Artigo de método

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

DOI:

10.3791/66169

⸱

5 de janeiro de 2024

 , 
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Condensados biomoleculares formados via separação de fase líquido-líquido (LLPS) têm sido considerados críticos na organização celular e em um número crescente de funções celulares. A caracterização da LLPS em células vivas também é importante porque a condensação aberrante tem sido associada a inúmeras doenças, incluindo cânceres e doenças neurodegenerativas. A LLPS é frequentemente impulsionada por interações seletivas, transitórias e multivalentes entre proteínas intrinsecamente desordenadas. De grande interesse são as dinâmicas de interação das proteínas participantes do LLPS, que são bem resumidas por medidas de seu tempo de residência de ligação (TR), ou seja, a quantidade de tempo que passam ligadas dentro dos condensados. Aqui, apresentamos um método baseado em imagens de célula única de célula viva que nos permite medir a RT média de uma proteína específica dentro de condensados. Visualizamos simultaneamente moléculas proteicas individuais e os condensados com os quais elas se associam, usamos rastreamento de partícula única (SPT) para traçar trajetórias de molécula única e, em seguida, ajustamos as trajetórias a um modelo de ligação proteína-gotícula para extrair o TR médio da proteína. Finalmente, mostramos resultados representativos onde este método de imagem de molécula única foi aplicado para comparar as médias de RTs de uma proteína em seus condensados de LLPS quando fundida e não fundida a um domínio oligomerizante. Este protocolo é amplamente aplicável para medir a dinâmica de interação de qualquer proteína que participa de LLPS.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um crescente corpo de trabalhos sugere que os condensados biomoleculares desempenham um papel importante na organização celular e em numerosas funções celulares, por exemplo, regulação transcricional 1,2,3,4,5, reparo de danos ao DNA 6,7,8, organização da cromatina 9,10,11,12, cromossomo X inativação 13,14,15 e sinalização intracelular 16,17,18. Além disso, a desregulação dos condensados biomoleculares está implicada em muitas doenças, incluindo cânceres 19,20,21 e doenças neurodegenerativas 22,23,24,25,26. A formação de condensado é frequentemente impulsionada por interações transitórias, seletivas e multivalentes proteína-proteína, proteína-ácido nucleico ou ácido nucleico-ácido nucleico27. Sob certas condições, essas interações podem levar à separação de fase líquido-líquido (LLPS), uma transição de densidade que enriquece localmente biomoléculas específicas em gotículas sem membrana. Tais interações multivalentes são frequentemente mediadas pelas regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) das proteínas 1,28,29. A caracterização biofísica dessas interações em nível molecular é crítica para a compreensão de inúmeras funções celulares saudáveis e aberrantes, dada a penetração de condensados através delas. Embora técnicas baseadas em microscopia confocal de fluorescência, por exemplo, recuperação de fluorescência após fotoclareamento (FRAP)30,31,32, tenham sido amplamente utilizadas para mostrar qualitativamente que as trocas moleculares entre condensados e o ambiente celular circundante são dinâmicas, quantificar a dinâmica de interação de biomoléculas específicas dentro de condensados geralmente não é possível usando microscopia confocal convencional ou molécula única microscopia sem métodos especializados de análise de dados. A técnica de rastreamento de partícula única (SPT) descrita neste protocolo é baseada em microscopia de célula única de célula viva33 e fornece uma ferramenta excepcionalmente poderosa para quantificar a dinâmica de interação entre proteínas específicas dentro de condensados. A leitura do TCP para tal medida é o tempo médio de residência de uma proteína de interesse nos condensados.

