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Artigo de método

Diferenciação de linhagens do sistema nervoso entérico de células-tronco pluripotentes humanas

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DOI:

10.3791/66133

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17 de maio de 2024

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1Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 2Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, 3Program in Craniofacial Biology, University of California, San Francisco

Neste artigo

Resumo

A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.

Resumo

O sistema nervoso entérico humano, ENS, é uma grande rede de tipos de células gliais e neuronais com notável diversidade de neurotransmissores. O ENS controla a motilidade intestinal, a secreção enzimática e a absorção de nutrientes e interage com o sistema imunológico e o microbioma intestinal. Consequentemente, os defeitos de desenvolvimento e adquiridos do SNE são responsáveis por muitas doenças humanas e podem contribuir para os sintomas da doença de Parkinson. Limitações em sistemas de modelos animais e acesso ao tecido primário representam desafios experimentais significativos em estudos do ENS humano. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a derivação in vitro eficaz das linhagens ENS de células-tronco pluripotentes humanas, hPSC, usando condições de cultura definidas. Nosso protocolo começa com a diferenciação direcionada de hPSCs em células da crista neural entérica em 15 dias e produz diversos subtipos de neurônios entéricos funcionais em 30 dias. Essa plataforma fornece um recurso escalável para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e aplicações regenerativas.

Introdução

O sistema nervoso entérico (SNE) é o maior componente do sistema nervoso periférico. O ENS contém mais de 400 milhões de neurônios localizados no trato gastrointestinal e controlam quase todas as funções do intestino1. A compreensão molecular do desenvolvimento e função do SNE e seus defeitos nas neuropatias entéricas requer acesso a uma fonte confiável e autêntica de neurônios entéricos. O acesso ao tecido primário humano é limitado e os modelos animais não conseguem recapitular os principais fenótipos da doença em muitas neuropatias entéricas. A tecnologia de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) provou ser extremamente benéfica no fornecimento de uma fonte ilimitada de tipos de células desejados, especialmente aquelas que são difíceis de isolar de fontes primárias 2,3,4,5,6,7. Aqui, fornecemos detalhes de um método in vitro passo a passo e robusto para obter culturas ENS de hPSCs. Essas culturas escaláveis derivadas de hPSC abrem caminhos para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças e triagem de medicamentos de alto rendimento e podem fornecer células transplantáveis para medicina regenerativa.

As linhagens de neurônios entéricos são derivadas de células da crista neural (NC) que seguem o caminho de desenvolvimento do SNE durante a embriogênese. Nos embriões, as células NC emergem ao longo das margens da placa neural dobrável. Eles proliferam, migram e dão origem a muitos tipos de células diferentes, incluindo neurônios sensoriais, células de Schwann, melanócitos, esqueleto craniofacial e neurônios entéricos e glia 8,9,10. A decisão do destino celular depende da região distinta ao longo do eixo ântero-posterior de onde emergem as células NC, ou seja, NC craniana, NC vagal, NC do tronco e NC sacral. O SNE se desenvolve a partir de células NC vagais e sacrais, com a primeira dominando a população de neurônios entéricos devido à extensa migração ao longo do intestino e colonizando o intestino11.

A derivação de células NC de PSCs geralmente envolve uma combinação de inibição dupla de SMAD e ativação da via WNT12,13. Até recentemente, todos os protocolos de indução de NC envolviam soro e outros aditivos de produtos de origem animal nas condições de cultura. Meios quimicamente indefinidos não apenas reduzem a reprodutibilidade da indução de NC, mas também desafiam os estudos de desenvolvimento mecanicista. Para superar esses desafios, Barber et al14 desenvolveram um protocolo de indução de NC usando condições de cultura quimicamente definidas e, portanto, foi vantajoso em relação a métodos alternativos que dependem de fatores de reposição de soro (por exemplo, KSR) 13 , 14 . Isso foi obtido por substituições de meios basais e otimizando um protocolo originalmente apresentado por Fattahi et al para derivar células NC entéricas de hPSCs. Este sistema aprimorado é a base do protocolo de diferenciação de hPSC que é apresentado aqui. Começa com a indução de células da crista neural entérica (ENC) em um período de 15 dias por modulação precisa da sinalização BMP, FGF, WNT e TGFβ, além do ácido retinóico (RA). Em seguida, derivamos as linhagens ENS tratando células com fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF). Todas as composições de meios são quimicamente definidas e produzem culturas neuronais entéricas robustas dentro de 30 a 40 dias.

