos com base no enriquecimento das marcas ou variantes de histonas específicas que estudam.

Para ser usado no CUT&Tag ou CUT&RUN, o Tn5 ou MNase precisa ser fundido com a proteína A ou proteína G para produzir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase ou pG-MNase. Aparentemente, tanto a proteína A quanto a proteína G podem ser fundidas nessas enzimas ao mesmo tempo para gerar pA/G-Tn5 ou pA/G-MNase. A proteína A e a proteína G apresentam afinidades diferenciais com IgGs de diferentes espécies. Portanto, a fusão da proteína A e da proteína G na enzima pode superar esse problema e tornar a enzima compatível com anticorpos de várias espécies.

Protocolo

Os métodos apresentados neste manuscrito são todos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório de Guangzhou. Os camundongos usados para gerar os resultados representativos deste manuscrito foram alojados e mantidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório de Guangzhou.

1. Isolamento de mioblastos dos músculos dos membros posteriores do camundongo (Exemplo de uso de 1 camundongo)

1. Dilua o ácido acético glacial com ddH₂O a 0,02 M e autoclave-o.
2. Dilua o colágeno (da cauda de rato) a 0,1 mg / mL com ácido acético 0,02 M.
3. Adicione esta solução de colágeno em placas de cultura para revestir o fundo da placa em uma incubadora de células a 37 ° C durante a noite.
4. Antes de usar, remova a solução de colágeno e lave o prato duas vezes com 1x PBS. A solução de colágeno pode ser reutilizada por 8 a 10 vezes.
5. Sacrifique um rato de 8 a 12 semanas de idade. (Camundongos velhos têm baixos rendimentos de MuSCs e mioblastos.)
6. Isole e coloque todos os músculos dos membros posteriores do camundongo em um prato de 10 cm.
7. Use 1x PBS (com penicilina/estreptomicina) para enxaguar os músculos 4 vezes. Após cada enxágue, sempre transfira os músculos para um novo prato.
8. Após o enxágue final, remova o PBS e pique os músculos com uma tesoura.
9. Adicione 6 mL de 1x PBS contendo dispase II (1,1 U/mL) e colagenase II (830 U/mL) para digerir os músculos picados, e a digestão deve durar ~1,5 h.
10. Para realizar a digestão, transfira os músculos picados para um tubo em banho-maria a 37 °C ou deixe diretamente os músculos picados dentro do prato e coloque-o em uma incubadora de células CO₃₇ °C 2.
11. Se estiver usando uma incubadora de células para digerir, balance o prato a cada 15-30 minutos para misturar bem a digestão.
    NOTA: Dispase II deve ser feito primeiro como estoque de 11 U / mL com meio DMEM (sem soro) e colagenase II deve ser feito como estoque de 10.000 U / mL com 1x PBS.
12. Quando a digestão estiver completa, use uma pipeta de plástico de 10 mL para lavar os tecidos digeridos para cima e para baixo várias vezes para homogeneizar completamente a mistura de digestão.
13. Adicione 10 mL de meio de crescimento MuSC/Myoblast para retardar a digestão. Detalhes sobre a preparação de meios de crescimento MuSC/Myoblast podem ser encontrados na Seção 2.
14. Passe a mistura por um filtro de 70 μm. Use 1x PBS para enxaguar a placa de digestão e passe este PBS pelo filtro também, a fim de coletar todas as células da placa de digestão.
15. Centrifugue a 350 x g durante 10 min e elimine o sobrenadante com vácuo.
16. Ressuspenda o pellet celular com 20 mL de 1x PBS e passe as células por um filtro de 40 μm.
17. Centrifugue a 350 x g durante 5 min e retire o sobrenadante com vácuo.
18. Use 20 mL de meio de crescimento MuSC/Myoblast para ressuspender as células e semear as células em uma placa de plástico normal de 10 cm. Os MuSCs não podem se prender ao fundo da placa durante esse período e permanecerão flutuando principalmente na mídia.
    NOTA: Este é o primeiro pré-revestimento em placas de plástico.
19. Após 1,5 h, agite brevemente a placa e transfira o líquido para duas placas revestidas de colágeno de 10 cm, cada placa contendo 10 mL de cultura. Agora, os MuSCs se fixarão e crescerão nas placas revestidas de colágeno. Mude a mídia após 2 dias. As placas revestidas de colágeno são preparadas como nas etapas 1-4 desta seção.
20. Depois de mais um dia, passe as células: remova o meio, lave as células uma vez com 1x PBS e tripsinize as células.
21. Use o meio de crescimento MuSC/Myoblast para lavar as células das placas, mova as células para uma nova placa de plástico e incube na incubadora de células por 40 min.
    NOTA: Este é o segundo pré-revestimento em placas de plástico.
22. Despeje a cultura em uma nova placa de plástico e incube na incubadora de células por mais 20 min.
    NOTA: Este é o terceiro pré-revestimento em placas de plástico.
23. Em seguida, divida o sobrenadante na placa em 8 placas de 10 cm revestidas de colágeno para subcultura das células. A proporção de passagem aqui é 2: 8 (1: 4). Após três vezes de pré-plaqueamento descrito acima, os mioblastos podem atingir mais de 90% de pureza. Portanto, após este ponto, não há necessidade de pré-placa ao passar os mioblastos.

