Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Summary

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Abstract

A visualização de proteínas em células vivas usando GFP (Green Fluorescent Protein) e outras etiquetas fluorescentes melhorou muito a compreensão da localização, dinâmica e função de proteínas. Em comparação com a imunofluorescência, a imagem viva reflete com mais precisão a localização de proteínas sem potenciais artefatos decorrentes da fixação tecidual. É importante ressaltar que imagens ao vivo permitem a caracterização quantitativa e temporal dos níveis e localização de proteínas, cruciais para a compreensão de processos biológicos dinâmicos, como movimento ou divisão celular. No entanto, uma das principais limitações das abordagens de marcação fluorescente é a necessidade de níveis de expressão proteica suficientemente altos para alcançar uma visualização bem-sucedida. Consequentemente, muitas proteínas fluorescentes marcadas endogenamente com níveis de expressão relativamente baixos não podem ser detectadas. Por outro lado, a expressão ectópica usando promotores virais pode, por vezes, levar à má localização de proteínas ou alterações funcionais em contextos fisiológicos. Para abordar essas limitações, é apresentada uma abordagem que utiliza a detecção de proteínas mediadas por anticorpos altamente sensíveis em embriões vivos, essencialmente realizando imunofluorescência sem a necessidade de fixação tecidual. Como prova de princípio, o receptor Notch marcado com GFP endogenamente que é pouco detectável em embriões vivos pode ser visualizado com sucesso após a injeção de anticorpos. Além disso, essa abordagem foi adaptada para visualizar modificações pós-traducionais (MPTs) em embriões vivos, permitindo a detecção de mudanças temporais nos padrões de fosforilação da tirosina durante o início da embriogênese e revelando uma nova subpopulação de fosfotirosina (p-Tyr) sob membranas apicais. Essa abordagem pode ser modificada para acomodar outros anticorpos específicos para proteínas, específicos para tags ou específicos para PTM e deve ser compatível com outros organismos modelo ou linhagens celulares passíveis de injeção. Este protocolo abre novas possibilidades para imagens ao vivo de proteínas de baixa abundância ou PTMs que anteriormente eram difíceis de detectar usando métodos tradicionais de marcação fluorescente.

Introduction

A imunofluorescência é uma técnica fundamental da biologia celular moderna originalmente desenvolvida por Albert Coons, que permite a detecção de moléculas em seus compartimentos celulares nativos e a caracterização das composições moleculares de organelas ou máquinas^{subcelulares1}. Aliada às manipulações genéticas, a imunofluorescência ajuda a estabelecer o conceito hoje bem aceito de que a localização de proteínas é essencial para sua função². Além de anticorpos primários específicos e corantes fluorescentes brilhantes, o sucesso dessa técnica depende de um processo preliminar denominado fixação e permeabilização, que preserva morfologias celulares, imobiliza antígenos e aumenta a acessibilidade dos anticorpos nos compartimentos intracelulares. Inevitavelmente, o processo de fixação e permeabilização mataria as células e encerraria todos os processos biológicos³. Portanto, a imunofluorescência fornece apenas instantâneos da jornada de vida das proteínas. Entretanto, muitos processos biológicos, como migração e divisão celular, são de natureza dinâmica, exigindo investigação do comportamento proteico de forma espacial-temporalmente resolvida ^4,5.

Para examinar a dinâmica de proteínas em organismos vivos, métodos de imagem vivos baseados em proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, como a proteína fluorescente verde (GFP)⁶ e microscópios confocais de alta velocidade, foram desenvolvidos. Resumidamente, a proteína de interesse pode ser geneticamente manipulada para ser fundida com GFP⁷ e, em seguida, expressa ectopicamente a partir de promotores virais ou de leveduras, como citomegalovírus (CMV)⁸ ou sequência de ativação a montante (UAS)⁹. Como a GFP é de natureza autofluorescente, não são necessários anticorpos acoplados a fluoróforos para revelar a localização das proteínas-alvo, o que ignora a necessidade de processos preliminares de fixação ou permeabilização. Nas últimas duas décadas, etiquetas fluorescentes abrangendo todo o espectro de comprimento de onda foram desenvolvidas¹⁰, permitindo imagens ao vivo multicoloridas de várias proteínas-alvo ao mesmo tempo. No entanto, em comparação com corantes fluorescentes quimicamente modificados, como AlexaFluor ou ATTO, a autofluorescência dessas proteínas fluorescentes codificadas geneticamente é relativamente fraca e instável quando expressa a partir de promotores endógenos, especialmente durante imagens ao vivo em escalas de tempo mais longas¹⁰. Embora essa deficiência possa ser atenuada pela superexpressão de proteínas-alvo marcadas fluorescentemente, muitas com atividades enzimáticas, como quinases e fosfatases, interrompem severamente os processos biológicos normais se não forem expressas em níveis fisiológicos.