O protocolo pode ser dividido em duas partes - aquisição e análise de dados. O primeiro passo da aquisição de dados de imagem é expressar nas células uma proteína de interesse que é fusionada a um HaloTag34. Isso permite a marcação da proteína de interesse com dois fluoróforos, onde a maioria das moléculas de proteína deve ser marcada com um fluoróforo não fotoativável (por exemplo, ligante35 do Halo JFX549) e uma pequena fração delas deve ser marcada com um fluoróforo fotoativável espectralmente distinto (por exemplo, o ligante36 do Halo PA-JF646). Isso permite a aquisição simultânea de todos os locais de condensado na célula e a aquisição de filmes de molécula única da proteína de interesse ligando e desligando aos condensados. Enquanto isso, o mesmo tipo de células é modificado para expressar de forma estável H2B marcado com Halo, uma histona que é em grande parte imóvel na cromatina. As células são então coradas com o ligante PA-JF646 Halo para permitir a imagem de uma única molécula de H2B. Como será discutido em detalhes a seguir, este experimento explica a contribuição do fotoclareamento para permitir a quantificação precisa da dinâmica de interação da proteína de interesse. As células para experimentos de imagem devem então ser cultivadas em lamínulas limpas, coradas com ligantes(es) HaloTag e montadas em uma câmara de imagem de células vivas. A partir daí, a amostra é fotografada sob iluminação de folha óptica altamente inclinada e laminada (HILO) em um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) capaz de obter imagens de dois canais e detecção de molécula única. A emissão é então dividida em duas câmeras, uma rastreando posições de condensado e outra rastreando moléculas individuais. A aquisição é realizada com um longo tempo de integração (da ordem de centenas de ms) para borrar proteínas de difusão livre e capturar apenas proteínas que são menos móveis devido à ligação a estruturas estáveis na célula37.

O primeiro passo da análise dos dados é usar um algoritmo estabelecido de rastreamento de partícula única (SPT)38,39 para localizar moléculas de proteína individuais em cada quadro do filme e montar as localizações em uma trajetória para cada molécula ao longo de sua vida útil detectável. As trajetórias são então classificadas entre as que representam moléculas dentro e as que representam moléculas fora dos condensados, comparando-se as localizações das moléculas ao longo de suas trajetórias com as localizações de todos os condensados nos tempos correspondentes1.

Em seguida, uma curva de sobrevivência (1 - CDF) é gerada usando os comprimentos de todas as trajetórias no condensado. O tempo de residência médio aparente das moléculas é então extraído ajustando-se a curva de sobrevivência ao seguinte modelo exponencial de dois componentes de ligação às proteínas,

figure-introduction-1,

com A como a fração de moléculas não especificamente ligadas e com kobs,ns e kobs,s como as taxas de dissociação observadas das moléculas não especificamente ligadas e especificamente ligadas, respectivamente. Apenas kobs,s é considerado daqui em diante. A dinâmica de dissociação deproteínas, k true,s, e o fotoclareamento do fluoróforo, kpb, contribuem para kobs,s como

figure-introduction-2;

assim, para isolar os efeitos da dissociação proteica, a taxa de dissociação específica do H2B-Halo na linhagem celular mencionada anteriormente é medida.

figure-introduction-3

A H2B é uma proteína que se integra de forma estável à cromatina e que experimenta dissociação mínima na escala de tempo de aquisição de uma única molécula37. Sua taxa de dissociação específica é então igual à taxa de fotobranqueamento do ligante PA-JF646 Halo, ou

figure-introduction-4.

O tempo médio de residência em condensado da proteína de interesse, figure-introduction-5, é então

figure-introduction-6.

Resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40 são mostrados, onde esse protocolo foi aplicado para demonstrar que a fusão de um domínio de oligomerização ao IDR resulta em maior tempo de residência do IDR em seus condensados. Esse resultado sugere que o domínio de oligomerização adicionado estabiliza as interações homotípicas do IDR que impulsiona a LLPS. Em princípio, o mesmo método com protocolos ligeiramente modificados pode ser aplicado para caracterizar as interações homotípicas ou heterotípicas de qualquer proteína que participe da formação de quaisquer tipos de condensados.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Marcação de proteínas em células

  1. Expresse a proteína de interesse fusionada ao HaloTag na linhagem celular desejada.
  2. Expressam H2B marcados com Halo de forma estável no mesmo tipo de células que no 1.1 usando transposons ou transdução viral.

