Coleta de sangue da veia subclávia em ratos conscientes

Resumo

Apresentamos aqui uma combinação de métodos eficazes de restrição em ratos e punção da veia subclávia que permitem a coleta de sangue rápida, segura e repetida em ratos sem anestesia.

Resumo

Existem vários métodos estabelecidos para a obtenção de repetidas amostras de sangue de ratos, sendo os métodos mais comumente empregados a amostragem da veia caudal lateral sem anestesia e a amostragem da veia jugular com anestesia. No entanto, a maioria desses métodos requer assistência e equipamentos anestésicos e, por vezes, apresentam dificuldades em termos de coleta de sangue ou da má qualidade das amostras de sangue. Além disso, esses métodos de coleta de sangue consomem tempo e recursos humanos significativos quando amostras repetidas de sangue são necessárias para um grande número de ratos. Este estudo apresenta uma técnica de coleta repetitiva de sangue em ratos não anestesiados por um único indivíduo proficiente . Amostras de sangue altamente satisfatórias podem ser obtidas puncionando a veia subclávia. O método demonstrou uma impressionante taxa de sucesso global de 95%, com um tempo mediano de apenas 2 min desde a contenção do rato até a conclusão da coleta de sangue. Além disso, a realização de coletas consecutivas de sangue dentro da faixa designada não causa nenhum dano aos ratos. Este método vale a pena promover para a coleta de sangue, especialmente em estudos farmacocinéticos em larga escala.

Introdução

Os ratos são um dos animais experimentais mais comuns, e existem muitas maneiras de obter amostras de sangue. Para experimentos que envolvam uma única coleta de sangue na fase final, uma quantidade suficiente de sangue pode ser obtida por punção cardíaca ou coleta de sangue da aorta abdominal¹. No entanto, alguns estudos requerem repetidas coletas de sangue de ratos para análises de rotina de sangue ou bioquímicas, especialmente em estudos farmacocinéticos e toxicológicos, onde coletas repetidas de sangue são necessárias para determinar a absorção, distribuição e metabolismo de drogas².

Atualmente, embora a coleta de sangue da veia caudal seja o método mais comum para coleta de sangue de ratos, apesar de não necessitar de anestesia, esse método pode ser desafiador para coletas repetidas, e o volume de sangue coletado é relativamente pequeno ^3,4. Além disso, embora o sangue possa ser coletado das veias safena e peniana, a quantidade de sangue obtida é limitada, sendo necessária anestesia ^1,5. Além disso, amostras de sangue coletadas do plexo venoso submandibular, bem como das veias sublingual, jugular e subclávia fornecem amostras de melhor qualidade, mas tipicamente requerem anestesia ou assistência de múltiplos indivíduos 1,6,7,8,9. Finalmente, a coleta de sangue do seio retro-orbital/canal não só necessita de anestesia, mas também pode potencialmente causar lesão e estresse aos ratos⁹.

A qualidade das amostras de sangue tipicamente obtidas das principais veias é geralmente do mais alto padrão¹. Atualmente, alguns estudos constataram que a microamostragem contínua através da veia jugular é um método muito adequado para pesquisa toxicológica em ratos, embora esse método geralmente necessite de cateterização da veia jugular10,11,12. Portanto, vale a pena explorar como obter amostras de sangue de alta qualidade de acordo com o princípio 3R da pesquisa animal sem intervenção cirúrgica. O objetivo deste estudo foi apresentar um método eficiente de extração de sangue da veia subclávia em ratos. Esta técnica permite a rápida coleta de amostras satisfatórias através de um procedimento unipessoal, sem a necessidade de anestesia.

Protocolo

Este estudo seguiu as diretrizes descritas na 8ª edição do Guide for the Care and Use of Laboratory Animals¹³. A pesquisa recebeu aprovação do Comitê de Ética do Lanzhou University Second Hospital e foi documentada em conformidade com as diretrizes do ARRIVE 2.0¹⁴. Doze ratos Wistar saudáveis (seis machos pesando 290-330 g e seis fêmeas pesando 250-280 g) com idades entre 12-16 semanas foram acomodados no Laboratório de Animais GLP da Universidade de Lanzhou por 3 dias antes do experimento real. As gaiolas utilizadas foram do tipo R5, medindo 545 mm x 395 mm x 200 mm, e equipadas com material de cama autoclavado. Todos os ratos tiveram acesso irrestrito a água e ração. O laboratório manteve umidade média de 25%, temperatura média de 24 °C e ciclo de luz alternado entre dia e noite (7h00/19h00). Na conclusão do estudo, todos os animais foram sacrificados humanamente usando uma overdose de isoflurano. Para obter informações abrangentes sobre os materiais e instrumentos empregados neste estudo, consulte a Tabela de Materiais.