Além do sistema de cultura de células em monocamada descrito aqui, foram desenvolvidas abordagens alternativas de indução de NC que usam corpos embrióides flutuantes 15,16. As células migratórias nessas culturas demonstraram expressar marcadores NC com um subconjunto representando o NC vagal. Co-culturas com tecido intestinal primário têm sido usadas para enriquecer precursores entéricos de NC nessas culturas. As composições de mídia nesses estudos contêm uma combinação de diferentes fatores, como fator de crescimento nervoso, NT3 e fator neurotrófico derivado do cérebro. Nesta fase, não está totalmente claro como esses fatores podem afetar as identidades de comprometimento do precursor do neurônio entérico. Para uma comparação eficiente da indução de NC entérica nas culturas baseadas em monocamada e corpo embrióide, são necessários mais dados. Dadas as diferentes configurações de cultura nessas estratégias, o uso de cada método deve ser considerado e otimizado de acordo com a aplicação específica em mente.

O protocolo aqui apresentado é reprodutível e foi testado com sucesso por nós e outros usando diferentes linhagens de hPSC (induzida e embrionária) 8,14,16.

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Protocolo

1. Preparação de mídia

NOTA: As concentrações mencionadas em todo o protocolo são concentrações finais dos componentes do meio. Preparar todos os meios em condições estéreis numa coifa de fluxo laminar e conservar a 4 °C no escuro. Use dentro de 2 semanas.

  1. Meio de manutenção hPSC: Misture o suplemento de meio de manutenção hPSC sem alimentador (20 μL / mL) com seu meio base.
  2. Meio A: Adicione a proteína morfogenética óssea 4 (BMP4; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (600 nM) ao meio de base de diferenciação.
  3. Meio B: Adicione SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (1,5 μM) ao meio base de diferenciação.
  4. Meio C: Adicione SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) e RA (1 μM) ao meio base de diferenciação.
  5. Meio completo da crista neural (NCC): Adicione FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) ao meio neurobasal.
  6. Meio ENC: Adicione GDNF (10 ng/mL), ácido ascórbico (100 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) ao meio neurobasal.
  7. Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1x: Diluir 500 mM de EDTA (1000x) até uma concentração final de 500 μM em PBS.
    NOTA: Use PBS livre de Ca2+ e Mg2+ em todo este protocolo, salvo indicação em contrário.

2. Revestimento de placas de cultura

  1. Placas revestidas com matriz de membrana basal: Descongele rapidamente e dilua uma alíquota congelada de 500 μL de matriz de membrana basal em 50 mL de DMEM:F12 resfriado pipetando vigorosamente usando uma pipeta sorológica de 50 mL. Revestir os alvéolos com a solução diluída de matriz da membrana basal (100 μL porcm2 de superfície do poço) e incubá-los durante a noite a 37 °C. Aspire o meio de revestimento antes de usar. Para evitar a gelatinização da matriz da membrana basal, execute esta etapa o mais rápido possível e use DMEM:F12 frio para dissolver a alíquota congelada.
    NOTA: A temperatura da matriz da membrana basal deve ser mantida fria durante o descongelamento (no gelo) e alíquotas (tubos no gelo) para evitar a coagulação.
  2. Placas revestidas com PO / FN / laminina: Prepare uma solução de poliornitina (PO) de 15 μg / mL em PBS diluindo um estoque de 1000x. Revestir os alvéolos com 100 μL de solução de PO/PBS porcm2 de superfície do poço e incubar as placas durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, aspire PO / PBS e cubra os poços a 100 μL por cm2 de área de superfície do poço com solução recém-feita de FN / laminina / PBS contendo 2 μg / mL de fibronectina (FN) e 2 μg / mL de laminina. As placas podem ser utilizadas após um mínimo de 2 h de incubação a 37 °C. Aspire FN / laminina / PBS antes de usar.

