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Efeito antagônico de Jiawei Shengjiang San em um modelo de nefropatia diabética em ratos: relacionado à via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1

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DOI:

10.3791/66179

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10 de maio de 2024

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1Graduate School, Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Hebei University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a farmacologia da rede e as técnicas de docking molecular para explorar o mecanismo de ação do Jiawei Shengjiang San (JWSJS) no tratamento da nefropatia diabética.

Resumo

Nosso objetivo foi aprofundar os mecanismos subjacentes à ação de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) no tratamento da nefropatia diabética e na implantação da farmacologia em rede. Empregando farmacologia de rede e técnicas de docking molecular, previmos os componentes ativos e alvos do JWSJS e construímos uma rede meticulosa de "medicamento-componente-alvo". As análises de enriquecimento da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG) foram utilizadas para discernir as vias terapêuticas e os alvos do JWSJS. O Autodock Vina 1.2.0 foi implantado para verificação de docking molecular, e uma simulação de dinâmica molecular de 100 ns foi conduzida para confirmar os resultados do docking, seguida de verificação in vivo em animais. Os resultados revelaram que o JWSJS compartilhava 227 alvos que se cruzavam com a nefropatia diabética, construindo uma topologia de rede de interação proteína-proteína. A análise de enriquecimento de KEGG denotou que o JWSJS mitiga a nefropatia diabética modulando lipídios e aterosclerose, a via de sinalização PI3K-Akt, apoptose e a via de sinalização HIF-1, com proteína quinase 1 ativada por mitógeno (MAPK1), MAPK3, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e serina/treonina-proteína quinase 1 (AKT1) identificados como alvos coletivos de múltiplas vias. O docking molecular afirmou que os principais componentes do JWSJS (quercetina, ácido palmitoleico e luteolina) poderiam estabilizar a conformação com três alvos principais (MAPK1, MAPK3 e EGFR) por meio de ligações de hidrogênio. Exames in vivo indicaram aumento notável no peso corporal e reduções nos níveis de proteína sérica glicada (GSP), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), trifosfato de uridina (UTP) e glicemia de jejum (FBG) devido à JWSJS. A microscopia eletrônica acoplada à coloração de hematoxilina e eosina (HE) e ácido periódico-Schiff (PAS) destacou o potencial de cada grupo de tratamento em aliviar danos renais em diversas extensões, exibindo declínios variados em p-EGFR, p-MAPK3 / 1 e BAX, e incrementos na expressão de BCL-2 nos tecidos renais dos ratos tratados. Conclusivamente, esses insights sugerem que a eficácia protetora da JWSJS na nefropatia diabética pode estar associada à supressão da ativação da via de sinalização EGFR/MAPK3/1 e ao alívio da apoptose das células renais.

Introdução

O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica que acomete múltiplos sistemas e pode causar diversas complicações devido à hiperglicemia contínua, como nefropatia diabética (ND), retinopatia e neuropatia1. A ND é uma complicação grave do DM, sendo responsável por cerca de 30% a 50% da doença renal terminal (DRT)2. Sua manifestação clínica é a microalbuminúria, que pode evoluir para DRCT caracterizada por aumento do volume glomerular, hiperplasia estromal mesangial e espessamento da membrana basal glomerular3. A patogênese da ND é complexa e não foi totalmente elucidada. Métodos clínicos, como redução da glicose no sangue, regulação da pressão arterial e redução da proteinúria, são usados principalmente para retardar seu progresso, mas o efeito é geral.

Atualmente, nenhum medicamento específico foi encontrado para tratar o DN4. Durante séculos, no entanto, os fitoterápicos chineses têm sido amplamente utilizados no tratamento do DM e suas complicações5 e melhoraram os sintomas clínicos dos pacientes e retardaram a progressão da doença. Devido às vantagens dos efeitos multicomponentes, multialvos e multivias, espera-se que os fitoterápicos chineses sejam uma fonte inovadora de medicamentos para o tratamento do DN6.

"Shengjiang san" originou-se do "Wanbing Huichun" pelo médico da Dinastia Ming Gong Tingxian. O livro "Neifu Xianfang" descreve o uso de Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhisoma e Radix Rhei et Rhizome. Com base nisso, depois de adicionar Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba e Smilacis Glabrae Rhixoma, exerce a função de shengjiang san de aumentar a lucidez, diminuir a turbidez, liberar o "calor" estagnado e harmonizar o "qi" e o sangue 7,8. Também aumenta o efeito de fortalecer o baço e tonificar os rins. Sua eficácia é consistente com a patogênese do "qi" do DN para subir e descer fora de ordem devido à deficiência de "energia vital", secura excessiva e "calor" e estagnação do "calor" causada por um energizador triplo 7,8.