1. Cálculo do tamanho da amostra e seleção dos animais

1. Escolha o método da equação do recurso¹⁵ para estimar o tamanho da amostra animal usando a equação (1).
   E = Número total de animais − Número total de grupos (1)
   Onde E é o grau de liberdade de análise de variância (ANOVA) e varia de 10 a 20.
   OBS: Neste estudo, 12 animais foram divididos em dois grupos A e B (três machos e três fêmeas por grupo).
2. Definir o desfecho primário deste estudo como a taxa de sucesso e o consumo de tempo de repetidas coletas de sangue por um único indivíduo.
3. Definir as medidas de desfecho secundário como alterações no peso corporal do rato, ingestão de alimento e água, bem como a incidência de eventos adversos (como fraturas da clavícula, hematomas subcutâneos, pneumotórax e mortalidade).
4. Definir coleta de sangue bem-sucedida como atendendo aos seguintes critérios: i) menos de três punções para uma única coleta de sangue; ii) um tempo total (desde a contenção do rato até a conclusão da coleta de sangue) não superior a 5 min; e iii) atingir o volume sanguíneo desejado durante a obtenção de plasma claro. Considere qualquer desvio desses critérios uma falha de amostragem.

2. Contenção de animais e coleta de sangue

NOTA: Amostras de sangue de ratos do grupo A e B foram coletadas por dois pesquisadores experientes, ambos com pelo menos 100 amostras de sangue. Amostras de sangue foram coletadas de ambos os grupos de ratos por um total de 96 vezes ao longo de 4 dias. Este método de coleta de sangue não requer anestesia ou dispositivos de retenção adicionais para os ratos. No entanto, necessita de técnicas de manuseio hábeis.

1. Às 8:00 da manhã do dia anterior à coleta de sangue (dia 1), atribua cada rato à sua gaiola individual enquanto sua comida e água são pesadas. Em seguida, peça a outro pesquisador, cego para as medidas, que registre o peso, o consumo de alimentos e a ingestão de água dos ratos todos os dias às 8:00 da manhã a partir do dia 1.
2. Para seguir esse protocolo, primeiramente a coleta de sangue às 10:00 horas e depois às 22:00 horas todos os dias, coletando-se 0,15 mL de sangue alternadamente das veias subclávias de ambos os lados.
   NOTA: A quantidade de sangue a ser coletada foi determinada pelo volume máximo que o rato de menor peso poderia tolerar dentro de uma semana.
3. Lave uma seringa com heparina sódica (25 U/mL) e desinfete o local da injeção com álcool.
4. Acaricie suavemente a pele das costas do rato e aperte seu pescoço repetidamente para ajudar o rato a relaxar (Vídeo 1).
5. Com o polegar e o indicador da mão não dominante, segure e levante firmemente a pele do pescoço do rato (Figura 1A e Vídeo 1).
6. Com coordenação da mão dominante, utilizar os três dedos restantes e a palma da mão não dominante para fixar a pele posterior do rato e imobilizar seus membros anteriores (Figura 1B,C e Vídeo 2).
   NOTA: Se o rato resistir ou lutar, este procedimento pode ser repetido várias vezes para ajudar o rato a se acostumar com o manuseio. Os passos a seguir são fundamentais para o sucesso da coleta de sangue.
7. Usando o dedo indicador da mão não dominante, empurre suavemente para baixo a pele da cabeça do rato, enquanto os outros dedos, juntamente com a palma da mão, ajudam a girar externamente a articulação do ombro. Durante esse processo, utilizar a mão dominante para estender totalmente a articulação do ombro do rato (Figura 1D-F e Vídeo 2).
8. Segure o rato firmemente com a mão não dominante para alinhar a cabeça e o corpo do rato em linha reta (Figura 1G,H). Em seguida, utilizar a mão dominante para localizar a posição da clavícula e confirmar o local da punção (Figura 1I, Vídeo 2 e Vídeo 3).
   NOTA: Não é necessário raspar o rato. Na Figura 1, a tricotomia foi realizada apenas para maior extensão da clavícula e da punção. Ao conter ratos, especialmente ratos >350 g, permitir que o rato apoie seus pés em uma superfície sólida ajudará a suportar seu peso corporal. Além disso, o retentor deve monitorar a frequência respiratória de cada rato durante a coleta de sangue para garantir que a contenção não seja muito apertada, o que pode causar desconforto respiratório.
9. Segurando a seringa paralela ao corpo do rato na mão dominante, com a ponta da agulha voltada para cima e a escala da seringa em direção ao experimentador, mantenha um ângulo de aproximadamente 15° com a linha média do corpo do rato. Inserir a agulha 0,5 cm abaixo da incisura da clavícula (na junção do terço proximal da clavícula com o esterno), garantindo que a agulha permaneça paralela ao corpo do rato (Figura 1J e Vídeo 3).
   NOTA: Atenção especial deve ser dada ao ângulo e profundidade da inserção da agulha para evitar perfurar o vaso sanguíneo ou causar danos inadvertidos aos vasos adjacentes.
10. Retire suavemente a seringa ligeiramente para criar uma pressão negativa, muitas vezes acompanhada por uma sensação palpável de ruptura ao entrar no vaso sanguíneo (particularmente pronunciada durante a colheita de sangue inicial). Manter essa posição e coletar 0,1-1,0 mL de sangue em velocidade constante, conforme necessário (seguindo as diretrizes da IACUC de aproximadamente 4-5,3 mL/kg de sangue por semana¹) (Figura 1K e Vídeo 3).
11. Se não houver sangue no momento da punção, tente ajustar suavemente o ângulo e a profundidade da agulha ou gire suavemente a seringa (Vídeo 3). Se três tentativas consecutivas do mesmo lado não forem bem-sucedidas, pare todo o sangramento e, em seguida, mude para o lado oposto para a punção.
    NOTA: A punção rápida através da pele é aconselhável para evitar que o rato lute devido ao desconforto.
12. Aplicar um cotonete para hemostasia e retornar o rato à sua gaiola (Vídeo 4).
13. Processar as amostras de sangue de acordo com as exigências experimentais.