2. Preparação de lamínulas

  1. Antes de usar lamínulas para cultura celular, limpe as lamínulas para remover contaminantes autofluorescentes.
    1. Monte as tampas de 25 mm de diâmetro, #1,5 em um rack de coloração cerâmica e coloque em um recipiente de polipropileno.
    2. Mergulhe completamente as lamínulas em uma solução de 1 M de KOH e sonicate por 1 h.
    3. Enxágue três vezes com água bidestilada (ddH2O).
    4. Mergulhe completamente as lamínulas em etanol 100% e sonicate por 1 h.
    5. Mergulhe completamente as lamínulas em etanol a 20% diluído com ddH2O e guarde a 4 °C até à utilização.

3. Preparação das células para microscopia

NOTA: Execute as etapas desta seção em um gabinete de biossegurança para evitar a contaminação das células.

  1. Células de placa em lamínulas limpas. Realizar 2 dias antes da aquisição de imagens se a proteína marcada com Halo for expressa transitoriamente. Realizar 1 dia antes da aquisição de imagens se a proteína marcada com Halo estiver expressa de forma estável ou endógena.
    1. Use pinças estéreis para colocar lamínulas em uma placa de 6 poços (uma lamínula/poço por amostra de célula) e permitir que o etanol residual evapore.
    2. Placa cada poço com um número adequado de células para atingir 70% de confluência no momento da imagem. Placa um poço adicional com células expressando H2B-Halo de forma estável com a mesma confluência alvo.
    3. Siga este passo somente se expressar transitoriamente a proteína marcada com Halo de interesse. Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% CO2. Em seguida, transfectar as células com o plasmídeo que codifica a proteína marcada de interesse usando reagentes de transfecção apropriados e seguindo as diretrizes do fabricante.
    4. Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% CO2.
  2. Colorir as células que expressam a proteína marcada com Halo de interesse com um ligante Halo não fotoativável (por exemplo, JFX549) e um ligante Halo fotoativável (por exemplo, PA-JF646). Células corais expressando H2B-Halo apenas com o ligante Halo fotoativável.
    NOTA: As concentrações dos ligantes Halo listados aqui devem ser usadas como ponto de partida; A concentração ótima dependerá do nível de expressão e da concentração local em condensado da proteína de interesse.
    1. Para cada amostra celular que expresse a proteína marcada com Halo de interesse, diluir 100 nM JFX549 Halo ligante35 e 20 nM PA-JF646 Halo ligante36 em 500 μL de meio celular apropriado. Para cada amostra que expresse H2B-Halo, diluir apenas 20 nM PA-JF646 Halo ligante em 500 μL de meio celular apropriado.
    2. Para cada poço, aspirar o meio existente, adicionar 2 mL de 1x PBS, em seguida, aspirar PBS (isso é referido como um "enxágue" para o restante do protocolo) e substituir por meios contendo os ligantes Halo apropriados.
    3. Incubar durante 1 h a 37 °C e 5% CO2.
    4. Enxágue com PBS quatro vezes e substitua por meios frescos que não contenham ligantes Halo.
    5. Incubar durante 15 min a 37 °C e 5% CO2.
    6. Repetir os passos 3.2.4 e 3.2.5 três vezes (quatro ciclos de incubação de lavagem no total).
    7. Use pinças estéreis para transferir a lamínula com células para uma câmara de lamínula de cultura celular compatível com o estágio do microscópio.
    8. Adicione o meio livre de fenol vermelho à câmara e prossiga para a obtenção de imagens. Incubar as amostras que não estão imediatamente a ser fotografadas a 37 °C e 5% de CO2 até que seja necessário.

4. Imagem de molécula única

NOTA: Experimentos independentes medindo os tempos de residência do H2B e da proteína de interesse devem ser conduzidos ao longo de vários (≥3) dias para gerar resultados estatisticamente significativos. Antes de obter imagens de amostras de células no microscópio, alinhe as duas câmeras usando microesferas coradas com 0,1 μm (Tabela de Materiais) ou um padrão de calibração semelhante.