Estudos clínicos anteriores mostraram que medicamentos fitoterápicos chineses têm sido usados para tratar o DM e suas complicações, e o jiawei shengjiang san (JWSJS) demonstrou regular a glicose no sangue e os lipídios, reduzir a proteinúria e melhorar significativamente a eficácia clínica de pacientes com ND precoce7. A capacidade do JWSJS de reduzir os níveis de proteína urinária e glicose no sangue em ratos com ND foi confirmada por estudos anteriores. Isso provavelmente ocorre inibindo as vias de sinalização TXNIP/NLRP3 e RIP1/RIP3/MLKL, reduzindo a piroptose de podócitos e prevenindo a apoptose necrótica em tecidos renais de ratos com ND, alcançando assim proteção renal9. A JWSJS pode regular positivamente a expressão da nefrina e da proteína podocina e reduzir a lesão de podócitos em ratos com DN, sugerindo assim que a JWSJS tem um efeito inibitório na lesão de podócitos. O JWSJS tem um certo efeito anti-DN com bons perfis de segurança, mas há pouca pesquisa sobre isso, e este trabalho se concentra principalmente na piroptose e na apoptose necrótica. A literatura não é suficientemente profunda ou sistemática10. Nossos achados anteriores confirmaram que a JWSJS pode reduzir a proteinúria e aliviar os danos renais em ratos com ND7. No entanto, existem poucos estudos sobre o mecanismo da JWSJS para o tratamento da ND, e estes carecem de profundidade e sistematização. Assim, este estudo tem como objetivo analisar as substâncias moleculares e os mecanismos de ação da JWSJS para o tratamento da ND usando farmacologia em rede e fornecer uma base sólida para pesquisas futuras.

A farmacologia de rede é um método emergente para estudar o mecanismo de ação de drogas, incluindo quimioinformática, biologia de rede, bioinformática e farmacologia11,12. O projeto de pesquisa em farmacologia de rede é bastante semelhante ao conceito holístico da medicina tradicional chinesa13,14 e é um método importante para estudar o mecanismo dos medicamentos fitoterápicos chineses. O docking molecular pode estudar as interações entre moléculas e prever seus padrões de ligação e afinidade. O docking molecular emergiu como uma técnica crítica no campo da pesquisa de medicamentos auxiliada por computador15. Portanto, este estudo construiu uma rede de interação JWSJS-DN-alvo por meio de farmacologia de rede e métodos de docking molecular que oferece uma base confiável e teórica para uma exploração mais aprofundada do tratamento de DN com JWSJS.

Protocolo

Todos os animais foram mantidos e utilizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório,8ª Edição, e foram relatados conforme recomendado nas diretrizes ARRIVE16,17. O estudo foi conduzido de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa da China para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Hebei (DWLL2019030).

1. Ingredientes ativos JWSJS e coleta de alvos

  1. Insira a composição medicinal JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rizoma e Curcumaelongae Rhizoma) no banco de dados de farmacologia de sistemas de medicina tradicional chinesa e banco de dados da plataforma de análise (TCMSP)18 para recuperar todos os componentes químicos.  De acordo com a absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME), a biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e as propriedades semelhantes a drogas (DL) ≥ 0,18 ingredientes químicos 19,20.
  2. Use o banco de dados TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, Versão. 2.3) para recuperar os alvos correspondentes de ingredientes químicos.
  3. Obtenha os ingredientes ativos de Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum pesquisando nos bancos de dados de Medicina Tradicional Chinesa e Composição Química21.
  4. Para credibilidade experimental, selecione compostos com números de serviço de resumos químicos (CAS) para este estudo. Em seguida, baixe diagramas de estrutura 2D (formato .sdf) de ingredientes ativos do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, atualizado em 2021)22.
  5. Use o SwissADME (www.swissadme.ch, atualizado em 2021)23para rastrear os componentes com alta absorção gastrointestinal (GI) como similaridade de medicamentos (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) cujos ≥ 2 itens foram 'Sim'. Isso levou aos componentes ativos de Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum.
  6. Importe-os para o banco de dados TCMSP para previsão de proteína-alvo (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Versão. 2.3)18.
  7. Padronizar os alvos no banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org, atualizado em 2021) com o status definido como Revisado e as espécies definidas como Humano24.

2. Coleta de alvos correspondente ao DN

  1. Pesquise nefropatia diabética por meio de GeneCards (https://www.genecards.org/, versão 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, atualizado em 2021)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, atualizado em 2021)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, atualizado em 2021)28 e bancos de dados DrugBank (https://www.drugbank.ca/, atualizado em 2021)29. Obtenha os destinos do DN após a combinação e a eliminação da duplicação.
  2. Triagem de alvos comuns de JWSJS e DN e construção de rede
    1. Filtre os alvos comuns de JWSJS e DN usando o software R 4.2.0 e desenhe diagramas de Venn. Importe os ingredientes ativos e os alvos potenciais do JWSJS para o software Cytoscape3.8.0 30 para criar um diagrama de rede Medicamento-Ingrediente-Alvo que visualize a conexão entre medicamentos, ingredientes, alvos e doenças.
    2. Deixe o tamanho do nó refletir o tamanho do valor do grau, onde um valor de grau mais alto indica que o nó é mais importante na rede.
  3. Construção de rede de interação proteína-proteína PPI e triagem de alvos centrais
    1. Analise os genes que se cruzam usando a plataforma online STRING (Versão: 11.5) para construir uma rede de interação proteína-proteína (PPI)31. Construa a rede usando um modo de análise de proteínas múltiplas , defina a espécie como Homo sapiens e defina a pontuação mínima de interação necessária para >0,930.
    2. Use o Cytoscape 3.8.0 para analisar a rede topologicamente, calcular a centralidade de intermediação (BC), centralidade de proximidade (CC), centralidade de grau (DC), centralidade de autovetor (EC), método baseado em conectividade média local (LAC) e valores de centralidade de rede (NC) para cada nó e filtrar os seis nós com todos os valores maiores que a mediana32. Repita esse processo várias vezes para identificar os principais alvos do JWSJS para a terapia de ND.
  4. Análises funcionais GO e análise de enriquecimento da via KEGG
    1. Realize análises de enriquecimento GO e KEGG para identificar os processos biológicos, funções moleculares, componentes celulares e vias associadas aos alvos comuns de JWSJS e DN.
    2. Use a organização. Hs.eg.db pacote para obter as IDs dos destinos de interseção e use o clusterProfiler, org. Hs.eg.db, enrichplot e ggplot2 para análises de enriquecimento33.
    3. Faça a triagem da análise funcional de enriquecimento de GO nos 10 principais acertos biológicos com um valor de P corrigido < 0,05 e selecione as 30 principais vias com o maior enriquecimento para análise KEGG.