Este protocolo apresenta um método que permite a iluminação do alvo fotoestável baseada em anticorpos em uma configuração de imagem ao vivo, permitindo essencialmente a imunofluorescência sem o processo de fixação ou permeabilização (Figura 1). Através de uma reação de amina primária simples baseada no NHS¹¹, pode-se conjugar corantes fluorescentes como AlexaFluor 488 ou 594 com essencialmente qualquer anticorpo primário ou nanocorpo GFP/HA/Myc¹². Aproveitando uma característica de desenvolvimento de que todas as células embrionárias de Drosophila compartilham um citoplasma comum durante o estágio de sincício¹³, pode-se obter ligação e iluminação antigênica em embriões inteiros após a injeção de anticorpos conjugados com corante. Com a expansão de bibliotecas de proteínas marcadas endogenamente disponíveis em Drosophila e outros sistemas modelo¹⁴, este método pode potencialmente ampliar as aplicações dessas bibliotecas revelando a dinâmica de proteínas marcadas fluorescentemente de baixa abundância e outras proteínas marcadas não fluorescentemente (HA/Myc-tagged) em tecidos vivos.

Protocol

Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação da Faculdade de Ciências da Vida da Universidade SUSTech. O organismo utilizado é Drosophila melanogaster, e os genótipos são Notch-Knockin-GFP (Cromossomo X) e Sqh-sqh-GFP (Cromossomo II), generosamente fornecidos pelos laboratórios do Dr. François Schweisguth (Instituto Pasteur) e da Dra. Jennifer Zallen (Instituto Sloan Kettering), respectivamente. Embora este protocolo se concentre principalmente em aspectos de marcação de anticorpos e imagens vivas, consulte os relatórios publicados para descrições mais detalhadas da coleta e injeção de embriões de Drosophila ^15,16.

1. Marcação fluorescente de anticorpos

1. Preferencialmente, utilizar anticorpos monoclonais ou nanocorpos para a proteína de interesse. Preparar a concentração de estoque de anticorpos em 1 mg/mL ou superior.
   NOTA: Neste estudo, o nanocorpo GFP (ver Tabela de Materiais) é usado como exemplo. O nanocorpo de GFP comercialmente disponível é embalado a uma concentração de 1,0 mg/mL e um volume de 250 μL. Além disso, é utilizado um kit de marcação de anticorpos comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais), que conjuga Alexa Fluor 594 a aminas primárias de proteínas por meio de uma reação de éster succinimidílico¹¹. É importante ressaltar que esse processo de marcação não altera significativamente a concentração de anticorpos.
2. Preparar uma solução de bicarbonato de sódio 1 M ressuspendendo o componente B (fornecido no kit de marcação de anticorpos) em 1 mL de água deionizada.
3. Ajustar a concentração de anticorpos para 1,0 mg/mL e, em seguida, adicionar 1/10^{do volume} (10 μL para 100 μL de nanocorpo GFP) da solução de bicarbonato de sódio 1 M.
4. Adicionar 110 μL da mistura de anticorpos (a partir do passo 1.3) diretamente ao tubo contendo o corante Alexa Fluor 594. Inverter para misturar (não vórtice) e incubar em um rotador por 1 h à temperatura ambiente.
5. Montar a coluna de purificação a partir do kit de conjugação (ver Tabela de Materiais). Preparar um leito de resina de 1,5 ml (fornecido no kit de marcação de anticorpos) e centrifugar a coluna a 1100 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente (TR) para remover o excesso de líquido da resina.
6. Adicionar a mistura de reacção (a partir do passo 1.4) no topo da coluna de resina e centrifugar a 1100 x g durante 5 minutos a 4 °C para recolher o anticorpo marcado. O anticorpo coletado deve aparecer de cor rosa, e o volume deve ser ligeiramente inferior a 100 μL. Armazenar em tubos de papel alumínio ou de cor escura a 4 °C.