2. Preparação de meios de crescimento MuSC/Myoblast (Exemplo de preparação de 5 camundongos)

1. Sacrifique 5 camundongos jovens e saudáveis do tipo selvagem, isole os baços e enxágue os baços uma vez com 1x PBS (com penicilina/estreptomicina).
2. Use uma tesoura para remover as partes/manchas escuras no baço, se houver. Descarte o baço se a maior parte dele ficar preta.
3. Coloque todos os 5 baços em um filtro de 40 μm na parte superior de um tubo de 50 mL.
4. Abra uma embalagem estéril de seringa de 1 mL, retire o êmbolo e descarte o cilindro.
5. No filtro de 40 μm, segure a rolha de borracha e use o apoio do polegar do êmbolo para triturar e dissociar os tecidos do baço em células únicas. Tenha cuidado para não tocar e contaminar o descanso do polegar do êmbolo ao rasgar a embalagem da seringa.
6. Ao triturar os baços, ocasionalmente use 1x PBS para lavar as células dissociadas do baço no tubo de 50 mL embaixo do filtro.
7. Depois de todas as células do baço terem sido lavadas no tubo de 50 ml através do filtro, centrifugue o tubo a 500 x g durante 10 min.
8. Use 1 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos para ressuspender o pellet. Lise os glóbulos vermelhos por ~ 1 min.
   NOTA: 10x tampão de lise de glóbulos vermelhos contém 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ e 1 mM de sal dissódico EDTA em ddH₂O. Filtre para esterilizar e não autoclave. Diluir com ddH₂O a 1x antes de usar.
9. Encha o tubo de 50 mL com 1x PBS para interromper o processo de lise dos glóbulos vermelhos.
10. Coe a suspensão celular novamente com um filtro de 40 μm e, em seguida, centrifugue a 500 x g por 10 min.
11. Ressuspenda as células com 2 mL de mídia completa RPMI-1640 (mídia RPMI-1640 com 10% de FBS e penicilina / estreptomicina) com pipetagem muito suave.
12. Adicione mais mídia completa RPMI-1640 no tubo e misture bem. Distribuir a suspensão celular em dez balões de cultura T75. O volume final de cultura em cada frasco de cultura T75 deve ser de 20 ml.
13. Adicione 10 μL de estoque de Concanavalina A em cada frasco de cultura T75 e misture bem. A concanavalina A ativa a proliferação de células T.
    NOTA: O estoque de concanavalina-A é de 4 mg / mL e preparado dissolvendo a concanavalina A em 1x PBS. A Concanavalina-A em si é usada aqui, e não a confunda com as contas de Concanavalina-A usadas nos ensaios CUT&Tag mais tarde.
14. Após 48 h, suplemente cada frasco T75 com mais 20 mL de mídia completa RPMI-1640 para que o volume total some 40 mL.
15. Mais 24 h depois, recolher toda a cultura em cada balão T75 e centrifugar a 600 x g durante 3 min.
16. O sobrenadante é um meio condicional de células T e pode ser armazenado a -20 °C a -80 °C por até 2 meses. Descarte os pellets das células do baço. Antes de usar, descongele o meio condicional de células T e esterilize ainda mais o meio usando um filtro de 0,22 μm.
17. Para fazer o meio F10 completo da Ham, adicione 100 mL de FBS, 300 μL de estoque de bFGF e 6 mL de penicilina/estreptomicina em 500 mL de mídia F10 da Ham.
    NOTA: o estoque de bFGF é de 5 μg/mL e preparado pela dissolução do bFGF no meio F10 da Ham.
18. Misture o meio completo F10 do Presunto com o meio condicional de células T filtrado descrito acima na proporção de 1:1 para fazer o meio de crescimento MuSC/Myoblast.