3. Acoplamento molecular

  1. Use o software AutoDock Vina para realizar o acoplamento molecular entre os componentes principais do JWSJS e os alvos principais para a terapia DN34.
  2. Pesquise no banco de dados PubChem para obter o arquivo sdf da estrutura 2D dos componentes principais do JWSJS. Use o software ChemBio 3D Ultra14.0 para gerar e otimizar sua estrutura 3D, salve-o no formato mol2 e use-o como um arquivo ligante.
  3. Encontre e baixe o formato pdb da estrutura 3D dos alvos principais do banco de dados do Banco de Dados de Proteínas (PDB) do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Use o software Pymol 2.4.0 para remover moléculas de água e ligantes da estrutura da proteína, salve-o no formato pdb e use-o como um arquivo receptor.
  4. Importe o arquivo pdb do receptor para o software AutoDockTools 1.5.7 para hidrogenação, converta a proteína do receptor e o ligante de molécula pequena no formato pdbqt, defina o bolso ativo para a proteína do receptor com o coeficiente de espaçamento definido em 1.
  5. Use o Autodock vina 1.2.0 para acoplamento molecular e calcule a energia de ligação; se a afinidade < 0, considere que a molécula se liga espontaneamente à proteína, maior valor absoluto de afinidade indica uma ligação mais estável entre elas. Por fim, visualize os resultados do encaixe usando os softwares Pymol 2.3.0 e LigPlot 2.2.5.

4. Simulação dinâmica molecular

  1. Para realizar simulações de MD usando o software Desmond, siga estas etapas:
    1. Empregue a versão acadêmica 2019-1 do software Desmond para avaliar a estabilidade e a flexibilidade das interações proteína-ligante.
    2. Conduza investigações de dinâmica molecular (MD) em um trio dos complexos de ligantes mais promissores derivados de estudos de docking. Realizar simulações em ambiente aquoso de SPC com NaCl 0,15 M, replicando as condições iônicas fisiológicas. A caixa de simulação é projetada para garantir que o soluto permaneça a pelo menos 10 Å de distância de seus limites. Contra-íons são introduzidos para neutralizar a carga elétrica do sistema. Além disso, são aplicadas condições de contorno periódicas, regidas pelos parâmetros do campo de força OPLS 2005.
    3. Inicie uma fase de minimização de energia para 100 ps usando os parâmetros padrão de Desmond.
    4. Garanta a estabilização de temperatura e pressão a 26,85 °C (300 K) e 1,01325 bar por meio da cadeia Nosé-Hoover e das metodologias Martyna-Tobias-Klein em todos os sistemas MD de produção. A simulação de dinâmica molecular é executada com um passo de tempo de 2 fs para uma duração total de 100 ns, registrando as coordenadas atômicas a cada 100 ps.
    5. Abra o módulo SID (diagrama de interações de simulação). Carregue os arquivos de dados do resultado da simulação no módulo.
    6. Selecione o tipo de análise desejado entre as opções disponíveis no módulo (por exemplo, desvio quadrático médio [RMSD], flutuação quadrática média [RMSF], análise de ligações de hidrogênio, etc.). Especifique quaisquer parâmetros adicionais necessários para o tipo de análise escolhido.
    7. Execute a análise clicando no botão Analisar ou Iniciar.
    8. Quando a análise estiver concluída, visualize e interprete os resultados na interface do módulo SID. Exporte os resultados, se necessário, para uso ou apresentação posterior.

