Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.
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Artigo de método
Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) é uma microscopia abrangente que combina as informações de localização fornecidas pela microscopia de fluorescência (FM) e o contexto da ultraestrutura celular adquirida pela microscopia eletrônica (ME). CLEM é um trade-off entre fluorescência e ultraestrutura e, geralmente, a ultraestrutura compromete a fluorescência. Em comparação com outras resinas de incorporação hidrofílica, como metacrilato de glicidila, HM20 ou K4M, Epon é superior em propriedades de preservação e seccionamento de ultraestrutura. Anteriormente, demonstramos que o mEosEM pode sobreviver à fixação de tetróxido de ósmio e à incorporação de Epon. Usando o mEosEM, conseguimos, pela primeira vez, o Epon pós-incorporação CLEM, que mantém a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Aqui, fornecemos detalhes passo a passo sobre a preparação da amostra EM, a imagem FM, a imagem EM e o alinhamento da imagem. Também aprimoramos os procedimentos de identificação da mesma célula por imagem de FM durante a imagem de EM e detalhamos o registro entre as imagens de FM e EM. Acreditamos que se pode facilmente obter Epon pós-incorporação de microscopia correlativa de luz e eletrônica seguindo este novo protocolo em instalações tradicionais de EM.
Introdução
A microscopia de fluorescência (FM) pode ser usada para obter a localização e distribuição da proteína-alvo. No entanto, o contexto que envolve a proteína-alvo é perdido, o que é crucial para investigar a proteína alvo completamente. A microscopia eletrônica (ME) tem a mais alta resolução de imagem, fornecendo vários detalhes subcelulares. No entanto, a EM carece de rotulagem de alvo. Ao mesclar com precisão a imagem de fluorescência obtida por FM com a imagem cinza adquirida por EM, a microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) pode combinar as informações obtidas por esses dois modos de imagem 1,2,3,4.
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Protocolo
A criação de animais e os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Fujian Medical University Medical Center. O fluxo de trabalho passo a passo do protocolo atual é mostrado na Figura 1.
1. Preparação da amostra
- Cérebro de camundongo
- Compre camundongos transgênicos (veja Tabela de Materiais) e primers de oligonucleotídeos (veja Tabela de Materiais) para genotipar esses camundongos.
- Perfundir e remover o cérebro íntegro da abóbada craniana seguindo protocolo previamente publicado
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Resultados
Relatos anteriores demonstraram que o mScarlet pode atingir o lisossomo15. Neste protocolo, AAV expressando mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) foi injetado no M1 (ML: ±1,2 AP: +1,3 DV: -1,5) do cérebro de camundongos Vglut2-ires-cre usando instrumentos estereotáxicos. Seguindo o protocolo descrito acima, a imagem final correlacionada é mostrada na Figura 4A. A imagem FM pode ser alinhada com precisão com a imagem EM usando nanopartículas de our.......
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Discussão
O protocolo aqui apresentado é um método de imagem versátil, que pode combinar as informações de localização da proteína-alvo da microscopia de luz (LM) e o contexto em torno da proteína-alvo da microscopia eletrônica (ME)6. Com as limitações das proteínas fluorescentes atuais, o método amplamente utilizado é a pré-incorporação de microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM), o que significa que a imagem de LM é feita antes da preparação da amostra EM. Quase todas as proteínas fluorescentes .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este projeto foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32201235 a Zhifei Fu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2022J01287 a Zhifei Fu), a Fundação de Pesquisa para Talentos Avançados da Universidade Médica de Fujian, China (XRCZX2021013 a Zhifei Fu), a Fundação de Ciências Especiais de Finanças da Província de Fujian, China (22SCZZX002 a Zhifei Fu), Fundação do NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, e Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 para Zhifei Fu). Agradecemos a Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin e Yan Hu no Centro de Serviços de Tecnologia P....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 M Tampão de fosfato (PB) | NaH2PO4 < / sub>· 2H2O + Na2< / sub>HPO4 < / sub>· 12H2< / sub>O | ||
| 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldeído (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Produto químico perigoso |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetona | SCR | 10000418 | |
| hidróxido de amônio | J& K Scientific | 335213 | |
| Biofotômetro D30 | eppendorf | ||
| Tampão de limpeza de óculos | 50 mL Hidróxido de amônio, 50 mL Peróxido de hidrogênio, 250 mL H2O | ||
| Tampa de Vidro | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Químico perigoso |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Químico perigoso |
| Centrífuga de mesa | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Faca de diamante | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | Empresa SPI | GS02823 | Reagente de |
| transfecção de DNA | Thermo Fisher | 2696953 | Kit de Transfecção de Lipofectamina 3000 |
| Epon 812 | Empresa SPI | GS02659 | Químico perigoso |
| Etanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Solução fixadora | 4% PFA + 0,25% GA + 0,02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glicerol | SCR | 10010618 | |
| Nanopartículas de ouro | Corpuscular | 790120-010 | |
| Resina | Acetona para resina 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Ácido fluorídrico | SCR | 10011118 | |
| Peróxido de | hidrogênioSCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Câmara de imagem | Thermo Fisher | A7816 | |
| Cápsulas de gelatina grandes | Ciências de Microscopia Eletrônica | 70117 | |
| Tampão | Mowiol 4-88, Glicerol, 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| empresa NMA | SPI | GS02828 | Oligonucleotídeos químicos |
| perigosos Primers | Takara Biomedical Technology (Pequim) | Três oligonucleotídeos primers foram usados para detectar Vglut2-ires-Cre e tipo selvagem simultaneamente. Os primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, e 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, tiveram como objetivo detectar Vglut2-ires-Cre. Os primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, e 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, com o objetivo de detectar o tipo selvagem. | |
| Micrótomo oscilante | Leica | VT1000S | |
| Tetróxido de ósmio | SCR | L01210302 | Solução química perigosa |
| de OsO4 1 | % Tetróxido de ósmio + 1,5% K4Fe (CN)6· 3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldeído (PFA) | SCR | 80096618 | Químico perigoso |
| Tampão | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Piolofórmio | Sigma | 63148-65-2 | Químico perigoso |
| Poli-L-lisina | Sigma | 25986-63-0 | |
| Ferrocianeto de potássio (K4Fe (CN)6· 3H2O) | SCR | 10016818 | |
| lâminas de bisturi | Merck | S2771 | |
| Cabos de bisturi | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscópio | OLYMPUS | MVX10 | |
| Camundongos transgênicos | Laboratório | (cepa: 129S6/SvEvTac) foram alojados em condições padrão (25 ° C, um ciclo claro/escuro de 12 h, com água e comida administrados ad libitum. Camundongos machos e fêmeas foram usados em 2– 3 meses de idade, faixa de peso 20-30 g. | |
| Microscópio eletrônico de transmissão (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| Solução UA (2% UA) | Solução aquosa | ||
| Ultramicrótomo | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Acetato de uranilo (UA) | TED PELLA | 19481 | Produto químico perigoso |
Referências
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolu....
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Reimpressões e permissões
