Quantificação das Propriedades Elásticas de Biofilmes Ambientais utilizando Elastografia de Coerência Óptica

Summary

Este trabalho destaca a eficácia da técnica de elastografia de coerência óptica (OCE) na caracterização rápida e não destrutiva das propriedades elásticas do biofilme. Nós elucidamos procedimentos críticos de implementação de OCE para medições precisas e apresentamos os valores do módulo de Young para dois biofilmes granulares.

Abstract

Biofilmes são biomateriais complexos que compreendem uma rede bem organizada de células microbianas envoltas em substâncias poliméricas extracelulares (EPS) autoproduzidas. Este trabalho apresenta um relato detalhado da implementação de medidas de elastografia de coerência óptica (ECO) adaptadas para a caracterização elástica de biofilmes. OCE é uma técnica óptica não destrutiva que permite o mapeamento local da microestrutura, morfologia e propriedades viscoelásticas de materiais moles parcialmente transparentes com alta resolução espacial e temporal. Nós fornecemos um guia abrangente detalhando os procedimentos essenciais para a implementação correta desta técnica, juntamente com uma metodologia para estimar o módulo de elasticidade de biofilmes granulares a partir das medidas coletadas. Estes consistem na configuração do sistema, aquisição de dados e pós-processamento. Na discussão, nos aprofundamos na física subjacente dos sensores usados na OCE e exploramos as limitações fundamentais em relação às escalas espaciais e temporais das medições da OCE. Concluímos com possíveis direções futuras para o avanço da técnica OCE para facilitar as medidas elásticas de biofilmes ambientais.

Introduction

No tratamento de águas residuais e na recuperação de recursos hídricos, biofilmes benéficos em reatores de crescimento acoplados são cada vez mais empregados para permitir que micróbios convertam poluentes indesejáveis, como matéria orgânica, nitrogênio e fosfato, em formas estabilizadas que podem ser facilmente removidas da água¹. Nesses sistemas, a função emergente do biofilme, ou seja, as transformações bioquímicas, está intimamente associada à diversidade de micróbios que nele residem e aos nutrientes que esses micróbios recebem². Assim, o crescimento contínuo do biofilme pode representar um desafio para manter a funcionalidade consistente do reator, pois o crescimento do novo biofilme pode alterar os processos metabólicos gerais do biofilme, as características de transferência de massa e a composição da comunidade. Estabilizar ao máximo o ambiente do biofilme pode proteger contra tais alterações³. Isso inclui garantir um fluxo consistente de nutrientes e manter a estrutura do biofilme estável com uma espessura constante⁴. O monitoramento da rigidez e da estrutura física do biofilme permitiria que os pesquisadores obtivessem informações sobre a saúde geral e o funcionamento do biofilme.

Os biofilmes apresentam propriedades viscoelásticas ^5,6,7. Essa natureza viscoelástica resulta em uma combinação de uma deformação instantânea e lenta, dependente do tempo, em resposta a forças mecânicas externas. Um aspecto único dos biofilmes é que, quando submetidos a deformações substanciais, respondem como líquidos viscosos. Por outro lado, quando submetidos a pequenas deformações, sua resposta é comparável aos sólidos⁵. Além disso, dentro dessa pequena região de deformação, existe uma faixa de deformação sob a qual os biofilmes exibem uma relação linear força-deslocamento ^5,6,7. Deformações dentro dessa faixa linear são ótimas para avaliar as características mecânicas do biofilme, pois produzem medidas reprodutíveis. Várias técnicas podem quantificar a resposta elástica dentro dessa faixa. A elastografia de coerência óptica (ECO) é uma técnica emergente que está sendo adaptada para a análise de biofilmes nessa faixa linear (deformações da ordem de 10-4-10-5)^8,9.