3. Processamento de amostras de sangue

1. Descarte a agulha da seringa em um recipiente para materiais perfurocortantes. Transferir o sangue coletado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente lavado com heparina. Coloque o tubo em uma centrífuga, fixando-o a 4 °C e 1.200 x g, e centrifugue por 10 min para separar o plasma. Transfira o soro utilizando uma pipeta de Pasteur de 1,0 ml para um tubo de microcentrífuga limpo e armazene-o a -80 °C.
   NOTA: Para evitar hemólise devido à pressão, remova a ponta da agulha quando necessário. Durante a aspiração de plasma, evite retirar células sanguíneas do fundo do tubo. Ocasionalmente, a superfície da seringa pode coletar pelos de ratos; Tome cuidado para não permitir que nenhum pelo entre no tubo, pois pode levar à coagulação.

4. Análise estatística

1. Apresentar todos os dados como média ± desvio padrão e testá-los quanto à homogeneidade da variância.
2. Use o teste exato de Fisher para comparar as taxas de sucesso entre os grupos.
3. Use um teste t independente para duas amostras para comparar as médias gerais entre os dois grupos.
4. Use a análise de variância (ANOVA) para medidas contínuas, como tempo de coleta de sangue, peso corporal, ingestão alimentar e consumo de água. Considere P < 0,05 estatisticamente significante.

Resultados

Espécimes de plasma de alta qualidade exibem uma tonalidade amarelo-pálida, clareza e transparência, desprovidos de qualquer coloração vermelha ou coagulação, como mostrado na Figura 2A. A Figura 2B mostra hemólise (lado esquerdo) ou coagulação (lado direito) como resultado de procedimentos inadequados, respectivamente. Ao longo de 96 sessões de coleta de sangue em 4 dias, os tempos médios de coleta única para os grupos A e B fo...

Discussão

Embora a coleta de sangue da veia caudal seja o método mais comum para repetidas coletas de sangue em ratos, ela pode ser influenciada por drogas anestésicas e, devido ao pequeno tamanho da veia caudal, a quantidade de sangue que pode ser coletada em um único momento é limitada, levando a um maior tempo de coleta de sangue ^4,5. Embora sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) - espectrometria de massas em tandem (MS/MS) combinados com microamost...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,75% de solução salina normal	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	— —	Solução preparada de heparina sódica
1 mL de pipeta Pasteur	Biosharp	BS-XG-01-NS
Seringa de coleta de sangue de 1 mL (26 G, 0,45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Coleta de sangue
Tubo Eppendorf de 1,5 mL	Biosharp	BS-15-M	Armazenamento e coleta de sangue
75% de álcool medicinal	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	— —	Desinfecção do local de coleta de sangue de rato
Suporte para tubo de centrífuga	Biosharp	BS-05/15-SM60	— —
Balança eletrônica	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Pesar
injeção de heparina sódica	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	— —	Enxágue a seringa e o tubo EP; dilua com solução salina normal a 25 U / mL
Centrífuga de baixa temperatura	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separação de soro