Modelo de camundongo de crescimento colateral coronariano por isquemia repetitiva

Resumo

Este trabalho apresenta um método para estudar o crescimento colateral coronariano pós-natal induzido por isquemia repetitiva em camundongos, incluindo o implante cirúrgico de um oclusor pneumático na artéria descendente anterior, um sistema de insuflação automatizado para o protocolo de isquemia repetitiva e métodos potenciais para avaliar o crescimento colateral.

Resumo

As colaterais coronárias são um bypass natural nas doenças isquêmicas do coração (DIC) e, portanto, por muitos anos, o crescimento colateral coronariano (CCG) tem sido um alvo terapêutico promissor para a DIC, particularmente em pacientes com diabetes tipo 2 ou síndrome metabólica em que o CCG está comprometido. No entanto, esse processo é pouco estudado, em parte devido à falta de modelos de camundongos de CCG, embora outros modelos animais, como porcos, cães e ratos, tenham sido estabelecidos. Um modelo de camundongo pode aproveitar as muitas modificações genéticas disponíveis para a espécie, incluindo rastreamento de linhagem e regulação gênica (superexpressão ou nocaute), para elucidar o processo e o mecanismo do CCG, incluindo as vias e os tipos de células envolvidos. Portanto, nos propusemos a desenvolver um modelo de camundongo de CCG induzido por isquemia repetitiva (IR) via transiente, oclusão repetitiva da artéria descendente anterior (DAE). Este manuscrito fornece detalhes deste modelo CCG de camundongo, incluindo a cirurgia RI para implantar um oclusor pneumático no LAD, o sistema automatizado de inflação baseado em pressão usado para controlar a pressão e o tempo de inflação e a sequência do protocolo RI. Este método já gerou uma publicação para elucidar o processo de CCG induzido por IR, mostrando que a angiogênese germinada dá origem a artérias coronárias maduras no CCG em corações de camundongos adultos.

Introdução

A doença isquêmica do coração (DIC) é a principal causa de mortalidade nos Estados Unidos, e mais de 200.000 cirurgias de revascularização do miocárdio são realizadas anualmente em um esforço para tratar a doença¹. As colaterais coronárias, anastomoses entre ramos da árvore arterial coronária, são um bypass natural que pode reabastecer o sangue ao tecido isquêmico a jusante de um bloqueio²; no entanto, as pessoas exibem uma grande variação na extensão de suas redes colaterais nativas ^3,4. Pacientes com DIC que têm colateralização coronariana mais extensa têm melhores resultados durante eventos cardíacos, incluindo redução do tamanho do infarto e mortalidade. Assim, o crescimento colateral coronariano (CCG) tem sido um alvo terapêutico há mais de uma década ^5,6,7. É de particular interesse para o crescente número de pacientes com síndrome metabólica⁸, que apresentam pior colateralização coronariana⁹. No entanto, até que o processo e o mecanismo do CCG sejam melhor compreendidos, é improvável que a tentativa de induzir o CCG para o tratamento da DIC seja frutífera.

Colaterais coronárias foram estudadas em modelos animais de grande porte, e oclusões breves e repetitivas das artérias coronárias principais foram usadas para induzir CCG em porcos¹⁰, cães¹¹ e ratos¹². Um modelo de camundongo de CCG, no entanto, teria mais vantagens no estudo dos mecanismos moleculares e celulares do CCG por causa das muitas linhagens de camundongos geneticamente modificadas prontamente disponíveis, incluindo rastreamento de linhagem, linhagens transgênicas e nocautes específicas de genes ou células. Curiosamente, ao contrário dos humanos, os camundongos não têm colaterais coronárias^{nativas 13,14}, tornando-os um modelo atraente para estudar a formação de colaterais coronárias. De fato, um relatório recente mostrou que em pacientes com doença arterial obstrutiva, quase metade (47%) não tinha colateralização (Rentrop grau 0)³; assim, um modelo de camundongo de CCG pode ser clinicamente relevante para pacientes com colateralização nativa mínima.