A aplicação mais estabelecida da OCE até agora é na área biomédica, onde a técnica tem sido aplicada para caracterizar tecidos biológicos que requerem apenas acesso óptico superficial. Por exemplo, Li e col. utilizaram a OCE para caracterizar as propriedades elásticas do tecido cutâneo¹⁰. Outros autores caracterizaram as propriedades elásticas anisotrópicas dos tecidos corneanos suínos e humanos e como eles são afetados pela pressão intraocular 11,12,13,14,15,16. Algumas vantagens do método OCE para o estudo de biofilmes são que ele não é destrutivo e fornece resolução espacial de mesoescala, não requer nenhum preparo de amostra e o método em si é rápido; Ele fornece medidas co-registradas da estrutura física e propriedades elásticas (por exemplo, porosidade, rugosidade superficial e morfologia)8,9,17,18.

O método OCE mede o deslocamento local de propagação de ondas elásticas em um espécime usando tomografia de coerência óptica (OCT) sensível à fase. OCT é um interferômetro óptico de baixa coerência que transforma mudanças locais no deslocamento da amostra em uma mudança de intensidade que é registrada com um espectrômetro óptico. A técnica de OCT também tem sido utilizada em pesquisas de biofilmes para caracterização da estrutura de mesoescala, distribuição de porosidade em três dimensões e deformação do biofilme17,19,20,21. Além disso, Picioreanu e col. estimaram propriedades mecânicas do biofilme usando a modelagem inversa da interação fluido-estrutura de imagens de deformação transversal da OCT²².

Por outro lado, as medidas de OCE, juntamente com a modelagem de onda elastodinâmica inversa, fornecem a velocidade de onda das ondas elásticas na amostra, o que permite a caracterização das propriedades elásticas e viscoelásticas da amostra. Nosso grupo adaptou a técnica OCE para mensuração quantitativa das propriedades elásticas e viscoelásticas do biofilme ^8,9,18 e validou a técnica contra medidas de reometria de cisalhamento em amostras de placa gel de agarose¹⁸. A abordagem OCE fornece estimativas precisas e confiáveis das propriedades do biofilme, uma vez que a velocidade de onda elástica medida está correlacionada com as propriedades elásticas da amostra. Além disso, o decaimento espacial da amplitude da onda elástica pode ser diretamente correlacionado com as propriedades viscoelásticas devido aos efeitos viscosos no material. Nós relatamos medidas OCE de propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos de cultura mista cultivados em um reator anular rotativo (RAR) e biofilmes granulares com geometrias complexas usando modelos de ondas elastodinâmicas¹⁸.

A técnica OCE também é uma alternativa poderosa à reometria^{tradicional18}, que é utilizada para caracterização viscoelástica. Os métodos de reometria são mais adequados para amostras com geometria plana. Dessa forma, biofilmes granulares, que apresentam formas e morfologias superficiais arbitrárias, não podem ser caracterizados com precisão em um reômetro ^8,23. Além disso, ao contrário da OCE, os métodos de reometria podem ser difíceis de adaptar para medidas em tempo real, por exemplo, durante o crescimento de biofilme em células de fluxo^24,25.

Neste artigo, mostramos que as medidas OCE da velocidade de onda independente da frequência das ondas de superfície podem ser usadas para caracterizar as propriedades elásticas do biofilme sem a necessidade de modelos complicados. Este desenvolvimento tornará a abordagem OCE mais acessível à comunidade mais ampla de biofilmes para o estudo das propriedades mecânicas do biofilme.