3. Manutenção da cultura de hPSC

NOTA: Todas as etapas de incubação celular estão a 5% de CO2 e a 37 °C em uma incubadora umidificada.

  1. Aspire o meio hPSC da cultura hPSC e adicione meio fresco (200 μL porcm2 de área de superfície do poço) a cada dois dias até que as colônias estejam ~ 80% confluentes.
  2. Para passar, aspire o meio hPSC e lave as células com 100 μL de PBS porcm2 de área de superfície do poço.
    NOTA: É importante usar PBS livre de Ca2+ e Mg2+ para lavar as células.
  3. Adicionar 500 μM de EDTA (100 μL porcm2 de área de superfície do poço). Recoloque a tampa da placa. Observe através de um microscópio invertido e monitore as células quanto ao desprendimento das bordas da colônia (2-4 min).
  4. Use uma pipeta sorológica de 5 ou 10 mL para transferir o mesmo volume de meio hPSC para cada poço e colha mecanicamente as células pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
    NOTA: O tempo ideal de incubação do EDTA depende da linha iPSC. Evite pipetagem vigorosa para separar colônias, pois pode levar à dissociação excessiva da colônia e à morte celular. Ao passar para iniciar uma placa de diferenciação, incube as células com EDTA por mais 1-2 minutos.
  5. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células (2 min, 290 x g, 20-25 °C) e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
  6. Ressuspenda as células em um volume apropriado de meio hPSC e transfira para poços de uma nova placa revestida com matriz de membrana basal.
    NOTA: Para manutenção regular de hPSC, use uma taxa de passagem de 1:18 - 1:24 (1:18 significa transferir um terço das células dissociadas de um único poço de uma placa de 6 poços para uma placa totalmente nova). Para iniciar uma placa de diferenciação, siga uma taxa de passagem de 5:6.
  7. Incubar a 5% de CO2 e 37 °C.

4. Indução da crista neural

NOTA: Esta etapa é representada esquematicamente na Figura 1A. Comece a diferenciação NC quando as células estiverem cerca de 80% confluentes. Isso será alcançado dentro de 1-2 dias, quando as células forem passadas na proporção de 5:6 (veja acima). Inicie a diferenciação NC no dia 0 com células hPSC pluripotentes e totalmente indiferenciadas. Para uma alta eficiência, as bordas da colônia devem ter células de diferenciação mínimas. Passagem e placa hPSC para diferenciação quando as colônias são grandes ou o centro da colônia começa a engrossar/escurecer quando monitorado usando um microscópio invertido. Prestar atenção à confluência e morfologia tende a ser mais confiável do que o número de células plaqueadas, pois isso pode variar dependendo da linhagem celular e pode variar de 50.000 a 200.000 por cm2.

  1. No dia 0, substitua o meio de manutenção hPSC pelo meio A contendo 1 ng/mL BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL de meio porcm2 de área de superfície do poço).
  2. No dia 2, as células devem estar 100% confluentes. Aspire suavemente o meio A gasto e alimente as células com o meio B contendo 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μL de meio por cm2 de área de superfície do poço).
    NOTA: À medida que as culturas crescem durante a indução NC, as células podem se desprender da monocamada subjacente. Evite o excesso de perda de células removendo suavemente o meio antigo e adicionando o meio novo na lateral do poço.
  3. No dia 4, alimente as células novamente com o meio B (200 μL de meio porcm2 de área de superfície do poço).
  4. No dia 6, substitua o meio B pelo meio C contendo 10 μM de SB431542, 1,5 μM de CHIR99021 e 1 μM de ácido retinóico (400 μL de meio por cm2 de área de superfície do poço).
  5. Nos dias 8 e 10, alimente como no dia 6.