3. CUT&Tag com mioblastos (Exemplo de 3 reações CUT&Tag)

1. Preparação de reagentes-chave
   1. Purificar a pA/G-Tn5 transposase internamente da cultura bacteriana utilizando o método publicado¹⁴. Esta enzima só atinge sua forma funcional até ser montada com adaptadores de DNA de criação de bibliotecas. Mais importante ainda, pA / G-Tn5 está disponível comercialmente em muitas fontes.
   2. Os oligos para fazer adaptadores são mostrados na Tabela 1. Especificamente, recoza Oligo-Rev com Oligo-A e Oligo-B, respectivamente, para fazer o Adaptador-A e o Adaptador-B de fita dupla de acordo. Os detalhes do recozimento para fazer os adaptadores podem ser encontrados em outro lugar¹⁴.
   3. Incube o Adaptador-A e o Adaptador-B com pA/G-Tn5 transposase à temperatura ambiente (RT) por 2 h. Então, essa transposase assumirá sua forma funcional. Nas seções seguintes deste manuscrito, a forma funcional de pA/G-Tn5 será denominada pA/G-Tn5a.
      NOTA: Se o pA/G-Tn5 for comprado em vez de fabricado internamente, certifique-se de esclarecer se o item comprado é pA/G-Tn5 montado com adaptadores (em outras palavras, pronto para uso) ou se é apenas a própria enzima pA/G-Tn5. Se for apenas a enzima, prepare os dois adaptadores descritos acima e monte-os no pA/G-Tn5 antes de finalmente usar esta enzima para CUT&Tag.
   4. Para as receitas do buffer de ligação, buffer de lavagem, buffer de lavagem de escavação, buffer de 300 escavações e buffer de tagmentação, os leitores também podem consultar Kaya-Okur et ^al.1.
   5. Prepare o tampão de ligação, que contém 20 mM HEPES pH 7.5, 10 mM KCl, 1 mM CaCl₂ e 1 mM MnCl₂.
   6. Prepare o tampão de lavagem, que contém 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM de espermidina e 1x coquetel inibidor de protease.
   7. Faça a digitonina como um estoque concentrado em DMSO e, em seguida, prepare o tampão de lavagem por escavação adicionando digitonina ao tampão de lavagem a uma concentração de 0,5 mg / mL.
   8. Prepare o tampão de anticorpos adicionando EDTA a uma concentração de 2 mM e BSA a uma concentração de 0,1%, no tampão Dig-wash.
   9. Prepare tampão de 300 escavações contendo 20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, 1x coquetel inibidor de protease e 0,1-0,5 mg/mL de digitonina.
   10. Prepare o tampão de marcação complementando o tampão de 300 escavações com 10 mM MgCl₂. O MgCl₂ pode ativar a atividade enzimática de pA/G-Tn5a.
       NOTA: As informações para outros materiais são fornecidas no arquivo Tabela de Materiais .
2. Ativação do cordão de concanavalina A
   1. Misture 30 μL de grânulos de Concanavalina A (10 μL para cada reação) em 300 μL de tampão de ligação em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Inverta várias vezes para misturar bem. Coloque o tubo em um rack magnético. Depois que o líquido estiver claro, remova o sobrenadante.
   2. Remova o tubo do rack magnético, adicione 300 μL de tampão de ligação no tubo, misture bem e divida uniformemente em 3 tubos de uma faixa de tubo de 8 PCR. Designe cada tubo com uma reação CUT&Tag.
   3. Coloque a faixa do tubo 8-PCR em um rack magnético e espere até que o líquido esteja claro.
   4. Aspirar o sobrenadante e retirar os tubos da cremalheira magnética. Adicione 10 μL de tampão de ligação em cada tubo e misture bem. Coloque as esferas preparadas no gelo ou a 4 °C até que as células estejam prontas para prosseguir.
3. Ligando células em contas de Concanavalina-A
   1. Tripsinize mioblastos de camundongos cultivados das placas, lave as células uma vez com RT 1x PBS e, eventualmente, ressuspenda as células em tampão de lavagem em RT. Evite a tripsinização excessiva, pois isso pode comprometer a afinidade da membrana celular com as contas de Concanavalina A.