5. Validação de experimentos com animais

  1. Animais e planejamento experimental
    NOTA: Este estudo envolveu 75 ratos Sprague-Dawley machos, que foram obtidos de uma instalação de produção animal de grau SPF e tinham 8 semanas de idade com uma massa corporal de 150 g ± 20 g (número do certificado de produção animal SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Alojar os ratos em um laboratório de animais de nível SPF e dividi-los aleatoriamente em grupos normais e modelo após 1 semana de alimentação adaptativa. Forneça ao grupo normal uma dieta normal e ao grupo modelo uma dieta rica em açúcar e gordura. Após 4 semanas, jejue os ratos, mas não os prive de água por 12 h.
    2. Injete o grupo modelo com uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (STZ; 35 mg · kg-1). Após 72 h, testar os níveis de açúcar no sangue através de amostragem de sangue nas veias da cauda. Se o nível de glicose no sangue em jejum for ≥16,7 mmol· L-1, confirma-o como um modelo diabético de sucesso.
    3. Confirme o modelo de ND bem-sucedido observando alterações histopatológicas no rim de ratos.
    4. Divida aleatoriamente os modelos replicados com sucesso no grupo modelo, que recebeu JWSJS a 4,37 g/kg, 8,73 g/kg e 17,46 g/kg (equivalente a 3,2, 6,3 e 12,6 vezes a dose clínica equivalente), bem como um grupo de irbesartan (0,014 g/kg). Cada grupo foi composto por 10 ratos. Administre todos os medicamentos por gavagem oral uma vez ao dia. Mantenha este regime posológico de forma consistente durante 4 semanas.
    5. Anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg) e confirmar a anestesia adequada pela perda do reflexo de retirada do pedal. Colete amostras de sangue da aorta abdominal antes da eutanásia.
    6. Colete os rins após a eutanásia dos ratos usando uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dose de 150 mg / kg.
      NOTA: Os animais foram eutanasiados humanamente, seguindo as diretrizes mais atualizadas da American Veterinary Medical Association (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) para eutanásia.
  2. Análises histológicas renais
    NOTA: Os tecidos renais foram fixados em paraformaldeído a 4% e desidratados em etanol após 48 h; Os cortes foram incluídos em parafina. Os cortes foram cortados em fatias finas (4 μm) para coloração de hematoxilina e eosina (HE) e ácido periódico-Schiff (PAS), e as alterações morfológicas da histologia renal foram observadas ao microscópio óptico.
    1. Coloração HE:
      1. Desparafinação e hidratação: Trate as seções de tecido com xileno I e II (10 min cada), álcool absoluto I e II (3 min cada). Em seguida, mergulhe as seções de tecido em etanol a 95%, 90%, 80% e 70% (2 min cada), seguido de uma lavagem com água destilada por 5 min.
      2. Coloque as seções de tecido na coloração de hematoxilina por 5 min e, em seguida, diferencie as seções com álcool clorídrico por 5 s.
      3. Coloque a seção na solução de coloração de eosina por 3 min.
      4. Desidratação, limpeza e montagem: Desidrate as seções em momentos variados em diferentes etanoles (70%, 80%, 90%, 95% e etanoles absolutos), depois limpe-as em xileno I e II, seguido de montagem com goma neutra.
    2. Coloração PAS:
      1. Siga as etapas de desparafinação descritas na etapa 5.2.1 e trate a seção com a solução de coloração ácida periódica por ~ 8 min.
      2. Enxágue as seções em água destilada por 2 min e depois core-as com o Reagente de Schiff por 15 min no escuro.
      3. Lave as seções em água da torneira por 10 minutos após tratá-las com o reagente de Schiff.
      4. Contra-corar as seções usando hematoxilina por 1 min e depois diferenciá-las com álcool HCl por 30 s. Lave as seções novamente em água da torneira por 5 min para colorir o núcleo de azul.
    3. Microscopia eletrônica:
      1. Fixe as amostras em glutaraldeído a 2,5% por 3 h e depois enxágue em PBS por 3 h. Além disso, trate as amostras em ácido ósmico a 1% por 3 h e depois enxágue novamente em PBS por 3 h.
      2. Desidratar através de uma série graduada de banhos de álcool que terminam em acetona (cada passo dura cerca de 2 h no total).
      3. Infiltrar as amostras com uma mistura de propano epóxi e resina epóxi (1:1) à temperatura ambiente (RT) durante 2 h, seguida de resina epóxi pura a 37 °C durante mais 2 h.
      4. Depois disso, cure e endureça as amostras em temperaturas cada vez mais altas durante um período de 36 h antes do seccionamento. Esse processo garante que o tecido seja completamente infiltrado com a resina, que é então endurecida para permitir cortes finos para microscopia eletrônica.
      5. Corar duas vezes com acetato de uranila a 3% e chumbo-ácido, observar e fotografar as amostras por microscopia eletrônica em 15 min.
        NOTA: As configurações de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) são as seguintes: uma ampliação de 7000x no modo de alto contraste (Zoom-1 HC-1), com uma tensão de aceleração de 80.0 kV em um sistema TEM.
  3. Imuno-histoquímica
    1. Desparafinação: Coloque as seções de tecido em xileno I e II por 10 min cada.
    2. Reidratação: Reidrate as seções de tecido desparafinado, colocando-as sucessivamente em etanol absoluto I e II por 3 min cada, seguido de etanol a 95%, 90%, 80% e 70% por 2 min cada.
    3. Recuperação de antígeno: Mergulhe as seções de tecido em solução tampão de citrato-ácido cítrico 0,1 M sob alta pressão por cerca de 5 min e depois resfrie até RT.
    4. Bloqueio: Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos, bloqueie incubando as seções de tecido com soro de cabra normal a 5% a aproximadamente 37 ° C por 30 min.
    5. Incubação de anticorpos primários: Adicione os anticorpos primários p-EGFR (diluído 1:200) e p-MAPK3/1 (diluído 1:200) em seções de tecido e incube durante a noite a 4 ° C dentro de uma câmara umidificada.
    6. Incubação de anticorpos secundários: Lave as seções três vezes com PBS, adicione anticorpos secundários marcados com biotina (diluídos em PBS de acordo com as instruções do fabricante) nas seções e incube a 37 ° C por 30 min.