2. Preparação de embriões de Drosophila

1. Coloque 200 Drosophila adultas recém-eclodidas em uma gaiola em forma de cilindro plástico (diâmetro = 5 cm, altura = 8 cm) com uma proporção macho/fêmea de 1: 10. Sele um lado com malha metálica porosa para ventilação e o outro lado com uma placa de ágar suco de frutas/pasta de levedura.
2. Troque a placa a cada 12 h por três dias antes da coleta do embrião. Isso permite a sincronização da postura de ovos de Drosophila e melhora a eficiência da coleta.
3. No dia da injeção, troque a gaiola para um prato de suco de frutas com pasta de levedura mínima e colete embriões a 25 °C por 1 h. Se a primeira rodada de coleta não produzir embriões suficientes (<50 embriões), descarte a primeira placa e repita essa etapa para uma segunda rodada de coleta até que mais de 100 embriões sejam colocados dentro de 1 h.
4. Retire a placa da gaiola para parar a postura de ovos e incube a 25 °C por mais 2 h para obter embriões com 2-3 h de idade. O estágio correto dos embriões é fundamental para o sucesso da injeção de anticorpos.
5. Para remover a casca dos embriões, adicione 2 mL de água sanitária a 50% à placa de suco de frutas e desaloje suavemente os embriões da placa usando um pincel (Figura 2A-4). Muitas vezes, os embriões serão colocados diretamente sobre a pasta de levedura. Neste caso, é aceitável escovar a pasta de levedura na solução de água sanitária para coletar todos os embriões.
6. Incubar os embriões flutuantes em água sanitária a 50% por 2 min e agitar a placa de suco de frutas a cada 30 s para melhorar a eficiência da remoção da casca do ovo.
7. Transfira a mistura embrião/água sanitária despejando-a em um filtro de células de nylon de 70 μm (Figura 2A-7). Lave bem os embriões usando uma garrafa de água para remover qualquer água sanitária residual e pasta de levedura. Seque completamente o filtro celular com papel toalha, garantindo que qualquer excesso de água ao redor dos embriões seja removido.