   2. Ajuste a densidade celular para cerca de 7 x 10⁵ células/mL em tampão de lavagem de modo que 100 μL de suspensão celular contenha cerca de 70.000 células, o suficiente para uma reação CUT&Tag.
   3. Pipetar 100 μL da suspensão celular em cada tubo da faixa de tubo 8-PCR, que já contém 10 μL de grânulos de Concanavalina A preparados. Misture bem e incube em uma coqueteleira "movimento de gangorra" por 10 min em RT.
   4. Coloque a faixa de tubo 8-PCR em um rack magnético. Espere até que desapareça e remova o sobrenadante.
   5. Para avaliar se as contas de Concanavalina-A sequestraram eficientemente as células, verifique o sobrenadante ao microscópio para ver quantas células restam no sobrenadante. Após a etapa de ligação do grânulo Concanavalin-A, muito poucas ou nenhuma célula deve ser observada no sobrenadante.
4. Incubação das células com um anticorpo primário
   1. Para cada amostra, diluir 1 μL de anticorpo H3K4me1 em 50 μL de tampão anticorpo e adicionar o anticorpo diluído em cada tubo de amostra. Misture bem as esferas com o anticorpo diluído, invertendo os tubos várias vezes. Coloque as amostras no agitador "movimento de gangorra" para incubar a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Como mencionado pelo Dr. Steven Henikoff¹, não foi necessário usar um controle negativo de IgG em todos os ensaios CUT&Tag. Em comparação com os ChIPs, os ensaios CUT&Tag vêm com sinal de fundo muito menor ou inexistente. Portanto, o uso de IgG para realizar um ensaio CUT&Tag de "controle negativo" não introduz nenhuma informação útil. Por outro lado, o uso de um anticorpo validado pelo CUT&Tag para realizar um controle positivo é importante para avaliar se o ensaio CUT&Tag funcionou.
5. Incubação das células com um anticorpo secundário
   1. Na manhã do dia seguinte, coloque as amostras no suporte magnético e espere até que as amostras desapareçam.
   2. Remova o sobrenadante, que é o anticorpo primário. Não há necessidade de lavar as contas; Adicione diretamente 50 μL de anticorpo secundário diluído (1:100) em cada tubo de amostra.
      NOTA: O anticorpo secundário é diluído com tampão Dig-wash na proporção de 1:100. Para permitir um reconhecimento mais eficiente de pA/G-Tn5a, os anticorpos secundários não devem ser conjugados com nenhuma molécula ou grupo, como HRP, biotina ou fluoróforos.
   3. Misture bem e incube no agitador "movimento de gangorra" em RT por 1 h.
   4. Coloque as amostras de volta no rack magnético, espere até que as amostras desapareçam e descarte o sobrenadante.
   5. Adicione 200 μL de tampão Dig-wash em cada tubo e inverta várias vezes para lavar os anticorpos excessivos.
   6. Coloque-o de volta no rack magnético, espere até que ele limpe e remova o sobrenadante. Repita esta lavagem mais duas vezes para remover completamente o excesso de anticorpos não ligados.
6. Incubação das células com pA/G-Tn5a
   1. Após a última lavagem, coloque as amostras no rack magnético, espere até que as amostras desapareçam e remova todo o líquido do tubo. Para cada tubo de amostra, adicione 100 μL de tampão de 300 escavações contendo pA/G-Tn5a a 0,04 μM. Misture bem e incube no agitador de movimento da gangorra por 1 h em RT.
   2. Coloque o rack magnético. Aguarde até que as amostras desapareçam e remova o sobrenadante.
   3. Adicione 200 μL de tampão 300-Dig em cada amostra, misture bem e coloque no agitador para lavar a amostra por 3 min em RT.
   4. Coloque o rack magnético. Aguarde até que as amostras desapareçam e remova o sobrenadante. Repita esta lavagem mais duas vezes para remover o excesso de pA/G-Tn5a e diminuir o fundo.
7. Clivagem e marcação dos genomas
   1. Após a última lavagem, coloque as amostras no rack magnético e pipete completamente o líquido para fora do tubo. Para cada amostra, adicione 50 μL de tampão de marcação. Misturar bem e incubar numa máquina de PCR a 37 °C durante 1 h. Não use a função de aquecimento da tampa da máquina de PCR.