A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do sistema de OCT utilizado neste estudo. O sistema incorpora vários instrumentos, incluindo um sistema OCT comercial sensível à fase no domínio espectral, um gerador de atraso, um gerador de função e um transdutor piezoelétrico. O sistema OCT opera com o princípio da interferometria empregando uma fonte de luz de banda larga com um comprimento de onda central de 930 nm. A intensidade luminosa coletada, que está correlacionada com detalhes estruturais intrincados na amostra, é analisada na unidade de pós-processamento e, em seguida, convertida em uma imagem transversal da amostra - comumente referida como uma imagem de OCT. A profundidade da OCT depende da gravidade do espalhamento óptico na amostra, que decorre da variação local no índice de refração e é limitada a 1-3 mm em tecidos biológicos e biofilmes. Como a fase óptica na amostra e a intensidade da interferência são moduladas pelo movimento, a OCT pode ser usada para detectar o deslocamento local da amostra. Aproveitamos a sensibilidade de deslocamento da OCT no método OCE para rastrear o campo de deslocamento em estado estacionário das ondas elásticas na amostra. Especificamente, o gerador de função emite uma tensão senoidal para acionar o transdutor piezoelétrico. O transdutor, por sua vez, se alonga e contrai com um histórico de tempo oscilante. O deslocamento oscilatório do transdutor confere uma força senoidal na superfície da amostra através de uma ponta de cunha impressa em 3D no ápice do transdutor, levando à geração de ondas elásticas harmônicas na amostra. A ponta da cunha faz contato leve com a amostra, de modo que a amostra permanece intacta depois que o atuador é retraído da superfície da amostra. Para registrar o deslocamento local na amostra, varreduras de profundidade adjacentes separadas por um atraso de tempo fixo são adquiridas em cada pixel da amostra. A diferença de fase óptica entre varreduras consecutivas em cada ponto de pixel é proporcional ao deslocamento vertical local no mesmo ponto. A sincronização entre o deslocamento do transdutor e a óptica de varredura no sistema OCT é obtida através de um pulso de disparo que se origina do gerador de função e é retardado no gerador de atraso. Esta etapa de sincronização facilita a aquisição de imagens transversais consistentes da distribuição de fase óptica local na amostra. Essas imagens são diretamente proporcionais ao deslocamento harmônico vertical local na amostra e são conhecidas como imagem OCE. As imagens OCE são adquiridas em diferentes frequências de atuação do transdutor para obter o comprimento de onda elástico e a velocidade de onda em função da frequência. As velocidades de onda medidas são analisadas com um modelo elastodinâmico para determinar as propriedades elásticas da amostra.

Protocol

1. Configuração do sistema

1. Reúna os componentes do sistema que incluem o sistema OCT comercial (unidade base, suporte, cabeça de imagem e computador), gerador de forma de onda, transdutor, gerador de atraso/pulso, um interruptor com conexões BNC, cabos e adaptadores BNC, postes ópticos e grampos.
2. Conecte o sinal de sincronização do gerador de funções a um switch. Conecte a outra porta do switch ao gerador de atraso.
3. Conecte a saída do gerador de funções aos cabos do transdutor.
4. Conecte as saídas do gerador de atraso ao canal de disparo na parte traseira da unidade base da OCT. O sinal de saída do gerador de atraso é um pulso de disparo para iniciar o movimento da óptica de varredura no sistema OCT.
5. Ligue os componentes do sistema (unidade base da OCT, computador, gerador de funções e gerador de atrasos) e inicie o software da OCT.
6. Configure o gerador de atraso para enviar um sinal de disparo lógico transistor-transistor para a unidade base da OCT. Consulte o manual do sistema OCT para obter os requisitos do sinal de gatilho.
7. Posicione o transdutor sob a lente da OCT. O transdutor tem uma ponta de cunha impressa em 3D colada em uma de suas extremidades que serve como fonte de linha para ondas elásticas.