    7. Aplique a solução de trabalho de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano nas seções de tecido a 37 ° C, seguida de lavagem três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    8. Para o desenvolvimento do DAB, incubar as seções com solução de revelação do DAB (3 min no escuro em RT), seguido de enxágue com água destilada. O DAB atua como um substrato cromógeno para a enzima peroxidase de rábano (HRP), que fica marrom após a oxidação.
    9. Use hematoxilina para contracoloração por cerca de 2 min, diferencie as seções com álcool clorídrico a 1% por 5 s e lave em água corrente para ficar azul.
    10. Desidrate colocando sucessivamente as seções em uma série de etanol de baixa a alta concentração, claro em xileno I e II, e monte as seções com goma neutra.
      NOTA: Este procedimento leva aproximadamente 18-24 h, incluindo incubação noturna de anticorpos primários.
    11. Selecione aleatoriamente três campos visuais (200x) para cada seção e analise os resultados da coloração das seções usando um software de análise de imagem. O software Image Pro Plus 6.0 foi usado seguindo as etapas abaixo.
    12. Primeiro, importe uma imagem da seção para o software.
    13. Correção de densidade: Para garantir resultados precisos, execute uma correção de densidade.
      1. Navegue até Medir > calibração > intensidade > novo padrão > opções opcionais de > de densidade > imagem. Em seguida, clique em uma área em branco da imagem para registrar o valor do plano de fundo e confirme-o clicando em OK.
    14. Configurando parâmetros de medição: Configure os parâmetros de medição para calcular a área e a densidade óptica integrada (IOD).
      1. Clique em Medir > contagem/tamanho > Meça > selecione Medidas. Selecione Área(100) e IOD e clique em OK.
      2. Vá para Opções, marque Fundo escuro na amostra, 4-Connect Pre-Filter e clique em OK.
    15. Seleção de cores: para determinar com precisão a positividade, selecione cores para detectar áreas manchadas versus áreas não manchadas.
      1. Clique em Selecionar cores > histograma baseado > HSI. Ajuste o valor H de acordo com a imagem, mantendo S inalterado e I variando entre zero e o valor de fundo. Em seguida, confirme clicando em Fechar.
      2. Coleta e cálculo de dados: Execute a coleta e o cálculo de dados clicando em Medir > Layout do > do Coletor de Dados, onde Nome, Área (Soma) e IOD (Soma) são selecionados. Em seguida, clique em Contar > Coletar agora > Lista de dados para exportar os dados para análise ou armazenamento posterior.
        NOTA: Isso resultou em uma medição semiquantitativa da expressão de proteínas em cada seção em termos de IOD/Área, que indica quanta proteína está presente em relação à área total analisada.
  4. Western blotting
    1. Obtenha o tecido renal e corte-o em pedaços. Coloque essas peças em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione a solução de lise de proteína pré-resfriada (50 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecil sulfato de sódio [SDS]) e homogeneize.
    2. Deixar no gelo durante 30 min e centrifugar a 13400 x g durante 20 min a 4 °C. Armazenar a amostra resultante num congelador a -80 °C.
    3. Use o método de Bradford para quantificar as proteínas.
      1. Prepare a solução de trabalho Coomassie Brilliant Blue misturando reagente e água destilada na proporção de 1:4.
      2. Estabeleça três grupos - branco, grupo de proteína padrão e grupo de proteína de amostra. Adicione 3 mL de solução de trabalho Coomassie Brilliant Blue a cada grupo, juntamente com solução salina fisiológica para o grupo em branco, proteína padrão para o grupo padrão e a proteína sobrenadante extraída para o grupo de amostra.
      3. Depois de deixar as misturas repousarem durante 5 min, medir os seus valores de absorvância utilizando um espectrofotómetro ultravioleta.
      4. Calcule a concentração da amostra usando esta fórmula: Concentração de proteína (mg/mL) = (Valor de absorbância da amostra/Valor de absorbância padrão do tubo) x Concentração de proteína padrão x 5.
    4. Adicione um volume igual de tampão de carga 6x a cada amostra de proteína. Ferver a 100 °C durante 5 minutos antes de os aliquotar e conservar num congelador a -20 °C até nova utilização.
    5. Realize eletroforese, blotting e bloqueio padrão.
      1. Realize eletroforese em gel de poliacrilamida SDS padrão (PAGE) usando um gel de resolução a 12%. Aplique uma tensão constante de 100 V para o gel de empilhamento e 120 V para o gel de resolução até que a frente do corante atinja o fundo do gel.
      2. Transferir proteínas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 2 h numa câmara frigorífica a 4 °C utilizando um sistema de transferência húmida.
      3. Após a transferência de proteína, bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado em TBST por 1 h em RT.
    6. Dilua os anticorpos primários EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) e CAPDH (1:5.000) em TBST com 5% de BSA. Adicionar estes anticorpos primários diluídos e incubar as membranas durante a noite a 4 °C com agitação suave.
    7. Após lavar a membrana três vezes com TBST, adicionar anticorpos secundários diluídos (1:5.000), seguido de incubação por 1 h. Após o desenvolvimento da cor, realize a análise quantitativa das bandas alvo usando o software ImageJ.
  5. Análise de qPCR
    1. Agrupamento: Atribua amostras aos grupos - Controle, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. Extração de RNA: Realize a homogeneização do tecido e a extração de RNA, seguida de adição de clorofórmio, centrifugação e precipitação de RNA de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Precipitação e lavagem de RNA: Precipitar RNA com isopropanol e lavar com etanol.
    4. Solubilização de RNA: Seque o pellet de RNA e dissolva-o em água tratada com DEPC.
    5. Síntese de cDNA: Realize a transcrição reversa usando misturas de reação específicas de acordo com as instruções do fabricante.
    6. Amplificação de qPCR: Use primers específicos para GAPDH, MAPK3, MAPK1 e EGFR para qPCR e execute a amplificação de acordo com as instruções do fabricante.
      As sequências de primers foram as seguintes:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Métodos estatísticos