      NOTA: Opcionalmente, devido ao desgaste do material durante a etapa de purificação do DNA genômico seguinte, alguns DNAs spike-in podem ser adicionados ao buffer de tagmentação para que o spike-in apareça nos resultados finais do sequenciamento e possa ser usado para normalizar os dados. O método para preparar e usar o DNA spike-in pode ser encontrado em outro lugar¹⁴.
8. Purificação total do DNA genômico
   1. Após a marcação, adicione mais 150 μL de tampão de marcação para cada amostra. O volume total agora é de 200 μL.
   2. Em seguida, para cada amostra, adicione 10 μL de EDTA 0,5 M, 3 μL de SDS a 10% e 2,5 μL de Proteinase K. Vortex para misturar bem e incubar a 55 ^° C por 2 h.
   3. Pipetar cada amostra em 200 μL de fenol/clorofórmio em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e vórtice por 10 s. Centrifugue a 18.000 x g por 5 min. Transfira a camada superior para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
   4. Adicione 200 μL de clorofórmio em cada tubo e vórtice por 10 s. Centrifugue a 18.000 x g por 5 min.
   5. Aspire a camada superior em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Em seguida, para cada amostra, adicione 550 μL de etanol a 100% para precipitar o DNA a -80 °C por 1 h. Para visualizar melhor o pellet de DNA, adicione 1 μL de glicogênio 20 mg/mL.
   6. Centrifugue na velocidade máxima (>18.000 x g) por 15 min para pellet o DNA.
   7. Despeje cuidadosamente o sobrenadante, lave o pellet de glicogênio / DNA com etanol a 75% uma vez e centrifugue novamente na velocidade máxima por 5 min.
   8. Remova o etanol a 75% e ressuspenda o pellet de glicogênio / DNA com 21 μL de ddH₂O.
9. Preparação e sequenciamento de bibliotecas
   1. Configure o PCR de preparação da biblioteca. Para indexar as amostras a serem sequenciadas juntas, use um primer N7XX Illumina diferente para cada amostra e um primer N5XX Illumina universal. Se indexar mais de 12 amostras, também serão necessários diferentes primers N5XX Illumina. A Illumina fornece doze primers N7XX e oito primers N5XX, portanto, o número total de combinações N7XX com N5XX é 12 x 8 = 96. A configuração da reação de PCR é mostrada na Tabela 2.
   2. Determine aproximadamente o número do ciclo de PCR na PCR de preparação de biblioteca pelo número de célula usado no ensaio CUT&Tag. Normalmente, para um ensaio CUT&Tag usando 50.000-100.000 células, 9-12 ciclos são suficientes, e números de células entre 10.000-50.000 podem exigir até 14 ciclos. O programa de PCR é exibido na Tabela 3.
      NOTA: Para a maioria dos ensaios CUT&Tag, se o anticorpo funcionou corretamente, um número de ciclo de PCR entre 9-14 deve sempre gerar uma biblioteca útil para sequenciamento. Uma boa biblioteca é normalmente de 10-50 ng/μL (determinada pelo ensaio Qubit) em concentração e 20-30 μL em volume. Pelo contrário, se o anticorpo não funcionou de forma eficiente e específica, então apenas aumentar o número do ciclo não pode salvar os experimentos. Números de ciclo excessivos não beneficiam em nada os resultados e, em vez disso, introduzem mais duplicatas de PCR, o que mais tarde complicará a análise dos dados.
   3. Use algumas esferas de purificação/seleção de tamanho de DNA disponíveis comercialmente para purificar o DNA da biblioteca e selecionar o DNA de tamanhos desejáveis.
   4. Dilua uma pequena alíquota da biblioteca purificada com água e use-a para qPCR com primers específicos do locus para verificar os enriquecimentos como nos experimentos ChIP-qPCR. Antes de sequenciar a biblioteca, isso pode ajudar a determinar se o CUT&Tag funcionou.
   5. Realize sequenciamento e análise de dados de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Os kits CUT&Tag estão disponíveis comercialmente em algumas empresas, e um exemplo pode ser encontrado no arquivo Tabela de Materiais .