3. Alinhamento e dessecação do embrião

1. Prepare um gel de agarose 4% de 5 cm x 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (largura, comprimento, altura) (Figura 2A-9) e deixe o gel arrefecer até à temperatura ambiente. Corte um bloco de agarose de 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (largura, comprimento, altura) usando uma lâmina de barbear limpa e coloque o bloco em uma lâmina de vidro (Figura 2A-2). Examine o bloco de gel sob o escopo de dissecação para garantir que as bordas sejam cortadas retas e a superfície seja plana e seca.
2. Transfira embriões do filtro para o bloco de gel usando um pincel. Espalhe os embriões uniformemente ao longo da linha média do bloco, escovando suavemente. O ideal é que os aglomerados de embriões sejam separados em solteiros ou duplos sem se tocar.
3. Prepare uma pinça com duas pernas bem unidas para criar uma única ponta fina (Figura 2A-5). Sob um escopo de dissecação, pegue embriões individuais usando a pinça e coloque-os ao longo da borda longa do bloco de gel. Alinhar 20-30 embriões, garantindo que seu eixo anteroposterior seja paralelo à borda (Figura 2C).
4. Pipetar cola de heptano de 10 μL (ver Tabela de Materiais) no centro de uma lamínula de 24 mm x 50 mm (Figura 2A-1) e espalhar a cola em uma área retangular de 0,5 cm x 3 cm usando uma ponta de pipeta. Espere a cola secar completamente antes de usar.
5. Coloque a lâmina de vidro com o bloco de gel na borda da mesa, com os embriões voltados para fora. Levante a lamínula com cola usando uma pinça de ponta plana (Figura 2A-6) e segure-a ainda em cima dos embriões, com o lado da cola voltado para os embriões em um ângulo inclinado de cerca de 45 graus.
   NOTA: Pressione suavemente a lamínula contra o bloco de gel para que os embriões fiquem em contato com a cola e, em seguida, solte rapidamente a pressão e levante a lamínula. A quantidade de tensão aplicada é fundamental para que os embriões possam ser fixados de forma estável à cola sem serem pressionados com muita força e estourarem.
6. Pipetar 10 μL de água no centro de uma nova lâmina de vidro e colocar a lamínula com os embriões por cima, com o lado do embrião voltado para cima (Figura 2B). Certifique-se de usar água em vez de esmalte de unha ou outra cola adesiva para prender a tampa à lâmina de vidro, pois este lado da tampa será colocado diretamente sobre a lente confocal para imagens ao vivo.
7. Secar os embriões em câmara de dessecação (Figura 2A-3) (ver Tabela de Materiais) por 10-15 min até que a membrana vitelínica enruge (Figura 2E). O tempo necessário pode variar de acordo com a umidade da sala e deve ser testado experimentalmente para cada condição de laboratório.
8. Pipetar 40 μL de óleo de halocarbono (uma mistura do tipo 27 e do tipo 700 numa proporção de 1: 1 em volume, ver Tabela de Materiais) numa extremidade da tira de embriões. Incline a lâmina até que o óleo de halocarbono cubra toda a superfície dos embriões.

4. Injeção de anticorpos e exames de imagem

1. Prepare algumas agulhas de vidro de injeção usando um extrator de micropipeta (consulte a Tabela de materiais para configurações de parâmetros) e carregue cada agulha com 5 μL de solução de anticorpos marcada com AlexaFluor (a partir da etapa 1.6).
2. Coloque uma tampa de 25 mm x 25 mm em cima de uma lâmina de vidro. Pipetar 40 μL de óleo de halocarbono e espalhá-lo ao longo da borda da lamínula.
3. Sob o escopo de injeção, alinhe a ponta da agulha contra a borda da tampa sob óleo. Ajuste a pressão do ar de injeção da picobomba (consulte a Tabela de Materiais) para que uma bomba gere uma bolha cheia de anticorpos. O diâmetro da bolha deve ser limitado a 20-50 μm (Figura 2F).
4. Substitua a lâmina de vidro vazia por uma que contenha embriões sob óleo. Alinhar a ponta da agulha de injeção perpendicularmente ao eixo anteroposterior dos embriões (Figura 2D,G).
5. Verificar o estágio dos embriões para certificar-se de que a maioria iniciou a celularização, mas ainda não iniciou a gastrulação (estágio 4 e estágio 5), permanecendo como sincício (Figura 2F,G).
   NOTA: A característica desta fase é a ausência de quaisquer sulcos ou dobras e a presença de um saco vitelino de forma oval de cor escura visível no centro do embrião. A caracterização morfológica do estágio embrionário sob óleo é baseada no capítulo de livro "Estágios da embriogênese de Drosophila" de Volker^{Hartenstein17}.
6. Use o manipulador de estágio X-Y para mover os embriões em direção à agulha até que a ponta chegue ao centro da gema. Bombeie de duas a três vezes para injetar anticorpos na gema. O sucesso da injeção é indicado pelo rápido desaparecimento da ruga da membrana vitelínica, à medida que os embriões ganham volume da solução de anticorpos (Figura 2G).
7. Use o manipulador de estágio X-Y para afastar os embriões da agulha após a injeção e mover-se para baixo para o próximo embrião. Repita o passo 6 até que todos os embriões na lâmina sejam injetados.
8. Transferir a lâmina de vidro com embriões injetados para uma câmara de umidade (Figura 2A-8). Incubar a 25 °C até atingir a fase desejada de desenvolvimento embrionário.
9. Retire a tampa de 24 mm x 50 mm da lâmina de vidro e coloque-a diretamente no suporte da lâmina do microscópio. O lado sem embriões estará voltado para os objetivos. Localize os embriões usando uma lente de baixa ampliação sob iluminação de campo brilhante e mude para uma lente de 40x ou 63x para imagens ao vivo fluorescentes de alta resolução.