2. Aquisição de imagens

1. No software da OCT, selecione o Modo de Aquisição do Doppler e ative o gatilho externo.
2. Coloque o biofilme granular sob a lente em um porta-amostras e mova-o em direção à ponta do transdutor usando um estágio de translação. Certifique-se de que o transdutor faça contato suave com a superfície da amostra, como mostrado na Figura 2. Foram utilizados dois biofilmes granulares (também conhecidos como lodo granular) com diferentes diâmetros nominais (4,3 mm e 3,3 mm). Esta seleção foi feita para investigar o impacto do tamanho do biofilme em suas propriedades mecânicas. Estes foram obtidos comercialmente.
   NOTA: O porta-amostra empregado neste estudo consiste em uma placa plástica impressa em 3D com múltiplas indentações hemisféricas. Este suporte não permite medições em condições nativas. Portanto, introduzimos água do ambiente natural durante as medições para evitar que a amostra secasse.
3. Especifique a região de varredura clicando em Pontos Iniciais e Finais da Linha de Interesse (caminho de propagação de onda) na janela do monitor de exemplo. Centralize essa linha em relação à ponta do transdutor e certifique-se de que ela esteja perpendicular à borda da ponta.
4. Especifique o número de pixels ao longo da região de varredura e a profundidade da amostra e aumente o número de varreduras B (imagens transversais 2D) a serem gravadas para melhorar a relação sinal-ruído das imagens OCE. Os resultados apresentados foram obtidos usando 1523 pixels ao longo do caminho de varredura e 1024 pixels ao longo da profundidade. Um total de 50 varreduras B foram realizadas.
5. Clique no botão Digitalizar e ligue o interruptor. As imagens OCT e OCE devem aparecer na tela. Ative o interruptor dentro do tempo limite do gatilho e do tempo de preparação da varredura.
6. Certifique-se de que a intensidade de referência esteja dentro da faixa ideal e posicione a amostra dentro da região focal da objetiva do microscópio da OCT. Uma amostra devidamente focada deve ter sua borda superior próxima à parte superior da imagem.
7. Ajuste o contorno de fase na imagem OCE na barra de ferramentas de exibição aumentando o valor mais alto da barra de cores do lado esquerdo e diminuindo o valor mais baixo da barra de cores do lado direito. Isso aumentará o contraste de franjas.
8. Configure o gerador de função para produzir uma tensão senoidal de frequência única pressionando o botão Sine no painel frontal e especifique a frequência de excitação inicial para as medições. As medidas deste estudo iniciam-se em 4 kHz e terminam em 9,6 kHz. Ative o conector de saída pressionando a tecla de saída.
9. Defina uma tensão aceitável para a medição. Esse valor deve maximizar a visibilidade da franja, mas também evitar o envolvimento de fases. Para os biofilmes deste estudo e a faixa de frequência das medições, uma tensão entre 5 e 10 V tipicamente resulta em um mapa de fases com bom contraste.
10. Adquira as imagens da OCT e da OCE clicando no botão Gravar .
11. Repita as medidas em diferentes frequências para obter imagens transversais do campo de onda elástica com diferentes comprimentos de onda (ou períodos de franja).

3. Análise de Imagens

1. Obtenha o tamanho físico dos pixels. O tamanho do pixel físico em x é obtido dividindo o campo de visão na direção x pelo tamanho da imagem na direção x e, em seguida, multiplicando por um fator de dois. O tamanho do pixel físico em z é obtido dividindo-se o campo de visão na direção z pelo tamanho da imagem na direção z. Os valores de campo de visão e tamanho da imagem são armazenados na matriz de estrutura com as informações da imagem que podem ser acessadas com a função OCTFileOpen fornecida no SDK do MATLAB no pacote ThorImageOCTA.
2. Obtenha as matrizes OCT e OCE usando as funções OCTFileGetIntensity e OCTFileGetPhase, respectivamente, e faça a média dos quadros registrados. Essas funções são fornecidas no SDK do MATLAB no pacote ThorImageOCTA.
3. Obtenha os locais de pixels da borda superior da amostra binarizando a imagem e detectando os pixels brancos de cima para baixo para cada coluna.
4. Extraia a distribuição de fase da imagem OCE ao longo dessa borda usando a função improfile e calcule o comprimento de arco cumulativo em dimensões reais. Calcule o comprimento do arco tomando a soma cumulativa da norma de diferenças escalonadas entre pontos consecutivos nas direções x e z.
5. Calcule a transformada de Fourier rápida espacial da distribuição de fase medida da OCT (ou seja, a partir das imagens OCE) em relação ao comprimento de arco cumulativo usando a função plomb.
6. Determine a localização do pico no espectro. Essa localização representa a frequência espacial da onda. Calcular a velocidade de onda (ou velocidade de fase) a partir da razão entre a frequência de excitação do transdutor (unidades de Hz) e a frequência espacial (unidade de comprimento inverso).