Resultados

Antes de ligar as células aos grânulos de Concanavalina-A, verifique a suspensão celular ao microscópio. Assim, depois de incubar as células com contas de Concanavalina A, coloque os tubos de amostra no suporte magnético e o sobrenadante deve ser observado novamente usando um microscópio. Isso é para avaliar a eficiência com que as células foram capturadas pelas contas de Concanavalina-A. O tampão de lavagem contendo 7 x 10⁵ células/mL deve se parecer com a Figura 1A ao microscópio. Em contraste, a Figura 1B mostra o sobrenadante após a ligação do cordão de Concanavalina-A, onde os grânulos retiraram todas as células. Não adianta prosseguir para as etapas seguintes do CUT&Tag se as contas de Concanavalina A nem mesmo capturam células de forma eficiente. O tampão de lavagem não deve conter nenhum conteúdo sérico ou EDTA/EGTA, pois eles podem abolir a ligação da membrana celular aos grânulos de Concanavalina-A. A albumina sérica bovina, no entanto, não interfere na ligação da Concanavalina A às células.

Depois de fazer as bibliotecas CUT&Tag por PCR, uma pequena alíquota da biblioteca (3-4 μL) pode ser eletroforesada em um gel de agarose a 1,2-1,5% para testar se a biblioteca é boa. A Figura 2 mostra o exemplo de bibliotecas CUT&Tag H3K4me1 bem-sucedidas que criamos. Em uma marca de histona ou variante de histona CUT&Tag, a maioria das unidades clivadas são aparentemente mononucleossomos, embora dois nucleossomos também possam ser cortados juntos. Três nucleossomos cortados e marcados juntos seriam muito raros. Portanto, uma matriz de nucleossomos contendo mononucleossomos, dinucleossomos e muito poucos trinucleossomos deve ser observada na eletroforese das bibliotecas CUT&Tag de marcas de histonas. Os nucleossomos contêm 147 pb de DNA, mas com os adaptadores de sequenciamento adicionados pela transposase Tn5 e PCR de biblioteca, o tamanho total de um mononucleossomo CUT&Tagged deve chegar a 300 pb, como mostrado na Figura 2.

Antes de gastar dinheiro no sequenciamento de alto rendimento das bibliotecas CUT&Tag, outro método de controle de qualidade é realizar qPCR com primers específicos do locus. Isso equivale a executar ChIP-qPCR. Além disso, os primers específicos do locus no CUT&Tag qPCR são projetados com base nos mesmos princípios dos primers ChIP-qPCR. A Figura 3 mostra a amplificação de qPCR de diferentes locais no locus do gene Myod1. Myod1 codifica o fator de transcrição mestre, MyoD, que determina a linhagem do músculo esquelético durante a miogênese¹⁵. Conforme mostrado na Figura 3, H3K4me1 é altamente enriquecido no intensificador central (CER) e na região reguladora distal (DRR) do locus Myod1. CER e DRR são regiões melhoradoras muito bem estabelecidas para Myod1¹⁶. Isso é consistente com o fenótipo bem documentado que H3K4me1 marca especificamente como intensificadores comissionados¹⁷. Além disso, a Figura 3 mostra que o nível de H3K4me1 é muito baixo na região regulatória proximal (PRR) porque os nucleossomos na região proximal dos promotores ativos são normalmente modificados com H3K4me3¹⁸ em vez de H3K4me1. Todos os pares de primers para esses loci avaliados foram publicados anteriormente^19,20, e as sequências podem ser encontradas na Tabela 4. Normalmente, após os controles de qualidade por eletroforese de DNA de biblioteca e qPCR em loci específicos, os pesquisadores estarão confiantes para prosseguir com o sequenciamento.