Portanto, desenvolvemos um modelo de camundongo de CCG induzido por isquemia repetitiva, com um balão inflável oclusor sobre a artéria descendente anterior esquerda (DAD) que usa um sistema de insuflação baseado em pressão automatizado com um temporizador. O protocolo de isquemia repetitiva é capaz de estimular o crescimento colateral, como mostrado em publicação recente¹⁴. Este modelo de camundongo de CCG fornecerá uma nova visão sobre o processo de CCG nos níveis celular e molecular e pode ser usado para validar alvos potenciais para promover o CCG.

Protocolo

Os experimentos com animais descritos foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Northeast Ohio Medical University.

1. Preparação cirúrgica

NOTA: Para o protocolo RI, use camundongos C57BL / 6 de ambos os sexos pesando pelo menos 25 g. Use técnica asséptica durante toda a cirurgia.

1. Configuração
   1. Esterilize todas as ferramentas em uma autoclave ou esterilizador de contas. Esterilize materiais e implantes delicados, como oclusores, cordões e tubos de PE, com óxido de etileno (EtO).
   2. Limpe a área cirúrgica limpando todas as áreas com etanol a 70%. Prepare a área colocando todas as ferramentas e suprimentos em cortinas estéreis. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista completa de suprimentos.
2. Intubação de camundongos
   1. Anestesiar brevemente o camundongo com isoflurano a 3% com oxigênio (vazão de 1 L/min) até que o reflexo de endireitamento seja perdido. Depile a área do peito, o centro das costas e atrás da orelha direita; Remova completamente os pelos soltos. Injete glicopirrolato por via intramuscular a 0,01-0,02 mg / kg.
   2. Anestesiar novamente com isoflurano a 3% -4% por 5 min. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma inclinação, contido em seus incisivos superiores, e use uma pinça embotada para mover a língua para o lado. Intube rapidamente o mouse com um angiocath 20G usando uma luz de fibra óptica e um laringoscópio de aumento.
   3. Coloque o camundongo em decúbito dorsal em uma almofada cirúrgica de aquecimento e conecte o tubo de intubação a um ventilador de pequenos animais com isoflurano a 3%. Confirme a intubação verificando se há elevação torácica bilateral rítmica. Confirme a profundidade adequada da anestesia por falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé.
3. Preparação do campo cirúrgico
   1. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.
   2. Limpe as áreas raspadas com betadina e depois etanol 70%, limpando uma vez de forma unidirecional.
   3. Aplique creme de eletrodo nos contatos do eletrocardiograma (ECG) na almofada cirúrgica e prenda os membros do camundongo neles. Coloque gaze estéril sobre a metade inferior do mouse.
   4. Monitore a frequência respiratória, a temperatura e a profundidade da anestesia ao longo da cirurgia usando a interface de software do coxim cirúrgico.
4. Toracotomia esquerda e implante de oclusão
   1. Diminua o isoflurano para 2%. Faça uma incisão na linha média de 2-3 cm na pele do tórax usando uma tesoura e, em seguida, use uma pinça curva para separar suavemente a pele e as camadas musculares do lado esquerdo do tórax (Figura 1A).
   2. Usando uma pinça embotada, faça suavemente uma abertura através da parede torácica para expor o coração, normalmente entre o^3º e o^5º intercostais.
   3. Use um afastador para espalhar suavemente as costelas e visualizar o coração. Usando uma pinça embotada, rasgue o pericárdio para expor o coração. Localize a aurícula esquerda (Figura 1B) e visualize a parte basal da artéria descendente anterior (DAE), se possível.
   4. Passe um 8-0 sutura de polipropileno através do miocárdio abaixo da ADA.
      NOTA: A distância entre a entrada e a saída deve ser aproximadamente igual à largura do oclusor e perpendicular ao LAD.
   5. Remova os retratores. Usando uma pinça pontiaguda, exteriorize a extremidade do tubo oclusor através da parede torácica no segundo espaço intercostal inferior e puxe o tubo oclusor para fora através da parede torácica até que o oclusor esteja localizado sobre o coração na cavidade torácica.
   6. Amarre o oclusor firmemente ao coração usando um nó de cirurgião (Figura 1C) para que o oclusor fique sobre o coração, mas não o pressione.
   7. Encha brevemente o oclusor (~10 s) a 10 psi usando o dispositivo de inflação de botão (Figura 2). Verifique o eletrocardiograma para confirmar a elevação do segmento ST durante a insuflação e, se possível, confirme visualmente o branqueamento do ápice do coração. Ajuste a posição ou tensão da sutura conforme necessário para confirmar a isquemia.
5. Fechamento
   1. Feche as costelas flanqueadoras com fio de polipropileno 6-0, inserindo o dreno torácico. Evacue o ar e o sangue do tórax e, em seguida, remova o dreno torácico. Aplique lidocaína a 2% na incisão fechada na parede torácica.
   2. Usando uma pinça pontiaguda, faça um túnel do tubo oclusor sob a pele do ombro direito para exteriorizar o tubo através da pele atrás da orelha direita. Substitua os músculos do peito e feche a pele com uma sutura de poliglactina 6-0 (Figura 1D).
   3. Vire o mouse para a posição de bruços. Administre cetoprofeno por via subcutânea na dose de 3 mg / kg (usando uma diluição de 1 mg / mL em solução salina estéril a 0,9%) pelo menos 30 minutos antes do final da cirurgia.
6. Implantação de amarração
   1. Usando uma tesoura pequena, faça uma pequena incisão (1 cm) na pele no centro das costas e separe suavemente a pele da gordura subcutânea e do tecido muscular.
   2. Encapsule o tubo oclusor até a incisão no centro das costas, exteriorize-o e passe-o pela corda. Use uma sutura 6-0 para fechar o pequeno orifício perto da orelha.
   3. Use pontos de polipropileno 6-0 para fixar a corda aos músculos das costas (Figura 1E). Feche a pele sobre o botão de amarração com suturas 6-0.
7. Recuperação
   1. Remova o tubo de intubação assim que o mouse puder respirar de forma independente; coloque o camundongo em uma gaiola RI pós-cirúrgica (para um único animal; Figura 3) uma vez que a resposta de beliscão do pé tenha retornado. Monitore o camundongo continuamente até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Coloque a gaiola em uma almofada térmica até que o mouse recupere a mobilidade total.
   2. No dia seguinte, administre uma segunda dose de cetoprofeno por via subcutânea a 3 mg / kg.
   3. Deixe o mouse descansar por 5-7 dias antes de iniciar o protocolo RI. Monitore os ratos diariamente quanto à integridade da instrumentação e troque as gaiolas conforme necessário. Forneça o enriquecimento apropriado conforme necessário, pois os camundongos são alojados individualmente durante o protocolo RI.