Results

Neste estudo, foram utilizados biofilmes granulares (também conhecidos como lodo granular), os quais foram obtidos comercialmente. Os grânulos são biofilmes esféricos que se formam por autoagregação, ou seja, não necessitam de um carreador ou superfície para crescer²⁶. A Figura 3A mostra uma imagem representativa da OCT transversal que surge devido à variação espacial do índice de refração local em um biofilme granular. O biofilme tem um diâmetro nominal de 3 mm. Algumas das características internas, incluindo poros e vazios próximos à superfície da amostra, são vistas na imagem. O maior espalhamento óptico ao longo da profundidade da amostra impede que a fonte de luz OCT atinja o centro da amostra, tornando a região central desprovida de qualquer informação discernível. A Figura 3B mostra a imagem OCE transversal da amostra para uma frequência de excitação do transdutor de 5,1 kHz. O contraste local na imagem está correlacionado com o deslocamento vertical local induzido pela onda elástica propagadora na amostra. O espaçamento físico das franjas ao longo do caminho de propagação corresponde ao comprimento de onda da onda superficial elástica. A onda de superfície se propaga perto da superfície da amostra, e tem uma profundidade de penetração próxima ao comprimento de onda. A extensão espacial do deslocamento da onda de superfície não é vista na imagem devido à penetração óptica limitada da fonte de luz OCT na amostra. A distribuição óptica de fases ao longo do caminho de propagação da onda elástica (Figura 4A) é usada para determinar a frequência espacial da onda de superfície. A frequência espacial é obtida tomando-se a transformada rápida de Fourier (FFT; Figura 4B) dos dados e selecionando a frequência na qual a magnitude do espectro FFT é maior.

É crucial selecionar uma tensão geradora de função de magnitude suficiente para produzir um padrão de franja que exiba contraste ideal na imagem OCE. No entanto, tensões excessivamente grandes devem ser evitadas, pois isso pode resultar em envolvimento de fase na imagem OCE, como ilustrado na Figura 5A. O envoltório de fase surge porque a diferença de fase óptica na medição é restrita ao intervalo entre -π e π. Quando a fase excede um desses limites, ela é dobrada para o limite oposto, criando uma distribuição de fase descontínua. Consequentemente, surge a necessidade de desembrulhar fases, o que impõe desafios e pode introduzir potenciais imprecisões. Outro fator a ser considerado para medições precisas de ondas é o número de franjas presentes na imagem OCE. Em baixas frequências de transdutor, representadas na Figura 5B, um ciclo completo de oscilação da onda de superfície pode não ser totalmente capturado devido ao pequeno tamanho do grânulo, e o espectro FFT pode produzir estimativas errôneas para a frequência espacial (ou comprimento de onda inverso). Outra fonte de erro na estimativa de frequência espacial é a presença de modos de onda elástica espacialmente sobrepostos, como ondas de superfície e ondas de cisalhamento em massa, na imagem de OCT. Esses modos de onda se misturam, configurando padrões de interferência complicados que podem ser difíceis de analisar. A presença de vários modos de onda além das ondas de superfície pode introduzir efeitos de interferência próximos ao transdutor, dependendo da amostra específica, frequência de excitação e amplitude. A Figura 6 é um exemplo de uma imagem OCE obtida com uma frequência de excitação de 5,5 kHz, na qual uma onda de cisalhamento em massa próxima ao ponto de excitação local interfere no campo de onda de superfície. A Figura 7A retrata uma distribuição de fases que diverge do padrão de onda senoidal em decomposição observado na Figura 4A, atribuído à combinação de modos de onda. Consequentemente, a FFT resultante exibe um pico mais amplo, como ilustrado na Figura 7B. O mesmo fenômeno pode ocorrer próximo a defeitos como vazios ou regiões com variações acentuadas nas propriedades elásticas/viscoelásticas. Nessas áreas, o campo de deslocamento local é modificado devido à interferência da onda incidente ou de superfície e das ondas espalhadas pelo defeito.