Figura 1: Mioblastos ressuspensos em tampão Wash. Vistas microscópicas tiradas (A) antes e (B) depois da encadernação do cordão de Concanavalina-A. O painel B mostra que quase não há células na suspensão após a incubação do grânulo de concanavalina-A, indicando que as células foram capturadas com eficiência pelos grânulos. As pequenas partículas no painel B provavelmente são as contas excessivas de Concanavalina-A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Eletroforese das bibliotecas CUT&Tag. Três ensaios independentes H3K4me1 CUT&Tag foram realizados, e cada um foi transformado em uma biblioteca de sequenciamento usando primers Illumina e PCR. Cada H3K4me1 CUT&Tag usou 70.000 mioblastos de camundongos. As bibliotecas contêm principalmente mononucleossomos marcados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: amplificação de qPCR de diferentes locais no locus do gene Myod1 . qPCR mostra que em mioblastos de camundongos, a marca H3K4me1 é altamente enriquecida nas regiões intensificadoras do gene Myod1 , o que se alinha com as conclusões publicadas. CER e DRR são intensificadores publicados de Myod1 que estão localizados a montante do promotor Myod1 . Observe que o PRR não tem acúmulo de H3K4me1, e isso também é consistente com o fato de que os promotores ativos são marcados principalmente com H3K4me3. Os enriquecimentos foram calculados normalizando para o enriquecimento de H3K4me1 no "deserto genético" da amostra "Repeat 1". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome	Sequências (5'-3'):
Oligo-Rev	phos-CTGTCTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

Tabela 1: Sequências oligo para fazer o Adaptador-A e o Adaptador-B a serem montados na transposase pA/G-Tn5.

Fração	Volume
DNA genômico purificado após reação CUT&Tag	21 μL
Primer N5XX (10 μM)	2 μL
Primer N7XX (10 μM)	2 μL
NEBPróximo 2× PCR Master Mix de alta fidelidade	25 μL
	Total 50 μL

Tabela 2: Configuração de PCR para preparação da biblioteca CUT&Tag usando primers de indexação Illumina. Se estiver usando um kit CUT&Tag comercial que contenha reagentes de PCR de biblioteca, como a mistura de DNA polimerase, siga o manual específico desse kit para configurar o PCR de biblioteca.

Passo	Temperatura	Hora	Número do ciclo
1	72 oC	3 minutos	1
2	95 oC	3 minutos	1
3	98 oC	10 s	9 a 14
4	60 oC	5 s, depois vá para o passo 3
5	72 oC	1 minuto	1
6	4 oC	segurar	N/A

Tabela 3: Programa de PCR para preparação da biblioteca CUT&Tag usando primers de indexação Illumina.

Localização	Sequências de primers (5'-3')
CER	Para: GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev: CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	Para: TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Rev: TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	Para: GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Rev: ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
DRR	Para: TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Rev: CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	Para: GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Rev: GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1	Para: CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Rev: CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2	Para: GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Rev: GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
Intensificador de IgH	Para: ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Rev: CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Deserto de Gene	Para: TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev: GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Tabela 4: Primers específicos de locus para testar o enriquecimento de H3K4me1 em diferentes locais no gene Myod1 .

Discussão

O número específico de células necessário em uma determinada reação CUT&Tag depende completamente do enriquecimento das marcas/variantes de histonas ou proteínas de ligação à cromatina que devem ser testadas. Normalmente, para marcas de histonas muito enriquecidas, como H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac, etc., 25.000-50.000 mioblastos são suficientes para uma reação CUT&Tag. No entanto, algumas proteínas raras de ligação à cromatina podem exigir até 250.000 células. O número de células usado nos ensaios CUT&Tag é crítico, o que, se não for bem manuseado, normalmente causa a falha do ensaio. Usar um número excessivo de células em uma reação CUT & Tag é prejudicial, especialmente ao testar marcas de histonas muito enriquecidas. Começar com muitas células significa anticorpos insuficientes alocados para cada célula. O CUT&Tag não só funciona com números de células muito baixos, como também pode ser aplicado no nível¹ de uma única célula.