  1. Realize a análise usando o software apropriado (por exemplo, SPSS) e represente os dados medidos como a média ± desvio(s) padrão(is). Se os dados atenderem aos critérios de distribuição normal e homogeneidade de variância, comparar entre os grupos usando ANOVA de uma via e realizar comparações múltiplas com o método de Bonferroni.
  2. Use o teste T2 para comparações múltiplas se a variância não for homogênea. Considere P < 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Seguindo o protocolo, 90 ingredientes ativos de JWSJS foram finalmente obtidos a partir da análise após triagem e desduplicação de acordo com os padrões estabelecidos de OB e DL. Estes incluíram 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, quatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum e seis tipos de componentes de Bombyx Batryticatus . Como existem muitos ingredientes ativos no JWSJS, apenas 20 estão listados (consulte a Tabela 1). Após a desduplicação, 396 alvos correspondentes aos ingredientes ativos do JWSJS foram finalmente obtidos.

Depois de procurar genes relacionados a doenças, 3035 genes-alvo relacionados ao DN foram finalmente obtidos após fusão e desduplicação. Os alvos correspondentes de ND foram comparados e analisados com os alvos dos ingredientes ativos dos medicamentos. A interseção foi determinada, o que resultou em 227 alvos de interseção de JWSJS e DN. Um diagrama de Wayne foi então desenhado (ver Figura 1A). O diagrama de rede "medicamento-ingrediente-alvo" foi construído usando o software Cytoscape 3.8.0 (ver Figura 1B) e a análise topológica foi realizada. Cada nó foi classificado de alto a baixo de acordo com o valor do grau. Os cinco principais componentes do medicamento foram quercetina, ácido palmitoleico, luteolina, kaempferol e naringenina, e os cinco principais alvos foram PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR e ESR1.

Em seguida, foi desenvolvida uma rede PPI para alvos de interseção JWSJS e DN (196 nós e 1714 arestas com um valor médio de grau de 17,4). Além disso, sete alvos principais que podem ser os principais alvos do JWSJS para o tratamento de ND foram obtidos após três triagens: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 e MAPK1 (ver Figura 1C).

Em seguida, a análise de enriquecimento de GO foi realizada para especular sobre as características biológicas do alvo da JWSJS no tratamento da ND. Entre BP, CC e MF, as dez principais entradas enriquecidas são plotadas na Figura 1D. Os resultados mostram que o JWSJS pode regular a proliferação, diferenciação e apoptose celular ligando-se a fatores de transcrição e proteínas quinases em jangadas de membrana e microdomínios de membrana, resultando assim em um efeito terapêutico no DN. A análise de enriquecimento da via KEGG foi realizada nos alvos participantes para explorar as possíveis vias de ação do JWSJS no ND. As trinta principais vias enriquecidas são plotadas na Figura 1E. Os resultados mostram que o tratamento da ND por JWSJS pode atuar em 181 vias de sinalização, envolvendo principalmente lipídios e aterosclerose, a via de sinalização PI3K-Akt, carcinogênese química, hepatite, câncer de próstata, apoptose, a via de sinalização HIF-1 e a via de sinalização TNF.

Para explorar ainda mais os alvos das primeiras 30 vias enriquecidas com KEGG, usamos o software Cytoscape 3.8.0 para construir um mapa de rede de relacionamento de via de sinalização KEGG para DN tratado com JWSJS. MAPK1, MAPK3, EGFR e AKT1 foram considerados alvos de várias vias agindo juntas (ver Figura 1F), sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel central na mediação dos efeitos do JWSJS no DN.

Para validar ainda mais os alvos potenciais do JWSJS no tratamento de DN, em seguida, selecionamos três alvos principais, MAPK1, MAPK3 e EGFR, com altos valores de grau na rede PPI e na rede de vias de sinalização KEGG. Estes foram molecularmente acoplados com quercetina, ácido palmitoleico e luteolina - os três principais componentes dos núcleos do JWSJS para tratamento de ND. As condições para triagem de PDB ID são as seguintes: (1) Ser derivado de humanos; (2) Resolução conformacional ≤ 2,5Å, ou seja, o menor possível; (3) A sequência conformacional deve ser o mais completa possível, ou seja, o complexo estrutural deve ter informações de ligantes de moléculas pequenas; e (4) O valor do pH cristalino deve ser o mais próximo possível da faixa fisiológica normal do corpo humano35. Finalmente, os IDs PDB de MAPK1, MAPK3 e EGFR foram 4QTA, 4QTB e 7JXQ.

