Artigo de método

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

DOI:

10.3791/66117

⸱

10 de novembro de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O fechamento do tubo neural (NTC) é um processo crítico durante o desenvolvimento embrionário. A falha nesse processo pode levar a defeitos do tubo neural, causando malformações congênitas ou mesmo mortalidade. As NTC envolvem uma série de mecanismos em níveis genéticos, moleculares e mecânicos. Embora a regulação mecânica tenha se tornado um tópico cada vez mais atraente nos últimos anos, ela permanece em grande parte inexplorada devido à falta de tecnologia adequada para a realização de testes mecânicos de tecido embrionário 3D in situ. Em resposta, desenvolvemos um protocolo para quantificar as propriedades mecânicas do tecido embrionário de galinhas de forma não invasiva e sem contato. Isto é conseguido através da integração de um microscópio Brillouin confocal com um sistema de incubação no palco. Para sondar a mecânica dos tecidos, um embrião pré-cultivado é coletado e transferido para uma incubadora no palco para cultura ex ovo . Simultaneamente, as imagens mecânicas do tecido da placa neural são adquiridas pelo microscópio Brillouin em diferentes momentos do desenvolvimento. Este protocolo inclui descrições detalhadas da preparação da amostra, a implementação de experimentos de microscopia de Brillouin e o pós-processamento e análise dos dados. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores podem estudar longitudinalmente a evolução mecânica do tecido embrionário durante o desenvolvimento.

Introdução

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Os defeitos do tubo neural (DTN) são graves defeitos congênitos do sistema nervoso central causados por falhas no fechamento do tubo neural (NTC) durante o desenvolvimento embrionário1. A etiologia dos DTNs é complexa. Estudos têm mostrado que as NTC envolvem uma sequência de processos morfogenéticos, incluindo extensão convergente, flexão da placa neural (por exemplo, constrição apical), elevação da prega neural e, finalmente, adesão da prega neural. Esses processos são regulados por múltiplos mecanismos moleculares e genéticos 2,3, e qualquer mau funcionamento desses processos pode resultar em DTNs 4,5,6. Como evidências crescentes sugerem que pistas mecânicas também desempenham papéis cruciais durante as NTC3,7,8,9,10,11, e relações têm sido encontradas entre genes e pistas mecânicas 12,13,14, torna-se imperativo investigar a biomecânica tecidual durante a neurulação.

Várias técnicas têm sido desenvolvidas para medir as propriedades mecânicas de tecidos embrionários, incluindo ablação a laser (LA)15, dissecção e relaxamento tecidual (TDR)16,17, aspiração por micropipeta (MA)18, nanoindentação baseada em Microscopia de Força Atômica (AFM)19, microindenters (MI) e microplacas (MP)20, microrreologia (RM) com pinça óptica/magnética21,22,23e sensores baseados em gotículas24. Os métodos existentes podem medir propriedades mecânicas em resoluções espaciais que variam de escalas subcelulares a teciduais. No entanto, a maioria desses métodos é invasiva porque requer contato com a amostra (por exemplo, MA, AFM, MI e MP), injeção de material externo (por exemplo, MR e sensores baseados em gotículas) ou dissecção tecidual (por exemplo, LA e TDR). Como resultado, é um desafio para os métodos existentes monitorar a evolução mecânica do tecido da placa neural in situ25. Recentemente, a elastografia reverberante de coerência óptica tem se mostrado promissora para o mapeamento mecânico sem contato com alta resoluçãoespacial26.

A microscopia confocal de Brillouin é uma modalidade óptica emergente que permite a quantificação sem contato da biomecânica tecidual com resolução subcelular27,28,29,30. A microscopia de Brillouin baseia-se no princípio do espalhamento espontâneo da luz de Brillouin, que é a interação entre a luz laser incidente e a onda acústica induzida por flutuações térmicas no interior do material. Consequentemente, a luz espalhada experimenta um deslocamento de frequência, conhecido como deslocamento ωR de Brillouin, seguindo a equação31:

figure-introduction-1 (1)