  1. Prepare o microscópio.
    1. Ligue o microscópio e o computador que controla o microscópio.
    2. Ligue os componentes de incubação de células vivas (aquecedor e CO2) no microscópio e ajuste para 37 °C e 5% CO2. Permita que o sistema se equilibre.
    3. Coloque uma gota do óleo apropriado em uma objetiva de imersão de óleo TIRF de 100x no microscópio e carregue a amostra de célula no estágio do microscópio.
  2. Identificar uma célula para imagem.
    1. Fotografe a amostra de células sob iluminação de campo brilhante e ajuste a posição z até que as células estejam em foco.
    2. Identificar uma célula que apresenta características morfológicas de células saudáveis.
    3. Recorte o campo de visão (FOV) para que ele capture apenas o núcleo da célula alvo.
    4. Use iluminação a laser e ajuste o ângulo TIRF até que a iluminação HILO41 com ótima relação sinal-ruído de moléculas individuais seja alcançada.
  3. Imagem H2B-Halo em células vivas.
    NOTA: As potências do laser usadas nesta seção são específicas para este experimento e incluídas como exemplo. Potências apropriadas do laser devem ser escolhidas de acordo com os critérios listados na discussão.
    1. Configure uma configuração de aquisição da seguinte maneira. Defina o tempo de exposição como 500 ms. Durante cada exposição de 500 ms, excite as moléculas de H2B-Halo marcadas com PA-JF646 com um feixe de 9,1 mW e 640 nm. Durante o tempo morto entre os quadros (158,01 μs no sistema de imagem usado aqui), fotoative as moléculas com um feixe de 111 μW, 405 nm.
    2. Capture 2000 quadros continuamente nessas configurações. Aumentar gradualmente a potência do feixe de 405 nm ao longo da aquisição quando o número de moléculas fotoativadas se tornar insuficiente.
  4. Imagem da proteína marcada com Halo de interesse em células vivas.
    1. Use um espelho dicroico de passagem longa para dividir comprimentos de onda de emissão entre duas câmeras, uma para detectar PA-JF646 e outra para detectar JFX549. Use filtros de emissão apropriados na frente das câmeras.
    2. Use a mesma configuração de aquisição descrita em 4.3.1 com a seguinte modificação. Adicione um canal JFX549 adicional para rastrear locais dos condensados de proteína marcados com Halo ao longo do tempo. A cada 10 s, adquira um quadro (500 ms, 2,1 mW, excitação de 561 nm) no canal JFX549, mantendo a aquisição do canal PA-JF646. Isso causará sangria no canal PA-JF646, que será atendido na análise de dados pós-aquisição.
    3. Capture 2000 quadros continuamente nessas configurações. Aumentar gradualmente a potência do feixe de 405 nm ao longo da aquisição quando o número de moléculas fotoativadas se tornar insuficiente.

5. Análise de dados de imagem de molécula única

NOTA: Os parâmetros usados ao longo da seção 5 são específicos para este experimento e incluídos como exemplo. Os parâmetros apropriados devem ser escolhidos de acordo com os critérios listados na discussão.