Para verificar a confiabilidade do software AutoDock para o sistema de acoplamento neste estudo36, primeiro reencaixamos as três proteínas de MAPK1, Mapk3 e EGFR. A conformação do ligante na estrutura cristalina original das três proteínas-alvo foi sobreposta aos ligantes após o acoplamento (Figura 2A). Os valores de desvio quadrático médio (RMSD) entre a conformação do ligante pós-acoplamento e a estrutura cristalina original foram então calculados. Os valores de RMSD foram 1,129, 1,201 e 1,877 Å, respectivamente, todos ≤ 2Å. Isso mostrou que o método de acoplamento era confiável e poderia ser usado para a próxima verificação de encaixe molecular. Para comparar e declarar o potencial inibitório dos componentes principais, os ligantes originais de MAPK1, MAPK3 e EGFR foram usados como controles. A análise de encaixe previu com sucesso a energia de ligação entre luteolina, ácido palmitoleico e quercetina e os três alvos principais. Todos foram negativos e inferiores a -637; ver Tabela 2. É importante notar que o acoplamento molecular entre a luteolina e a MAPK1 tem o maior tamanho de cavidade e a menor energia de ligação. No geral, os resultados do docking molecular mostraram que luteolina, ácido palmitoleico e quercetina tiveram boa atividade de ligação com três alvos principais ( Figura 2B , C ).

O RMSD é utilizado para quantificar as mudanças médias de deslocamento de um grupo selecionado de átomos em relação a um sistema de referência. Enquanto isso, o RMSF caracteriza efetivamente alterações localizadas ao longo da cadeia proteica. O gráfico RMSD (Figura 2D) mostra que os valores RMSD do complexo composto luteolina-MAPK1 e do complexo quercetina-MAPK3 se estabilizaram em 5 ns. O complexo luteolina-EGFR mostrou um RMSD flutuante variando de 0-35 ns; este valor estabilizou-se em 35 ns até o final da simulação de 100 ns MD. Todos os complexos interagiram de forma estável no final da simulação de 100 ns MD. O valor de RMSF foi avaliado a partir da trajetória de simulação de MD: Átomos no sítio ativo e na cadeia principal que flutuaram minimamente implicaram uma mudança conformacional mínima, sugerindo que o composto principal mencionado está firmemente ancorado dentro da cavidade da bolsa de ligação da proteína alvo. Os resultados do RMSF mostraram flutuações limitadas nas estruturas complexas.

Finalmente, verificamos os resultados acima in vivo. Observamos primeiro que o peso dos ratos no grupo modelo diminuiu significativamente, e GSP, LDL-C, UTP e FBG aumentaram significativamente (P < 0,05). O peso corporal dos ratos aumentou significativamente no grupo do irbesartan e em cada grupo JWSJS em comparação com o grupo modelo. GSP, LDL-C, UTP e FBG diminuíram em diferentes graus (P < 0,05; ver Tabela 3).

Em seguida, a coloração HE mostrou que os glomérulos do grupo normal tinham um tamanho normal. Eles eram regulares e claros em estrutura e tinham uma membrana basal lisa, túbulos renais bem organizados e nenhuma infiltração de células inflamatórias. No grupo modelo, os glomérulos estavam hipertróficos, a membrana basal estava espessada e a matriz mesangial estava aumentada. O interstício foi infiltrado com células inflamatórias. As manifestações patológicas de cada grupo de administração foram aliviadas em diferentes graus em comparação com o grupo modelo (ver Figura 3A).

A coloração PAS mostrou que o grupo modelo apresentou aumento dos volumes glomerulares, espessamento da membrana basal e aumento da matriz mesangial em comparação com o grupo normal. Essas manifestações patológicas foram significativamente aliviadas por cada grupo de administração (ver Figura 3B). Usando microscopia eletrônica de transmissão, descobrimos que a membrana basal glomerular no grupo modelo estava espessada em comparação com o grupo normal. A matriz mesangial cresceu e os processos do pé do podócito foram extensivamente fundidos. As manifestações microscópicas de ratos em cada grupo de administração foram aliviadas em graus variados em comparação com o grupo modelo (ver Figura 3C).

Finalmente, as expressões de EGFR total, p-EGFR, MAPK3 / 1 e p-MAPK3 / 1 foram detectadas para ver se elas mudaram em ratos DN tratados com JWSJS. Não houve alteração significativa na expressão total de EGFR e MAPK3/1 nos grupos modelo versus o grupo normal. A expressão de p-EGFR, p-MAPK3/1 e BAX aumentou significativamente, e a expressão de BCL-2 diminuiu significativamente. Em comparação com o grupo modelo, a expressão de p-EGFR, p-MAPK3 / 1 e BAX foi significativamente reduzida, e a expressão de BCL-2 foi significativamente regulada positivamente em graus variados em tecidos renais de ratos em cada grupo de dosagem ( Figura 3D , E ). Esse resultado foi confirmado por imuno-histoquímica (Figura 3F,G). Este estudo mostrou que o JWSJS pode proteger os rins em ratos com DN, regulando a expressão das proteínas p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2 e reduzindo a apoptose celular. Além disso, qPCR foi utilizado para avaliar os níveis de expressão de mRNA de MAPK3, MAPK1 e EGFR em vários grupos. Os resultados revelaram que a expressão relativa no grupo ND foi significativamente maior em comparação com o grupo controle, bem como nos grupos Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M e JWSJS-H. Esse achado corrobora ainda mais os resultados iniciais (Figura 3H).