Acima de tudo, o uso de um anticorpo confiável e validado com alta afinidade e especificidade é sempre a chave para um ensaio CUT&Tag bem-sucedido. Assim como os ensaios de ChIP, imunoprecipitação (IP) e IF, o CUT&Tag também requer o tipo de anticorpos que podem reconhecer os antígenos naturalmente dobrados¹. Em contraste, os anticorpos que reconhecem apenas peptídeos relaxados no Western blot devem ser estritamente evitados no CUT&Tag.

Se otimizar o número de células ou usar um anticorpo validado por imunofluorescência ou bem citado ainda não puder resolver o problema de sinal ruim em um ensaio CUT & Tag, verifique se a proteína de interesse é uma proteína associada à cromatina que se liga fracamente ou nem mesmo se liga diretamente ao DNA. Nesse caso, como mencionado anteriormente, mude para usar CUT&RUN em vez de CUT&Tag. Alternativamente, uma leve fixação, como 5 min em paraformaldeído a 0,5% (seguido por 10 min de têmpera em glicina 0,1 M), pode ser um método que vale a pena ser testado. No entanto, como nunca praticamos a fixação em nenhum ensaio CUT&Tag, nem sequer nos deparamos com a necessidade de fixar as células antes de realizar o CUT&Tag, nenhum comentário adicional pode ser feito por nós em relação à reticulação.

Entendemos que algumas versões dos protocolos CUT&Tag podem alegar que tanto o RT (2 h) quanto o 4 ° C (durante a noite) para a etapa primária de incubação de anticorpos podem gerar resultados decentes²¹. No entanto, recomendamos fortemente o uso de 4 ° C (durante a noite) em vez de RT por 2 h. Por outro lado, estender o tempo de incubação por mais de uma noite também não é recomendado.

Em relação à sensibilidade, controle de fundo e grau de complexidade para os pesquisadores lidarem, o CUT&Tag é superior aos ensaios ChIP. Se algumas desvantagens tiverem que ser colocadas para o CUT&Tag em comparação com o ChIP, a única delas é que os protocolos CUT&Tag não incluem um método de normalização interna, como o uso de "Input" em um ensaio ChIP¹. Portanto, ao comparar as alturas de pico entre as amostras usando o CUT & Tag, os pesquisadores devem equalizar o número de células entre as amostras para começar. Além disso, é fundamental incluir réplicas técnicas.

Este protocolo apresenta todos os detalhes da execução do CUT&Tag em mioblastos de camundongos, fornecendo um exemplo bem-sucedido de H3K4me1 CUT&Tag neste tipo de célula. O método descrito aqui pode ser aplicado diretamente a MuSCs recém-isolados sem nenhuma modificação. Além disso, experimentos CUT&Tag em marcas de histonas, variantes de histonas ou fatores de transcrição em outros tipos de células também podem ser realizados seguindo este protocolo. Para miotubos ou miofibras, os núcleos podem ser isolados primeiro, e o CUT&Tag pode então ser realizado nos mionúcleos. Ao fazer isso, pode-se tratar os núcleos da mesma forma que as células são tratadas neste protocolo CUT & Tag. Miotubos e miofibras são células multinucleadas e não testamos se os miotubos ou miofibras podem ser ligados diretamente aos grânulos de Concanavalina A, embora isso possa ser viável.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Colágeno	Corning	354236
Colagenase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Concanavalin-A Beads	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Fetal soro bovino	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 anticorpo	abcam	ab8895
Mídia F10 do Presunto	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hiperativo Universal CUT& Kit de Ensaio de Etiquetas para Illumina	Vazyme	TD903	Este kit foi testado por nós para funcionar bem
Rack magnético para tubos EP de 1,5 mL	Qualityard	QYM06
Rack magnético para 8 listras de tubo PCR	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Para reação de PCR
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Precisa ser montado com adaptadores antes do uso
Coquetel inibidor de protease	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 Thermo	Fisher Scientific
Anticorpo secundário (Cobaia anti-coelho IgG)	Anticorpos on-line	ABIN101961
espermidina	Kit de Índice TruePrep Sigma-Aldrich	S2626
V2 para Illumina	Vazyme	TD202	Este kit fornece primers Illumina N7XX e N5XX
Contas de Limpeza DNA VAHTS	Vazyme	N411	Pode substituir as contas Ampure XP. Pode purificar CUT& Marcar bibliotecas e selecionar fragmentos de DNA por tamanho