  1. Preparar dados brutos de imagem para processamento.
    1. Para os dados da proteína de interesse, converta cada canal do arquivo de dados de imagem bruto em um arquivo de .tif independente usando ImageJ ou software de processamento de imagem semelhante. Para os dados do H2B, converta o canal único do arquivo de dados de imagem bruta em um arquivo .tif da mesma maneira.
      NOTA: Dependendo do software de aquisição que está sendo usado, pode haver quadros vazios no filme de condensado, pois apenas um quadro de rastreamento de condensado é obtido a cada 10 s. Os quadros vazios devem ser preenchidos com o quadro de condensado mais recente (algum software de aquisição faz isso automaticamente). Além disso, se houver sangria significativa do canal de condensado (JFX549) para o canal de molécula única (PA-JF646) durante esses quadros de rastreamento de condensado, os quadros de molécula única correspondentes devem ser substituídos pelo quadro de molécula única mais recente.
    2. Se houver algum quadro que precise ser substituído em qualquer filme devido aos motivos acima, substitua-o pelo quadro mais recente desse filme modificando (se necessário) e executando pretracking_comb.txt, uma macro ImageJ disponível em Chong et al.1 e seguindo os prompts.
  2. Gere trajetórias de partícula única usando um software SPT, por exemplo, SLIMfast39, uma implementação GUI do algoritmo MTT38 disponível em Teves et al.42.
    1. Carregue o arquivo da versão 5.1.2 que contém o filme de molécula única no SLIMfast clicando em Load > Imagestack.
    2. Defina os parâmetros (taxa de erro de localização: 10-6; loops de deflação: 3) para localização clicando em OPT > Sheet: Localization.
    3. Definir os parâmetros (pico de emissão: 664 nm; lag time: 500 ms) para aquisição clicando em OPT > Sheet: Acquisition.
    4. Visualize as localizações de todas as moléculas em um único quadro para garantir que os parâmetros escolhidos sejam apropriados (TEST LOC). Se não for adequado, modifique os parâmetros nos passos 5.2.2 e 5.2.3 e repita este passo.
    5. Gere um arquivo contendo as localizações de todas as moléculas em cada quadro (LOC ALL).
    6. Carregue o arquivo da versão 5.2.5 no SLIMfast clicando em Carregar dados de partículas > > SLIMfast.
    7. Definir os parâmetros (coeficiente de difusão máximo esperado: 0,1 μm2/s; número máximo de concorrentes: 5) para geração de trajetória clicando em OPT > Sheet: Tracking.
    8. Gere um arquivo contendo as trajetórias de todas as moléculas (GEN TRAJ).
  3. Filtrar as trajetórias menores que tmin, 2,5 s, usando o evalSPT39, disponível em Drosopoulos et al.43, para explicar erros de rastreamento que resultam em trajetórias artificialmente curtas.
    1. Carregue o arquivo da 5.2.8 no evalSPT (+ > arquivo da 5.2.8 > OK).
    2. Defina os parâmetros (min: 5 quadros; max: comprimento máximo da trajetória para o arquivo a partir de 5.2.8) para filtrar as trajetórias menores que 2,5 s.
    3. Gere um arquivo com todas as trajetórias filtradas (EXPORT DATA).
  4. Siga este passo apenas para as trajetórias da proteína de interesse. Classifique as trajetórias entre as que estão nos condensados e fora dos condensados e, em seguida, extraia o tempo médio de residência no condensado.
    NOTA: Todos os códigos para esta seção estão disponíveis em Chong et al.1.
    1. Limite todos os quadros do filme adquiridos no canal JFX549 para gerar um filme de lapso de tempo preenchido com a máscara binária de evolução temporal realçando locais de condensado executando a macro, o núcleo e o cluster do ImageJ mask_v2.txt e seguindo os prompts.
    2. Reformatar as trajetórias de molécula única geradas no item 5.3.3. usando o script MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, e ajustando os nomes de arquivo, caminhos e parâmetros conforme necessário. (Parâmetros: Exposição, 0,5 s; Resolução, 0,16 μm/pixel).
    3. Classifique trajetórias com base na fração do tempo de vida que uma determinada molécula passa em um condensado, F, usando o script MATLAB, categorization_v4.m, e ajustando os nomes de arquivos e caminhos conforme necessário.
    4. Prossiga usando apenas trajetórias em condensado.
  5. Extrair kobs,s e kpb e calcular o tempo médio de residência corrigido, figure-protocol-1.
    1. Extraia kobs,s da proteína in-condensada das trajetórias de interesse usando o script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e ajustando nomes de arquivos, caminhos e parâmetros conforme necessário.
      (Parâmetros: Exposição, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 quadros).
    2. Extraia kpb das trajetórias H2B usando o script MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, e ajustando nomes de arquivos, caminhos e parâmetros conforme necessário.
      (Parâmetros: Exposição, 0,5 s; StartFrameForFit, 5 quadros).
    3. Calcular o tempo médio de residência corrigido da proteína de interesse especificamente ligada aos seus condensados, figure-protocol-2como ,
      figure-protocol-3
      NOTA: Controles devem ser realizados para verificar se diferentes tempos de exposição que são longos o suficiente para borrar partículas móveis, por exemplo, 300 ms e 800 ms, ainda resultam no mesmo tempo médio de residência da proteína de interesse.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40, onde utilizamos este protocolo de TCP para comparar a dinâmica de interação de duas proteínas em seus respectivos condensados de LLPS auto-montados. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contém um IDR que pode sofrer LLPS após superexpressão em células humanas. Nós hipotetizamos que a fusão de TAF15(IDR) com FTH1 (ferritin heavy chain 1), que forma um oligômero de 24 subunidades, levaria a interações homotípicas homotípicas-proteicas mais estáveis que conduzem LLPS. Para testar essa hipótese, expressamos transitoriamente em células U2OS a fusão Halo-TAF15(IDR) ou TAF15(IDR)-Halo-FTH1 e realizamos imagens bicolores de molécula única de cada proteína seguindo o protocolo acima. Um quadro representativo de um filme TAF15(IDR)-Halo-FTH1 é mostrado na Figura 1A. As moléculas detectadas no canal PA-JF646 foram localizadas, e essas localizações foram reunidas em trajetórias. As trajetórias resultantes foram então classificadas entre populações dentro e fora de condensado por comparação com uma máscara binária destacando locais de condensado (Figura 1B). Embora mostremos apenas uma pequena fração das trajetórias para uma boa visibilidade, há uma clara distinção entre as trajetórias das moléculas ligadas aos condensados e ligadas fora dos condensados. Em seguida, uma curva de sobrevivência dos comprimentos da trajetória no condensado foi ajustada contra o modelo exponencial de dois componentes (Figura 1C). Finalmente, os tempos médios de residência após a correção para fotoclareamento foram extraídos e plotados para ambas as proteínas (Figura 1D). Observamos que o tempo médio de residência do Halo-TAF15(IDR) em seus condensados de LLPS foi de 10,23 s ± 1,10 s, enquanto o de TAF15(IDR)-Halo-FTH1 foi de 64,15 s ± 11,65 s. Este resultado sugere que a adição do domínio oligomerizante ao TAF15(IDR) de fato estabiliza a ligação proteína-condensado.