Results

Para demonstrar as vantagens do método de injeção de anticorpos sobre imagens ao vivo baseadas em etiquetas fluorescentes ou imunofluorescência, são fornecidos dois estudos de caso que caracterizam a localização dinâmica de um receptor transmembrana de baixa abundância, Notch, e um tipo de modificação pós-traducional chamada fosforilação de tirosina em embriões vivos.

A atividade de sinalização da fossa desempenha um papel importante na determinação do destino celular durante a embriogênese e a homeostase de órgãos adultos^18,19. Após a ativação por seus ligantes Delta/Jagged²⁰, o domínio intracelular do receptor transmembrana Notch é clivado e liberado no núcleo²¹, iniciando programas transcricionais a jusante para conduzir mudanças no destino celular²². A localização estática do receptor Notch tem sido bem caracterizada por imunofluorescência em tecidos fixados em formaldeído. No entanto, a localização dinâmica de Notch durante a ligação ao ligante ou o processo de clivagem intracelular permanece em grande parte desconhecida²³, devido à falta de um método para imagens vivas desta proteína de abundância relativamente baixa em alta velocidade. Aqui, injetamos nanocorpo de GFP conjugado com AlexaFluor em embriões expressando Notch marcado com GFP do locus endógeno²⁰. Sem injeção, o Notch-GFP é pouco detectável em condições padrão de imagem ao vivo, e o sinal fluorescente clareia rapidamente durante imagens de lapso de tempo. Após a injeção, a relação sinal-ruído do receptor Notch melhora significativamente, comparável à qualidade do sinal da imunofluorescência (Figura 3A). Além disso, a injeção de anticorpos permite a caracterização temporal da localização de Notch em intervalos de 45 s, sem perda aparente de intensidade de sinal em uma janela de imagem de 5 min (Figura 3B).

A fosforilação da tirosina é um dos principais tipos de modificação proteica pós-traducional que medeia a transdução de sinal em muitas vias biológicas²⁴. Anticorpos monoclonais altamente específicos (como PY20 e 4G10) contra fosfotirosina (p-Tyr) foram desenvolvidos para caracterizar a localização e os níveis de fosforilação global da tirosina usando imunofluorescência e western blots²⁵. Embora nenhuma etiqueta fluorescente possa rastrear mudanças de fosforilação, tecidos ou células precisam ser fixados e corados ou lisados e manchados em diferentes pontos de tempo para fornecer instantâneos do status de fosforilação ao longo do tempo, para estudar a cinética da fosforilação de tirosina após a ativação do sinal²⁶ (por exemplo, tratamento com fator de crescimento). O intervalo de tempo dessa abordagem é de pelo menos alguns minutos e inerentemente impreciso devido ao tempo variável necessário para procedimentos como fixação ou lise celular.

Aqui, são apresentadas evidências de que o método de injeção de anticorpos permite a visualização direta do estado de fosforilação em embriões vivos, rastreando as mudanças de localização e intensidade da fosforilação da tirosina em intervalos de tempo regulares em segundos. O anticorpo PY20 conjugado com AlexaFluor foi injetado em embriões expressando cadeia leve de miosina marcada com GFP e realizou imagens ao vivo de duas cores em intervalos de 45 s. Como demonstrado anteriormente, a fosforilação da tirosina é altamente enriquecida nas junções tricelulares²⁷, padrão que também é recapitulado por imunofluorescência (Figura 4A). Curiosamente, imagens ao vivo também revelaram uma nova segunda população de sinal p-Tyr abaixo do centro da membrana apical, que não é observada usando imunofluorescência (Figura 4B). Através de imagens de duas cores, verificou-se que essa população de sinal p-Tyr está próxima à miosina medial (Figura 4B, close-ups), uma subpopulação de miosina²⁸ que é similarmente pronunciada apenas em condições de imagem ao vivo, mas pouco detectável usando imunofluorescência. Além disso, a população medial de p-Tyr exibe padrões de coalescência e dissipação pulsáteis semelhantes (Figura 4C), como demonstrado anteriormente para miosina medial²⁸. A identidade e a função de uma subpopulação medial de p-Tyr ainda são desconhecidas. Juntos, esses resultados demonstram que o método de injeção de anticorpos pode complementar grandemente as abordagens tradicionais para caracterizar comportamentos de proteínas de baixa abundância e revelar novos padrões de localização que podem ter sido interrompidos durante o processo de imunofluorescência.