Aqui, figure-introduction-2 é o índice de refração do material, λ é o comprimento de onda da luz incidente, M' é o módulo longitudinal, ρ é a densidade de massa e θ é o ângulo entre a luz incidente e a luz espalhada. Para um mesmo tipo de material biológico, a relação entre índice de refração e densidade figure-introduction-3 é aproximadamente constante 28,32,33,34,35,36. Assim, o desvio de Brillouin pode ser usado diretamente para estimar mudanças mecânicas relativas em processos fisiológicos. A viabilidade da microscopia de Brillouin foi validada em várias amostras biológicas 29,37,38. Recentemente, imagens mecânicas por lapso de tempo de um embrião de pintinho vivo foram demonstradas pela combinação de um microscópio Brillouin com um sistema de incubação no estágio39. Este protocolo fornece descrições detalhadas da preparação da amostra, implementação do experimento e pós-processamento e análise dos dados. Esperamos que este esforço facilite a adoção generalizada da tecnologia Brillouin sem contato para estudar a regulação biomecânica no desenvolvimento embrionário e defeitos congênitos.

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Protocolo

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O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Wayne State University.

1. Preparação experimental

  1. Use uma solução de etanol a 70% para limpar e esterilizar a tesoura e pinça. Além disso, prepare pipetas descartáveis e uma seringa.
  2. Preparar um meio de lavagem adicionando 3,595 g de NaCl a 495 mL de água deionizada. Em seguida, adicionar 5 ml de Penicilina-Estreptomicina (5 U/mL) ao meio. Encha uma placa de Petri de 100 mm com o meio de lavagem e aqueça-a a 37 °C.
  3. Prepare pratos de cultura de acordo com a Figura 1, que ilustra a configuração geral.
    1. Prepare um pedaço de papel de filtro, corte-o em uma forma retangular de aproximadamente 17 mm × 20 mm e remova os quatro cantos. Crie um centro oco no papel de filtro, com aproximadamente 7 mm × 10 mm de tamanho para fixar o embrião (Figura 1, à esquerda).
      NOTA: A coleta de embriões está descrita na etapa 2.
    2. Conecte um anel comercial disponível (Φ = 1 polegada, consulte Tabela de Materiais) com uma camada de filme flexível (ou seja, filme de parafina), garantindo que o filme flexível também tenha um centro oco. Este anel com o filme será usado para segurar o papel de filtro com o embrião.
    3. Finalmente, coloque o anel preparado em uma placa de Petri de 35 mm (Figura 1, à direita).
      NOTA: O papel filtro é para fixar e segurar o embrião extraído, colocando o papel de filtro na membrana e deixando o embrião na área oca central (que será detalhada na etapa 2). Os quatro cantos foram cortados para se adequar ao tamanho do anel externo (não é necessário se já estiver montado). Uma placa de cultura com fundo de vidro de 35 mm é usada para melhor propagação do feixe de laser. O prato tem um poço interno (Φ = 23 mm), que pode ser preenchido com albumina para cultura ex ovo . O diâmetro do anel deve ser maior que o diâmetro do poço interno para que o poço possa ser coberto pela película flexível no anel (Figura 1, inset). O tamanho do papel filtro não é restrito e pode ser modificado de acordo com o tamanho do anel escolhido e da placa de cultura. Alternativamente, o fundo do prato pode ser pré-revestido com uma camada de agarose (espessura: ~1 mm). Ao remover a agarose do centro da camada usando uma lâmina, um poço com uma forma semelhante ao centro oco do filme flexível pode ser criado para carregar albumina. Um ponto crítico é que os quatro lados do papel de filtro oco precisam ter largura suficiente (> 5 mm) para garantir a fixação do embrião.

2. Extração e cultura ex ovo do embrião de galinha

NOTA: Esta etapa é modificada a partir de relatórios publicados anteriormente40,41.