figure-results-1
Figura 1: Método baseado em TCP resolve diferenças nos tempos de residência das proteínas em seus condensados. Não. Quadros representativos de um filme bicolor de molécula única de TAF15(IDR)-Halo-FTH1. As proteínas foram marcadas com uma combinação de uma maior concentração de corante não fotoativável (100 nM JFX549, amarelo) para visualizar a localização dos condensados, e uma menor concentração de corante fotoativável (20 nM PA-JF646, magenta) para visualizar proteínas individuais, permitindo a SPT. Filmes sob as mesmas condições de imagem foram adquiridos para Halo-TAF15(IDR) e filmes monocanal, PA-JF646 foram adquiridos para H2B-Halo. Uma linha tracejada branca delineia o núcleo. B. Imagem mesclada representativa sobrepondo uma máscara binária de posição de condensado (cinza) e trajetórias (multicoloridas). C. Curva de sobrevida representativa do TAF15(IDR)-Halo-FTH1 ajustada ao modelo exponencial de dois componentes. D. O tempo médio de residência do Halo-TAF15 em foi significativamente menor do que o do TAF15(IDR)-Halo-FTH1 em seus respectivos condensados. O valor de cada proteína foi medido a partir de 20 células medidas em experimentos independentes realizados ao longo de três dias. O erro foi propagado como erro padrão da média e o asterisco representa diferença significativa no tempo de residência das duas proteínas (p<0,05, teste da soma de postos de Wilcoxon). Esse número foi adaptado com permissão de Irgen-Gioro et al.40. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo aqui apresentado é projetado para sistemas como os investigados em Irgen-Gioro et al.40. Dependendo da aplicação, alguns componentes do protocolo podem ser modificados, por exemplo, o método de geração de linhagens celulares marcadas fluorescentemente, o sistema de marcação fluorescente e o estilo de lamínula usado. A marcação de uma proteína em uma célula pode ser feita usando duas estratégias, dependendo de qual é mais adequada para um determinado experimento. 1) Expressão exógena: fundir a proteína de interesse a um HaloTag e expressar a fusão em uma linhagem celular alvo transitoriamente usando transfecção ou estavelmente usando transposons ou transdução viral. 2) Edição do genoma: bater em um HaloTag no locus gênico que codifica a proteína endógena de interesse em uma linhagem celular alvo usando técnicas de edição do genoma, por exemplo, CRISPR44. Os benefícios e desvantagens de cada um são discutidos em outra publicação45, mas resumidamente, a estratégia de expressão exógena é menos demorada, mas produz uma população de células com uma ampla gama de níveis de expressão que muitas vezes não são fisiológicos. A estratégia de edição do genoma leva muito mais tempo, mas os rótulos endogenamente expressam proteínas de interesse em seus níveis de expressão nativa.