Calculamos a velocidade de onda para a onda de superfície nas frequências entre 4,0 e 9,6 kHz para dois biofilmes granulares com diâmetros nominais diferentes (4,3 mm e 3,3 mm). Os gráficos de velocidade de onda são chamados de curvas de dispersão. Para os ajustes utilizados, cada medida de dispersão levou aproximadamente 15 min. Dentro do intervalo de frequência selecionado, múltiplos ciclos do perfil de deslocamento senoidal estão presentes nas imagens OCE, permitindo a determinação precisa da frequência espacial ao lado de notável contraste de fase. A Figura 8 ilustra as curvas de dispersão obtidas. Essas curvas representam as curvas de dispersão média para três locais dentro de cada amostra. As velocidades de onda de superfície se aproximam de um valor constante, chamado de velocidade de onda de Rayleigh, c_R, que está relacionado com o módulo de cisalhamento da amostra através da relação,

c_R = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)^1/2

onde, G é o módulo de cisalhamento, r é a densidade de massa e ν é a razão de Poisson^27,28. É constante porque a profundidade de penetração da onda elástica é menor que o diâmetro da amostra. Essencialmente, a onda elástica viaja próxima à superfície da amostra com uma velocidade de onda diretamente proporcional ao quadrado do módulo de elasticidade²⁸. No entanto, devido ao ruído de medição, a velocidade da onda não é totalmente constante nesta faixa de frequência. Tomamos a média das velocidades de onda para as frequências entre 6,0 e 9,6 kHz para a amostra menor e entre 4,0 e 9,6 kHz para a amostra maior. Essa velocidade média de onda é então empregada para estimar o módulo de Young da amostra.

Assumimos que a amostra é incompressível devido ao seu alto teor de água. Como tal, ν = 0,5. Assim, c_R está diretamente relacionado a E = 3G para um sólido incompressível, onde E é o módulo de Young da amostra^27,28. As linhas tracejadas na Figura 8 representam as velocidades das ondas de Rayleigh para as diferentes amostras. Assumimos uma composição de biofilme composta principalmente por água, produzindo uma densidade de 1000 kg/m³. Consequentemente, o módulo de Young calculado dos biofilmes granulares é de 85 kPa e 205 kPa para os biofilmes granulares com diâmetros nominais de 4,3 mm e 3,3 mm, respectivamente. Esta medida confirma a capacidade da técnica em discernir diferenças de propriedades mecânicas entre os biofilmes.