5. Formação de esferóides ENC

NOTA: Esta etapa é representada esquematicamente na Figura 1B.

  1. No dia 12, aspire suavemente o meio C e lave as células com 100 μL de PBS porcm2 de área de superfície do poço. Adicione o mesmo volume de solução de descolamento celular e incube por 30 min a 5% de CO2 e 37 ° C.
  2. Dilua a solução de descolamento celular adicionando o mesmo volume de meio NCC contendo 10 ng / mL de FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL / mL de suplemento de N2, 20 μL / mL de suplemento de B27, 10 μL / mL de suplemento de L-glutamina e 10 μL / mL de MEM NEAA. Com uma pipeta serológica, colher a suspensão monocelular e adicioná-la a um tubo cónico de 15 ml.
  3. Centrifugar as células (2 min, 290 x g, 20-25 °C) e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
  4. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 12 mL (para uma placa completa de 6 poços) de meio NCC e ressuspenda as células completamente pipetando mecanicamente para cima e para baixo 1-2 vezes. Transfira a suspensão da célula para uma placa de fixação ultrabaixa.
    NOTA: Aproximadamente 10 cm2 de células de monocamada ENC são ressuspensas em 2 mL de meio NCC e transferidas para um poço de uma placa de fixação ultrabaixa. Isso equivale a uma placa de indução NC completa de 6 poços transferida para uma placa de fixação ultrabaixa completa de 6 poços.
  5. No dia 14, gire suavemente as placas até que pequenos esferóides estejam reunidos no centro de cada poço. Usando uma micropipeta P1000 e em um movimento circular lento, aspire o meio NCC gasto ao redor da circunferência de cada poço. Tente evitar remover os esferóides flutuantes.
  6. Alimente as células com o volume original do meio NCC.

6. Indução EN

NOTA: Esta etapa é representada esquematicamente na Figura 1B.

  1. No dia 15, aplique a mesma técnica usada no dia 14 para remover suavemente o meio e lavar os esferoides com PBS. Remova o máximo de PBS possível, evitando os esferóides.
  2. Adicionar solução de descolamento celular (100 μL porcm2 de área de superfície do poço) e dissociar os esferóides em células únicas, incubando durante 30 min a 5% de CO2 e 37 °C.
  3. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione um volume igual de meio ENC (contendo 10 ng/mL de GDNF, 100 μM de ácido ascórbico, 10 μL/mL de suplemento de N2, 20 μL/mL de suplemento de B27, 10 μL/mL de suplemento de L-glutamina e 10 μL/mL DE MEM NEAA em meio neurobasal) a cada poço e quebre os esferoides restantes por 2-3 rodadas de pipetagem mecânica. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: Evite estresse excessivo e morte celular que podem ocorrer devido à pipetagem forçada ou ao uso de pipetas com abertura de ponta menor.
  4. Centrifugar as células (2 min, 290 x g, 20-25 °C) e eliminar cuidadosamente o sobrenadante. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione ~ 5-10 mL de meio ENC e ressuspenda as células completamente pipetando para cima e para baixo 1-2 vezes.
  5. Conte a concentração de células viáveis usando azul de tripano e um método de contagem de células, como um hemocitômetro.
    CUIDADO: O azul de tripano é suspeito de ser cancerígeno. Manuseie com cuidado, descarte adequadamente.
  6. Adicione volume suficiente de meio ENC com o objetivo de plaquear aproximadamente 300.000-400.000 células viáveis por cm2 de área de superfície a uma densidade de cerca de ~ 1.000.000 células por mL. Aspirar a solução de FN/laminina/PBS dos poços da placa.
    NOTA: Escolha o formato da placa de acordo com os ensaios planejados para as culturas EN, pois esta etapa marca a etapa final de replaqueamento do protocolo. Os progenitores dos neurônios entéricos podem ser congelados no dia 15. Depois de dissociar as esferas com solução de descolamento celular, ressuspenda os progenitores em aproximadamente 5 x 106 células / mL em meio de congelamento, como DMSO a 10% ou Stem-cellbanker. Quando necessário, descongele em meio ENC quente com inibidor de ROCK Y-27632 de 5 μM. Células de placa no formato de placa desejado. Substitua a mídia por ENC novo após algumas horas.
  7. Adicione suavemente as células nos poços revestidos de PO / FN / laminina. Evite que as bolhas fiquem presas sob a suspensão da célula, evitando que as células se fixem ao revestimento PO/FN/laminina, especialmente ao usar placas com tamanho de poço menor, como placas de 384 poços. Isso pode levar à morte celular.
  8. Alimente as células em dias alternados com meio ENC (200 μL porcm2 de área de superfície do poço) até o dia 30-40, após o qual reduza a frequência de alimentação (para uma ou duas vezes por semana), mas dobre o volume de alimentação (para 400 μL de meio porcm2 de área de superfície do poço).
    NOTA: Isso é importante, pois a remoção e adição excessivas de meios podem facilitar o desprendimento da cultura neuronal da superfície dos poços. Para evitar prospectivamente o descolamento, especialmente para culturas de longo prazo, suplemente ENC com FN (2 μg/mL) e laminina (2 μg/mL) uma vez por semana.