Além disso, este protocolo não requer especificamente o uso de um HaloTag; em vez disso, é compatível com qualquer tag que permita a marcação simultânea de uma única molécula e conjunto da mesma proteína na célula. Assim, o protocolo pode ser modificado para uso com outras tags de auto-rotulagem, como SNAP-tag46. Finalmente, pratos comerciais pré-limpos com fundo de vidro para cultura celular, como placas MatTek (MatTek Life Sciences, P35G-1.5-20-C), podem ser usados em vez de câmaras de deslizamento de cobertura, desde que sejam compatíveis com a objetiva do microscópio e o óleo de imersão; no entanto, as lamínulas podem ser limpas mais cuidadosamente imediatamente antes do uso, portanto, são preferíveis.

Embora as modificações acima no protocolo sejam opcionais, existem parâmetros experimentais e de análise que devem ser otimizados, a saber, as concentrações dos ligantes HaloTag, as potências do laser, os parâmetros de localização e rastreamento, e tmin. A concentração do ligante HaloTag não fotoativável deve ser escolhida de tal forma que o condensado seja marcado densamente o suficiente para permitir a geração de máscaras. A concentração do ligante fotoativável HaloTag e a potência do laser de fotoativação devem ser escolhidas de forma que as moléculas proteicas sejam marcadas e fotoativadas esparsamente o suficiente para gerar trajetórias de partícula única de qualidade, pois um excesso de localizações em cada quadro resultará em geração de trajetória imprecisa. Para os experimentos mostrados nos resultados representativos, geralmente houve menos de cinco localizações por quadro. A potência do laser de excitação deve ser mantida baixa o suficiente para minimizar o fotoclareamento rápido, mas alta o suficiente para localizar moléculas individuais com precisão. Os parâmetros de localização e rastreamento de uma única molécula devem ser ajustados dependendo da densidade de excitações e da dinâmica de difusão esperada da proteína de interesse. Finalmente, os valores de figure-discussion-1 devem ser calculados em um intervalo de tmin (começando de 0 s e aumentando em incrementos de tempo de exposição). Os valores de devem convergir acima de figure-discussion-2 algum limiar de tmin, este tmin deve ser usado no passo 5.3.

O método aqui descrito quantifica a dinâmica de interação de proteínas dentro de condensados com uma precisão inacessível às técnicas convencionais. Além disso, pode fazê-lo em células vivas com mínima perturbação da amostra. Isso é crítico, pois os comportamentos de interação dos IDRs, incluindo sua formação de condensado, são altamente dependentes de seu ambiente local40.

Os resultados representativos de Irgen-Gioro et al.40 demonstram a capacidade desse método de extrair tempos de residência para proteínas que se ligam a seus condensados de LLPS auto-montados. É importante ressaltar que este método pode ser facilmente expandido para qualquer ligação de proteínas a qualquer tipo de condensado através de interações homotípicas ou heterotípicas. Além disso, não se limita a medir a dinâmica de interação de proteínas submetidas à LLPS. A oncoproteína de fusão EWS::FLI1, conhecida por causar o sarcoma de Ewing, demonstrou formar hubs locais de alta concentração que desempenham um papel essencial em suas funções de ativação transcricional e transformação oncogênica 1,2. Embora a formação desses hubs seja impulsionada por interações IDR-IDR transitórias, seletivas e multivalentes de EWS::FLI1, até o momento, ainda não há evidências convincentes de que sejam condensados LLPS de boa-fé 1,2. Mesmo assim, usamos o método aqui apresentado para medir o tempo médio de residência de EWS::FLI1 em seus hubs e mostramos que a mutação de resíduos específicos e a exclusão de seu IDR desestabilizaram significativamente a ligação de EWS::FLI1 a seus hubs1.