Figura 1: Fluxo de trabalho de injeção de anticorpos. Fluxo de trabalho esquemático ilustrando as etapas envolvidas no método de injeção de anticorpos. Todo o processo, desde a coleta do embrião até a injeção de anticorpos, normalmente leva cerca de 4-5 h para ser concluído. Após a injeção de anticorpos, os embriões podem ser incubados em uma câmara de umidade até o estágio desejado de desenvolvimento antes da imagem ao vivo. AEL, após a postura dos ovos; TR, temperatura ambiente; Ab, anticorpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Alinhamento e injeção do embrião. (A) Visão geral dos itens necessários antes da injeção, incluindo uma tampa, lâmina de vidro, caixa de dessecação, pincel, pinça, filtro de células, câmara de umidade e gel de agarose. (B) Embriões alinhados presos à cola de heptano no centro da lamínula e colocados em cima de esferas de dessecação. (C) Alinhamento do eixo anteroposterior dos embriões em paralelo com a borda do gel de agarose. (D) Visão geral da configuração da injeção. (E) Comparação da morfologia embrionária antes e após o processo de dessecação, com foco no enrugamento da membrana vitelínica após a dessecação. (F) Tamanho da bolha de injeção após uma única prensagem da picobomba. (G) Comparação da morfologia embrionária antes e após a injeção de anticorpos, destacando-se o desaparecimento das rugas da membrana pós-injeção. (E-G) foram capturados sob uma lente objetiva de aumento de 10x usando microscopia de campo claro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem ao vivo do receptor Notch em embriões iniciais. (A) Localização do receptor Notch marcado com GFP endogenamente através de imunofluorescência (esquerda), imagem direta ao vivo baseada em autofluorescência GFP (meio) e injeção de nanocorpo GFP conjugado AlexaFluor 594 (direita). (B) Localização dinâmica de Notch-GFP imageada em intervalos de 45 s após a injeção de anticorpos. Todas as imagens foram adquiridas com a face anterior dos embriões à esquerda e a face ventral voltada para baixo. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem ao vivo dos padrões de fosfotirosina embrionária. (A) Localização de tirosina fosforilada (p-Tyr) em embriões fixados por imunofluorescência. (B) Localização de p-Tyr (magenta) em embriões vivos expressando cadeia leve de miosina marcada com GFP (verde). A caixa tracejada branca indica vistas de perto da população medial de fosfotirosina e miosina sob a membrana apical. Barras de escala = 10 μm. (C) Localização de p-Tyr e GFP-miosina imageadas a cada 45 s em embriões vivos. As setas brancas indicam a população medial de p-Tyr e miosina. Todas as imagens foram capturadas com a face anterior dos embriões à esquerda e a face ventral voltada para baixo. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este procedimento apresentado descreve o método especializado de marcação por fluorescência com anticorpos personalizados e subsequente injeção em embriões de Drosophila em estágio inicial. Esta técnica facilita a visualização em tempo real de proteínas ou modificações pós-traducionais que existem em baixas quantidades e são tipicamente difíceis de observar através de métodos convencionais de marcação GFP/mCherry.