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Resultados

Este protocolo fornece um método para derivar crista neural entérica e neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas ( Figura 1A-B ). A geração de neurônios de alta qualidade depende de uma etapa eficiente de indução da crista neural entérica. Isso pode ser avaliado visualmente verificando a morfologia das esferas flutuantes que devem parecer redondas com superfícies lisas com um tamanho de aproximadamente 0,1 - 0,4 mm, como visto na

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Discussão

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método in vitro robusto para obter neurônios entéricos de hPSCs dentro de 30-40 dias (Figura 1E) e glia entérica expressando proteína glial fibrilar ácida, GFAP e SOX10 em culturas mais antigas (> dia 55) 13 , 14 , 19 , 22 . Esses neurônios e glia são induzidos pela diferenciação gradual de hPSCs em cél...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado por doações do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora e da Fundação Sandler, March of Dimes concessão nº 1-FY18-394 e 1DP2NS116769-01, o Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH (DP2NS116769) para F.F. e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (R01DK121169) para F.F., H.M. é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da Fundação Larry L. Hillblom, bolsa NIH T32-DK007418 e bolsa de pós-doutorado independente do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suplemento de ácido ascórbicoSigma-AldrichA5960
B27 (sem soro, sem vitamina A)Gibco12587-010
Matriz de membrana basal, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R& D systems314-BP
Centrífuga de cultura de célulasEppendorf, modelo nº 5810R02262501
Solução de desprendimento de células, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Tubos cônicosEUA científico1475-0511, 1500-1211
Meio de base de diferenciação, Essential 6Life TecnologiasA1516401
DMEM/F-12 sem glutaminaLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Meio de manutenção hPSC sem alimentador, Kit de meio flexível Essential 8Life TechnologiesA2858501
FGF2R& D systems233-FB/CF
FibronectinaCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocitômetroHausser Scientific1475
Células-tronco pluripotentes humanas, H9 ESCWiCellRRID: Incubadora CVCL_1240
com controle de umidade, temperatura e CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Microscópio invertidoThermo Fisher ScientificEVOS FL
Capa de fluxo laminarThermo Fisher Scientific1300 series classe II, tipo A2
LamininaCultrex3400-010
Suplemento de L-glutamina, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Placas multipoços, FalconBD353934, 353075
N-2 SuplementoCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (livre de Ca e Mg)Life Technologies10010023
Pipeta fillerEppendorfZ768715-1EA
Pontas de pipetaEUA científico1111-2830
PipetasFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
imagem de fundo de lamínula de polímero
RASigma-AldrichR2625
D systems1614
Mancha azul de tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Placas de fixação ultrabaixasFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dicloridratoR & D sistemas1254
PO Placas de Sigma-Aldrich P3655, ibidi ibidi 81156 SB431542 R&

Referências

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