Apesar da versatilidade deste método em caracterizar a dinâmica de ligação de proteínas dentro de condensados, deve-se ter cautela ao escolher o modelo de ligação a proteínas em contextos específicos. Os dados bioquímicos existentes suportam a ideia de que uma distribuição exponencial de dois componentes é frequentemente um modelo apropriado para muitos sistemas 1,37,40,42, mas a mesma distribuição também tem se mostrado uma representação inadequada da ligação de proteínas em outros sistemas onde modelos alternativos como exponencial de três componentes 47,48,49 e distribuições de lei de potência 50 correspondem melhor às observações experimentais. Para evitar tirar conclusões imprecisas, deve-se escolher e motivar cuidadosamente um modelo, verificar se a qualidade do ajuste suporta o uso do modelo e interpretar criteriosamente os resultados.

Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o Grant No. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Bolsa Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. também é apoiado pelo NIH/NCI sob o número de prêmio P30CA016042.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1 µ m TetraSpeck microesferaInvitrogenT7279Imagem de molécula única
25 mm de diâmetro, #1.5 LamínulasMarienfeld Superior111650Preparação de lamínulas
Filtro passa-banda de 593/40 nmSemrockFF01-593/40-25Imagem de molécula única
Filtro passa-banda de 676/37 nmSemrockFF01-676/37-25Imagem de molécula única
de 6 poços TC PlateGenesee25-105MPPreparação de células para microscopia
Linha celular: U-2 OSATCCHTB-96Marcação de proteínas em células
ConvertASCII_SlowTracking_css3
.m		Análise de dados de imagem de molécula única: Disponível em Chong et al., 2018
Coverglass Staining RackThomas24957Preparação de lamínulas
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)Janelia Research CampusPreparação de células para microscopia
DMEM, Low GlucoseGibco10-567-022Marcação de proteínas em células: Meios de crescimento utilizados: DMEM com 5% de soro fetal bovino, 1% de penstrep
Eclipse Ti2-E Microscópio InvertidoNikonImagem de molécula única
Etanol 200Proof Lab AlleyEAP200-1GALPreparação de lamínulas
evalSPTAnálise de dados de imagem de molécula única: Disponível em Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine SerumCytivaSH30396.03Marcação de proteínas em células: Meios de crescimento utilizados: DMEM com soro fetal bovino a 5%, 1% de penstrep
FijiAnálise de dados de imagem de molécula única
Ikon Ultra CCD CameraAndorX-13723Imagem de molécula única
Divisor de feixe dicróico LongpassSemrockDi02-R635-25x36Imagem de molécula única: Divisor de feixe vermelho/vermelho distante
Unidade de laser LUN-FNikonImagem de molécula única: 405/488/561/640
Prato de fundo de vidro MatTekMatTekP35G-1.5-20-CPreparação de células para microscopia: 35 mm, prato de lamínula #1.5 para cultura de células.
NIS-ElementsNikonImagem de molécula única: Software de aquisição de microscópio
núcleo e cluster mask_v2.txtAnálise de dados de imagem de molécula única: Disponível em Chong et al., 2018
Penicilina-EstreptomicinaGibco15-140-122Marcação de proteínas em células: Meios de crescimento usados: DMEM com 5% de soro bovino fetal, 1% de solução
salinatamponada com fosfatoThermo Fisher Scientific18912014Marcação de proteínas em células
Fotoativável Janelia Fluor 646 (PA-JF646)Janelia Research CampusPreparação de células para microscopia
PLOT_ResidenceHist_css.mAnálise de dados de imagem de molécula única: Disponível em Chong et al., 2018
Hidróxido de potássioMallinckrodt Chemicals6984-06Preparação de lamínulas
pretracking_comb.txtAnálise de dados de imagem de molécula única: Disponível em Chong et al., 2018
SLIMfastAnálise de dados de imagem de molécula única: Disponível em Teves et al., 2016
Sistema de incubação de topo de estágioTokai HitImagem de molécula única: Para imagem de células vivas
Divisor de imagem de emissão dupla TwinCamCairn ResearchLimpador
ultrassônicoBranson5800Preparação de lamínulas
de imagem de molécula única

Referências

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