Deve-se ter cautela ao estender esse método para fazer comparações quantitativas entre embriões selvagens e mutantes. Enquanto a concentração de anticorpos primários e secundários pode ser mantida a mesma entre os grupos controle e experimental em imunofluorescência, a quantidade de anticorpos injetados e a eficiência de marcação podem variar entre os embriões. Portanto, a análise quantitativa deve ser limitada ao rastreamento de mudanças de intensidade fluorescente ao longo do tempo ou à realização de análise de correlação com sinais de outros canais no mesmo embrião ao realizar imagens ao vivo multicoloridas. Por exemplo, a análise de correlação e colocalização pode ser realizada usando as intensidades de p-Tyr e miosina²⁷, enquanto as intensidades de p-Tyr não podem ser comparadas diretamente entre embriões knockdown do tipo selvagem e do gene X usando o método de injeção de anticorpos.

Semelhante a outras abordagens baseadas em etiquetas fluorescentes para examinar a dinâmica de proteínas, a ligação de anticorpos poderia potencialmente alterar a atividade, o tráfego ou a localização de proteínas-alvo. Portanto, anticorpos monoclonais ou nanocorpos são preferidos em relação aos anticorpos policlonais injetáveis. Como os epítopos de anticorpos monoclonais ou nanocorpos são bem definidos, se o bloqueio desses epítopos com anticorpos altera a atividade proteica poderia ser modelado com base em estruturas alfa-dobras^12,25. Por outro lado, epítopos de anticorpos policlonais não são precisamente delineados, e sua ligação poderia potencialmente alterar a localização ou atividade de proteínas se bolsas catalíticas ou peptídeos sinalizadores de proteínas-alvo fossem bloqueados. Em segundo lugar, os anticorpos podem reconhecer epítopos não específicos além das proteínas-alvo, especialmente considerando que não há etapas de "washout" aqui, como na imunofluorescência, para remover ligações inespecíficas de baixa afinidade. Portanto, é importante ter grupos controle, como injetar anticorpos em células sem o epítopo, para verificar se o sinal observado realmente reflete as proteínas-alvo ou outros epítopos inespecíficos.

A injeção de anticorpos não é diferente da injeção de siRNA ou gRNAs CRISPR em termos de configuração experimental. Portanto, a maioria dos sistemas celulares passíveis de injeções deve ser compatível com o método de injeção de anticorpos. Em embriões de Drosophila , os anticorpos conjugados com flúor Alexa são estáveis durante o desenvolvimento, e os sinais fluorescentes permanecem detectáveis após horas de embriogênese. Para outros sistemas, como embriões de Xenopus ou Zebrafish, a concentração e o volume de injeção de anticorpos devem ser testados empiricamente através de diluições seriadas para alcançar a eficiência de marcação ideal. Além disso, corantes fluorescentes alternativos como o ATTO¹⁰ poderiam potencialmente oferecer uma melhor relação sinal-ruído e solubilidade em água.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Kit de Rotulagem de Anticorpos Alexa Fluor 594	Invitrogen	A20185	A coluna de purificação da etapa 1.6 está incluída neste kit
Microscópio Biológico	SOPTOP	EX20	Lente ocular: PL 10X/20. Lente objetiva: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Capilares de Vidro Borosilicato	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrífuga	Eppendorf	5245
Filtro de Células	FALCON	352350
Câmara de Dessecação	BLOQUEIO& Microscópio	HSM8200	320ml
	Mshot	MZ62	Lente da ocular: WF10X/22mm.
Fita Dupla Face	Scotch	665
Fina Super Pinça	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Óculos de Capa: Retângulos	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Lâminas de Microscópio	Fisherbrand	12-550-15
Pinça	VETUS	33A-SA
Óleo de halocarbono 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Óleo de halocarbono 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptano	Sigma-Aldrich	H2198-1L	A cola de heptano é feita de fita dupla face imersa em heptano
Reagente de desidratação	TOKAI	1-7315-01	Encha até 90% do volume da câmara de dessecação
Micromanipulador Manual	World Precision Instruments	M3301R
Extrator de micropipetas	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedimento: passo 1, Calor: 290, Força:300, Distância:1.00, Atraso:50. Passo 2, Calor: 290, Força:300, Distância:2.21, Atraso:50
Picopump pneumático	830	precisão do mundo	Ejeção: 20 libras por polegada quadrada;   Alcance: 100ms; Duração: cronometrado
PY20	Santa Cruz	SC-508
Placas de Petri quadradas	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanocorpo	Chromotek	gt