Figura 1: Configuração da elastografia de coerência óptica. O esquema do sistema utilizado aqui é mostrado na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Amostra montada. O biofilme granular é posicionado no suporte da amostra enquanto o transdutor faz contato suave com ele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens de OCT e OCT de biofilme granular. (A) Imagem da OCT. (B) Imagem OCE para uma onda de superfície que se propaga a 5,1 kHz mostrando bom contraste de franja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Distribuição de fases e FFT. Para a imagem mostrada na Figura 3B, (A) distribuição da diferença de fase ao longo da borda superior da amostra e (B) FFT da distribuição da diferença de fase mostrando um pico estreito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens de OCT e OCT de biofilme granular. (A) Imagem OCE para uma onda de superfície que se propaga a 5,1 kHz mostrando o envolvimento de fases. (B) Imagem OCE para uma onda de superfície que se propaga a 1,3 kHz sem um ciclo completo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagem OCE mostrando uma combinação de modos. Esta imagem é de um local diferente da amostra e ilustra a combinação de modos para uma onda que se propaga a 5,5 kHz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Distribuição de fases e FFT. Para a imagem mostrada na Figura 6, (A) distribuição da diferença de fase ao longo da borda superior da amostra e (B) FFT da distribuição da diferença de fase mostrando um pico mais amplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Curvas de dispersão. A velocidade da onda em duas amostras com tamanhos diferentes é mostrada em frequências diferentes com barras de desvio padrão. A velocidade de onda de Rayleigh correspondente para a parte plana das curvas é plotada no topo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A profundidade de imagem atingível no sistema OCT é determinada pelo grau de penetração de luz da fonte de luz, que depende do comprimento de onda da fonte. Além disso, o comprimento de onda determina a resolução axial. Comprimentos de onda mais longos podem penetrar mais profundamente na amostra, mas às custas de resolução axial reduzida em comparação com comprimentos de onda mais curtos. A resolução transversal, por outro lado, é dependente tanto da abertura numérica do sistema quanto do comprimento de onda, com comprimentos de onda mais curtos entregando maior resolução. O aumento da abertura numérica introduz um trade-off ao limitar a profundidade de campo²⁹. A resolução espacial é limitada ao menor comprimento de onda elástico que pode ser detectado com uma relação sinal-ruído suficiente. A metodologia atual da OCE é limitada a 0,5 mm ^9,30. Embora esta técnica seja limitada pelo tamanho da amostra, ela deve ser aplicável a vários tipos de biofilme. A forma do biofilme, granular ou plano, não inibirá a técnica. A transparência da amostra também desempenha um papel na determinação da profundidade de penetração. Materiais com alta transparência permitem a passagem da luz por toda a amostra, tornando-a imperceptível à observação, enquanto amostras opacas impedem a penetração da luz, fornecendo detalhes mínimos sobre sua estrutura interna ^9,28. No contexto deste estudo, uma profundidade de penetração na faixa milimétrica é suficiente.

Outro possível problema para essas medidas é que em amostras maiores, nas quais o tamanho não limita o número de ciclos de onda elástica, o campo de visão (FOV) do microscópio OCT pode ser o fator limitante do número de ciclos medidos. Para medições aqui, o FOV é limitado a 9 mm por 9 mm; assim, comprimentos de onda elásticos maiores que 9 mm não podem ser resolvidos neste microscópio OCT. A utilização de uma lente com campo de visão mais amplo possibilitaria a obtenção de imagens de amostras maiores, produzindo mais franjas nessas frequências mais baixas. Os desafios também surgem em frequências mais altas. Para as amostras deste estudo, além de 10 kHz, a onda experimenta atenuação significativa, diminuindo a magnitude da distribuição da diferença de fase e dificultando a determinação da frequência espacial. Essa preocupação pode ser mitigada com o aumento da tensão do gerador de função, aumentando assim o deslocamento do transdutor. No entanto, aumentar o deslocamento é apenas útil até certo ponto, pois isso acabará em fase⁹. Alternativamente, melhorar a sensibilidade do sistema através da implementação de uma fonte de luz com maior potência pode neutralizar o envoltório de fase causado por deslocamentos maiores e facilitar a detecção da resposta dinâmica a excitações menores. Uma maior sensibilidade facilita a implementação de métodos acústicos de OCE que oferecem o benefício do carregamento sem contato, mas são mais profundamente afetados pela alta atenuação³¹.

Ao realizar essas medições em biofilmes, é fundamental manter as amostras hidratadas. A secagem leva a um aumento indesejável da rigidez, o que é irrelevante, uma vez que o foco está na avaliação das propriedades da amostra sob seu ambiente nativo. Não estudamos a secagem induzida por iluminação. No entanto, observamos que a água do ambiente natural foi adicionada periodicamente durante toda a medição, e durante esse tempo, a morfologia da amostra foi monitorada através das imagens de OCT, e nenhuma mudança perceptível na morfologia foi observada. Além disso, ao posicionar o transdutor e capturar imagens OCE, é essencial levar em conta as características discernidas na imagem OCT. Heterogeneidades ao longo do caminho de propagação da onda têm o potencial de distorcer o campo ondulatório e, portanto, devem ser evitadas⁹. Além disso, manter contato suave com o biofilme é crucial, pois a pressão excessiva sobre a amostra, além de potencialmente modificar suas características mecânicas, também poderia levar à distorção do campo de onda. Finalmente, a região de varredura deve ser perpendicular às frentes de onda para garantir que a frequência espacial da onda harmônica seja determinada com precisão a partir da medição.