2. Isquemia repetitiva

1. Verificar a colocação do oclusor por ecocardiografia no dia 0 do protocolo IR, conforme descrito anteriormente¹⁵. Observe a diminuição da função cardíaca durante a insuflação do oclusor.
2. Conecte o tubo oclusor do mouse ao sistema de inflação RI (Figura 4). O sistema inflará o oclusor a 10 psi por 6 min, 4x ao dia, com um intervalo de 3 h entre cada inflação (Figura 5).
3. Após 17 dias de IR, verifique novamente a função cardíaca como na etapa 2.1.

3. Perfusão de polímeros e colheita de tecidos

1. No momento do sacrifício, anestesiar o camundongo com isoflurano a 3%-4% e injetar heparina (500 U/kg) por via intraperitoneal. Use um cone nasal para continuar a administração de isoflurano a 2% por pelo menos 5 minutos e, em seguida, confirme a profundidade adequada da anestesia por falta de resposta de pinça do dedo do pé.
2. Abra a cavidade torácica para expor o coração e a aorta torácica. Canular a aorta torácica descendente com tubo PE20 e bissetar a veia cava inferior (VCI) para permitir a saída; perfundir o coração retrógrado com 1x PBS até que o fluido que sai da VCI esteja limpo, seguido por 3 mL de lidocaína a 1% e, em seguida, 3 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Faça uma ligadura permanente do LAD na posição exata do oclusor.
3. Perfundir retrógradamente o coração com um reagente radiopaco até que o circuito arterial esteja cheio. Prenda o tubo PE20 com hemostáticos e deixe o polímero curar por 90 min. Imagem do coração sob um escopo de dissecação.

Resultados

De 136 camundongos C57BL / 6, incluindo machos e fêmeas, a taxa de sobrevivência da cirurgia de IR foi de 93,4%, com 80,9% dos camundongos sobrevivendo durante todo o protocolo de IR de 17 dias.