  1. Após a pré-cultura, retire o ovo da incubadora e coloque-o em seu longo eixo na bandeja da caixa de ovos. Limpe a casca do ovo com etanol 70%, garantindo cobrir toda a superfície, e depois deixe descansar por 15 min.
  2. Segure o ovo em seu eixo curto e quebre-o no fundo. Abra o ovo sobre uma placa de Petri limpa de 100 mm para extrair seu conteúdo, conforme ilustrado na Figura 2. Certifique-se de não girar o ovo enquanto o segura e racha.
  3. Usando uma pipeta, transferir e coletar aproximadamente 10 mL da albumina fina (isto é, a albumina líquida42) em um tubo de 15 mL para uso em cultura ex ovo . Preencher o poço central da placa de cultura com a albumina fina coletada (cerca de 0,9 mL), como mostra a Figura 3. O processo de enchimento deve ser lento, evitando a formação de bolhas no interior do poço. Certifique-se de que o prato de cultura com albumina seja aquecido a 37 °C.
    OBS: Este prato será utilizado para a cultura do embrião ex ovo. Novos pratos de cultura preenchidos com meio de lavagem serão usados durante a aquisição de imagens de Brillouin (ver etapa 3).
  4. Com papel higiênico, remova suavemente a albumina espessa (isto é, albumina viscosa) presa ao embrião, separando cuidadosamente a albumina da membrana vitelina, conforme demonstrado na Figura 4. Evitar o contato direto com a membrana vitelina.
  5. Depois de remover toda a albumina espessa, afixe cuidadosamente o papel de filtro na membrana vitelina. Verifique se o eixo do corpo do embrião está alinhado com o eixo longo do retângulo central no papel de filtro. Use uma tesoura para cortar a membrana ao redor do papel de filtro.
  6. Usando uma pinça, puxe suavemente o papel de filtro isolado para longe da gema em uma direção oblíqua. Vire o papel de filtro de cabeça para baixo para posicionar o embrião com o dorsal para baixo (para configuração de microscópio invertido). Mergulhe cuidadosamente todo o papel de filtro de um lado do eixo longo na placa de Petri de 100 mm com o meio de lavagem de forma oblíqua.
  7. Lave qualquer gema restante pulverizando suavemente o meio de lavagem paralelo ao papel de filtro usando uma pipeta limpa. Evite pulverizar diretamente o meio de lavagem sobre a membrana.
  8. Depois de limpar toda a gema, retire cuidadosamente o papel de filtro do meio de lavagem e use papel higiênico para absorver qualquer excesso de meio das bordas. Em seguida, coloque o papel filtro com o embrião sobre a placa de cultura, certificando-se de que o lado dorsal do embrião esteja voltado para baixo, conforme ilustrado na Figura 5. Para manter a umidade, coloque um papel higiênico umedecido no prato.
  9. Transfira o prato de cultura para a incubadora no palco para a cultura ex ovo .

3. Medição Brillouin do embrião

  1. Prepare outro conjunto de pratos de cultura e recheie-os com meio de lavagem. Certifique-se de que o meio de lavagem está aquecido a 37 °C.
  2. Quando o embrião atingir o estágio de desenvolvimento desejado, transfira o papel filtro com o embrião para a placa de cultura preenchida com meio de lavagem. Coloque a placa de cultura na incubadora no palco do microscópio Brillouin (ver Tabela de Materiais).
    1. Antes de realizar a medição de Brillouin, salve uma imagem de campo brilhante de todo o embrião para referência. A configuração detalhada do microscópio Brillouin foi descrita anteriormente30 e está resumida na seção Resultados (Figura 6).
  3. Medir o sinal Brillouin de água e metanol, que será utilizado na etapa 4 para o processo de calibração.
  4. Ajuste a potência do laser incidente e o tempo de exposição da câmera do dispositivo acoplado à carga multiplicadora de elétrons (EMCCD, consulte Tabela de Materiais) para atingir pelo menos 10.000 contagens de sinal Brillouin. Usando a imagem de campo brilhante como guia, configure o intervalo de varredura e o tamanho da etapa. Adquira uma imagem Brillouin da região de interesse escaneando o embrião usando um estágio de translação 2D.
    NOTA: O intervalo de varredura horizontal pode ser determinado com base na imagem de campo brilhante, e o intervalo de varredura vertical (ou seja, profundidade) pode ser determinado com base na intensidade do sinal obtido de uma varredura rápida e grossa. Para evitar qualquer fotodano ao embrião, limite a potência incidente a 25 mW e defina o tempo de exposição da câmera EMCCD para 50 ms. Escolha um tamanho de passo de 2 μm na direção horizontal e 1 μm na direção vertical para equilibrar a qualidade da imagem e o tempo de aquisição.
  5. Depois de completar a digitalização, remova cuidadosamente o papel de filtro com o embrião e use papel de seda para absorver qualquer meio de lavagem em excesso. Em seguida, coloque o papel de filtro de volta no prato de cultura cheio de albumina fina para cultura contínua na incubadora no palco.
  6. Repita as etapas 3.2-3.5 em intervalos de tempo regulares (por exemplo, 1,5 h) para capturar imagens de lapso de tempo Brillouin à medida que o embrião se desenvolve.
  7. Reconstrua a imagem 2D Brillouin seguindo a etapa 4.