Para algumas frequências, variações significativas nas velocidades de onda foram observadas em ambas as amostras, o que pode ser atribuído às suas heterogeneidades inerentes, campo de onda nessa frequência específica e morfologia das vias de propagação. Mostramos anteriormente que o perfil medido de velocidade de onda através de um biofilme granular seccionado não é uniforme devido à^{microestrutura} heterogênea9. Consequentemente, ao empregar esta técnica em biofilmes granulares, é imperativo realizar medições em vários locais ao longo da amostra para derivar uma representação média.

Uma observação importante em relação às curvas de dispersão é que elas exibem comportamentos distintos para diferentes tamanhos amostrais. No caso da amostra maior, a curva permanece relativamente constante ao longo da faixa medida. No entanto, para a amostra menor, há uma tendência de aumento na velocidade de onda com o aumento da frequência, particularmente na porção inferior da faixa. Esse fenômeno pode ser atribuído à presença de efeitos viscoelásticos em frequências mais baixas e à geração de modos guias de onda elásticos. Explicamos esses efeitos em nosso trabalho anterior usando modelos inversos mais sofisticados ^8,9,18.

É importante notar que em sistemas granulares aeróbios, a biomassa não é distribuída uniformemente por toda a altura do reator. Durante as fases de não aeração, grânulos maiores tendem a se depositar no fundo do reator. Essa distribuição desigual faz com que agregados de diferentes tamanhos tenham acesso a quantidades variáveis de substrato. Como resultado, agregados de diferentes tamanhos exibem composição de comunidade distinta. Além disso, como o excesso de lodo é removido seletivamente, grânulos maiores tendem a ser retidos no reator por períodos mais longos, enquanto os menores são mais facilmente removidos³². A diferença notável no módulo de Young sugere uma conexão potencial entre a composição do biofilme, idade e propriedades mecânicas.

Em resumo, o método de Elastografia de Coerência Óptica (OCE) oferece um meio rápido e não destrutivo de avaliar a velocidade de onda elástica em biofilmes. Este método supera as restrições das medidas reológicas e exibe atributos aprimorados em comparação com técnicas alternativas de elastografia8,18. Além disso, sua aplicabilidade vai além dos biofilmes granulares para abranger qualquer amostra parcialmente transparente com profundidade de penetração óptica adequada e tamanho grande o suficiente para ser resolvido pelo sistema, incluindo exemplos como hidrogéis³³, córnea³⁴ e pele³⁵. Os avanços futuros do método abrangem vários aspectos fundamentais. Em primeiro lugar, aumentar a frequência das ondas elásticas harmônicas para a faixa de centenas de kHz permitirá comprimentos de onda de alguns micrômetros, alcançando assim resolução espacial em escala semelhante. Em segundo lugar, a relação sinal-ruído do sistema de detecção óptica será melhorada através do aumento da potência óptica do sistema OCT de 2 mW (corrente) para 20 mW. Por fim, substituiremos o atuador harmônico de contato por uma fonte de pressão de radiação acústica sem contato. Essa adição facilitará a operação não invasiva e não destrutiva e permitirá interrogar amostras de biofilme em seus ambientes nativos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suporte de
3D Ponta			3 mm de largura
	Qualquer marca
Gerador de atraso	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Gerador de atraso/ pulso digital
Gerador de funções	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Gerador de Função / Forma de Onda
Arbitrária Biofilme granular	Sistemas		Obtidos de um reator Aeróbico de Lodo Granular (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Transdutor piezoelétrico	Thorlabs	PK2JUP1	Pilha Piezo Discreta, 75 V, 30.0 µ m Deslocamento
SD-OCT Sistema	Thorlabs		Ganimedes II, LSM03 lente de varredura
ThorImageOCT	Thorlabs		Versão: 5.5.5