O protocolo de IR de camundongos foi otimizado com base em modelos anteriores de IR^{em animais 12,16}, que apresentam episódios curtos de isquemia sem lesão permanente do miocárdio. Durante a cirurgia, a avaliação funcional do oclusor pode ser fe...

Discussão

As colaterais coronárias são um bypass natural para pacientes com DIC. Após o fracasso dos ensaios clínicos direcionados à angiogênese¹⁷, promover o desenvolvimento colateral coronariano pode ser uma abordagem terapêutica melhor para esses pacientes. Diferentemente dos capilares derivados da angiogênese, que possuem apenas uma única camada de células endoteliais, as colaterais são artérias maduras com cobertura de células musculares lisas. As colaterais ressuprime...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça #5/45 graus	Fine Science Tools	11251-35
Válvula Solenóide Elétrica de Latão Fechado	U.S. Sistema de	USS2-00054	sólido
/4" Válvula solenóide elétrica de latão aberto	Sistema de inflação	AceCrew
Tubulação pneumática de 1/4"	‎ China SNS Pneumatic Co., Ltd	‎ Dispositivo de botão de pressão APU1/4-32.8ft
Conectores push-in de 1/4"	Dispositivo de botão de pressão	RuoFeng	543Y
Acessórios de latão de 1/8"	Sistema de inflação industrial
borda Válvula solenóide elétrica pneumática de 2 posições	de pressão USS-PSV00033	sólido dos EUA
Angiocath	BD	381703 45
graus Porta-agulhas Castroviejo	Roboz	RS-6421
6-0 suturas de poliglactina	DemeTECH	G176011B13M
6-0 suturas de polipropileno	AD Sugical	XS-P618R11
70% Etanol
8-0 suturas de polipropileno	DemeTECH	PM19800, 65G0P
Betadine	Purdue Products	367618150085
Tesoura de nariz rombudo	World Precision Intruments	500366
Haste de			gaiola pós-cirúrgica; corte para 12,5 cm
Cotonetes (3")	Puritan	872-PC DBL
Curity Gauze Esponjas (2x2)	Cardinal Health	2146
Dipsey chumbadas giratórias	Water Gremlin		gaiola pós-cirúrgica
Creme de eletrodo	Signacreme	17-05
Glicopirrolato	Westward	0143-9679-01
Hemostáticos Hartman	Fine Science Tools	13003-10
Isoflurano	Covetrus	29404
Cetofeno (cetoprofeno)	zoetis	10004031
Lidocaína (2%)	Covetrus	14583
MICROFIL (amarelo)	Flow Tek	MV-122
Mini Botão de pressão	Interactivia	E-SWC-PBM-PBS-105	dispositivo de botão de pressão Regulador de
pressão de ar em miniatura PneumaticPlus		PPR2-N02BG-4	dispositivo de botão
de pressão Afastador de mola Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
Ventilador MiniVent	Harvard Apparatus	73-0044
Occluder			Custom
made Octógono manipulado fórceps	Fine Science Tools	11041-08
Ohan Rodent Intubation System	BMR Supply	Ohan-201
Solução de paraformaldeído 4% em PBS
PE20
			PE50
Giratória de plástico (1 canal)	Gaiola pós-cirúrgica	Instech	375/25PS
Buffer PBS pré-misturado, 10x	Roche	11666789001	Diluído para 1x
Manômetro	PIC Gauges	102D-158D-10/32	dispositivo de botão de pressão Temporizador
de saída digital programável	BN-LINK	‎ Sistema de inflação BND-60/SU105
Pomada Oftálmica Puralube Vet	Dechra	17033-211-38
Afastadores com elastômero 18200-07	Ferramentas de Ciência Fina	18200-10 e 18200-11
Monitor Cirúrgico de Roedores +	Scintica	900-0053-01
Pinça de amarração de sutura com cabo redondo	Ferramentas de Fine Science	18026-10
Snap-lock barril giratório (tamanho 5)	Garra de Águia	‎ 01032-005	ferramentas
retas da ciência	dos	pós-cirúrgica 12060-01
Tether	Instech	PS62

inflação 1de Dispositivo de botão flecha de fibra de carbono Santa Cruz sc-281692 tubulação Tubulação suportes da agulha da gaiola