4. Reconstrução da imagem de Brillouin

  1. Calibrar o espectrômetro Brillouin usando sinais Brillouin de água e metanol para calcular a faixa espectral livre (FSR) e a razão de conversão pixel-freqüência (PR) do espectrômetro30. Os valores calibrados de FSR e RP serão utilizados para calcular o desvio de Brillouin do embrião a cada pixel.
    NOTA: A Figura 7A exibe um espectro Brillouin bruto capturado pela câmera EMCCD. Somando-se verticalmente o espectro e, em seguida, fazendo um ajuste lorentziano, pode-se obter a distância de pico Δd dos dois pontos (Figura 7B). Obtendo-se a distância de pico de água Δdágua e metanol Δdmetanol, o FSR e PR podem ser calculados com base nas equações30: RP = 2· (ωmetanol-ω água)/(Δdágua- Δdmetanol), e FSR = 2·ωágua + PR·Δdágua, com o conhecido desvio Brillouin de água ωágua = 6,01 GHz e metanol ωmetanol = 4,49 GHz a 660 nm.
  2. Obter a distância de pico do sinal de Brillouin em cada pixel da amostra. Calcular o desvio de Brillouin com base no FSR calibrado e PR:amostra ω = 0,5 (FSR - PR x amostraΔd)30, ondeamostra ω é o desvio de Brillouin da amostra, e amostraΔd é a distância de pico do sinal de Brillouin.
  3. Reconstrua a imagem 2D Brillouin com base nas mudanças Brillouin de todos os pixels.
    NOTA: Para realizar análise local, pode-se selecionar uma região de interesse (por exemplo, a placa neural) a partir da imagem adquirida de Brillouin e quantificar suas propriedades mecânicas. Uma abordagem comum é calcular o deslocamento médio de Brillouin da região selecionada.

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Resultados

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A Figura 6 mostra o esquema do microscópio Brillouin. O sistema emprega um laser de 660 nm como fonte de luz. Um isolador é colocado logo após a cabeça do laser para rejeitar qualquer luz retro-refletida, e um filtro de densidade neutra (ND) é usado para ajustar a potência do laser. Um par de lentes, L1 e L2, com distâncias focais de f1 = 16 mm e f2 = 100 mm, respectivamente, são usados para expandir o feixe de laser. Uma placa de meia-onda (HWP) e um polarizador linear (Polarizador 1) são e...

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Discussão

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O desenvolvimento inicial do embrião pode ser facilmente afetado por distúrbios externos. Portanto, é necessário o máximo de cautela durante a extração e transferência da amostra. Um problema potencial é o descolamento do embrião do papel de filtro, o que pode levar ao encolhimento da membrana vitelínica e resultar em um artefato inclinado da placa neural na imagem de Brillouin. Além disso, esse encolhimento pode interromper o desenvolvimento do embrião. Deve-se prestar atenção a várias etapas críticas para evitar o desc...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri de 100 mm Palco2D FB0875713
Prior ScientificH117E2
35 mmWorld Precision InstrumentsFD35-100
Microscópio Brillouin com incubadora no palcoN/AN/AEste é um sistema de microscópio Brillouin personalizado baseado na Ref. 30
Ovos de galinhaUniversidade de ConnecticutN/A
Câmera CMOSThorlabsCS2100M-USB
Câmera EMCCDAndoriXon
EtanolDecon Laboratories, Inc.#2701
Papel de filtroWhatman1004-070
Incubadora para cultura in ovoGQF Manufacturing Company Inc. GQF 1502 
AnelThorlabsSM1RR
Corpo do microscópioOlympusIX73
NaClSigma-AldrichS9888
Incubadora no palcoOko labsOKO-H301-PRIOR-H117
ParafilmBemisPM-996
Penicilina-EstreptomicinaGibco15070-063
PipetasFisherbrand13-711-6M
TesouraArtman instrumentsN/A3pc Micro Tesoura 5
SeringaBD305482
Papel de sedaKimwipesN/A
TuboCorning430052
PinçasDR InstrumentsN/AConjunto de Pinças de Microdissecção 
motorizado da FisherbrandPlaca de Petri

Referências

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