figure-results-1
Figura 1: A Farmacologia de Rede esclareceu os alvos potenciais do JWSJS e as vias de sinalização na nefropatia diabética. (A) Diagrama de Venn dos alvos de interseção do JWSJS e da nefropatia diabética. Verde representa o número de alvos terapêuticos dos componentes do JWSJS e roxo representa o número de alvos relevantes do DN. A parte de interseção representa o número de alvos de interseção (ou seja, o número de destinos do JWSJS para DN). (B) Diagrama de rede "medicamento-ingrediente-alvo" de JWSJS no tratamento de ND. O azul claro representa os alvos relevantes do JWSJS para o tratamento de ND. Fúcsia representa o ingrediente ativo de Bombyx Batryticatus. Verde representa os ingredientes ativos de Hedysarum Multijugum Maxim. O azul escuro representa os ingredientes ativos do Radix Rhei et Rhizome. O vermelho representa os ingredientes ativos da Cicadae Periostracum. O roxo representa os ingredientes ativos do Epimrdii Herba. O amarelo representa os ingredientes ativos do Smilacis Glabrae Rhixoma. O azul celeste representa os ingredientes ativos do Curcumaelongae Rhizoma. (C) Rede PPI de alvos de interseção JWSJS e DN. (D) Os 10 genes mais significativos identificados por meio da análise ontológica de genes-alvo de terapia implicados no tratamento de DN por JWSJS. (E) Os 30 genes mais significativos identificados por meio da análise de vias de genes-alvo de terapia implicados no tratamento de DN por JWSJS. (F) A rede de relacionamento da via de sinalização KEGG no tratamento de DN por JWSJS. Os ícones amarelos representam as vias de sinalização. Os ícones azuis representam alvos de ação. Um gráfico maior implica que mais caminhos estão conectados a ele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Docking molecular e visualização de trajetórias de dinâmica molecular de JWSJS no tratamento da nefropatia diabética. (A) As conformações do ligante na estrutura cristalina original dos três complexos de proteínas-alvo 7JXQ (a), 4QTA (b) e 4QTB (c) são comparadas com as conformações do ligante após o docking. Verde, laranja e rosa são proteínas-alvo EGFR, MAPK1 e MAPK3, respectivamente. O ouro é a molécula de ligante original e o azul é a molécula de ligante após o acoplamento. (B) Visualização de docking molecular 3D de JWSJS no tratamento de nefropatia diabética. Verde, laranja e rosa são as proteínas-alvo 7JXQ, 4QTA e 4QTB, respectivamente. 1a-3a representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA e 4QTB com o inibidor original (azul). 1b-3b representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e luteolina (amarelo). 1c-3c representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e ácido palmitoleico (fúcsia). 1d-3d representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e quercetina (roxo). (C) Visualização de docking molecular 2D de JWSJS no tratamento de nefropatia diabética. 1a-3a representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA e 4QTB com o inibidor original. 1b-3b representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e luteolina. 1c-3c representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e ácido palmitoleico. 1d-3d representa o diagrama de interação de 7JXQ, 4QTA, 4QTB e quercetina. (D) Análise RMSD e RMSF das trajetórias dinâmicas moleculares de (a) luteolina e proteína alvo 7JXQ, (b) luteolina e proteína alvo 4QTA e (c) quercetina e proteína alvo 4QTB complexos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: JWSJS alivia a lesão renal e suprime a ativação da via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1 em experimentos in vivo . (A) Coloração HE e (B) coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) de tecidos renais de ratos em diferentes grupos (Ampliação, 200x; n = 10). (C) Microscopia eletrônica de transmissão do tecido renal em diferentes grupos de ratos (Ampliação, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3/1, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2 em tecido renal de ratos diabéticos por western blotting (n = 3). (E) Análise estatística da expressão de p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX e BCL-2. (F) Análise imuno-histoquímica da expressão de p-EGFR E p-MAPK3/1 nos seis grupos (n = 6). (G) Análise estatística da expressão de p-EGFR E p-MAPK3/1. (H) análise de qPCR da expressão de mRNA de MAPK3, MAPK1 e EGFR em seis grupos. *P < 0,05 vs. controle. **P < 0,01 vs. controle. ▲P < 0,05 vs. DN. ▲▲P < 0,01 vs. DN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Informações de alguns ingredientes ativos do JWSJS. Ele fornece detalhes sobre cada componente e suas características ou propriedades. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Tabela de resultados de encaixe dos principais alvos e principais ingredientes ativos do JWSJS. A tabela apresenta os resultados dos estudos de acoplamento dos principais alvos e principais componentes ativos do JWSJS. Esta tabela mostra como esses constituintes interagem com seus respectivos alvos, o que pode fornecer informações sobre o mecanismo de ação do JWSJS. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Efeito da JWSJS no peso corporal e nos índices bioquímicos em ratos com nefropatia diabética (expresso como média ± desvio padrão, n = 10). Em comparação com o grupo normal: * P < 0,05. Comparado com o grupo modelo: # P < 0,05. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Nosso estudo empregou uma combinação de farmacologia de rede, docking molecular e modelos animais in vivo . Um passo crítico foi o estabelecimento da rede "medicamento-componente-alvo", que foi crucial para identificar os mecanismos potenciais do JWSJS no tratamento da ND, concentrando-se particularmente em sua interação com a via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1.

Durante este estudo, fizemos várias modificações, particularmente no processo de docking molecular, para aumentar a precisão de nossas previsões. A solução de problemas foi focada principalmente na otimização das condições para o modelo animal in vivo para garantir sua relevância para a DN humana. Ao identificar os principais componentes ativos e alvos do JWSJS, este estudo fornece uma base teórica para pesquisas e desenvolvimento adicionais do JWSJS como um potencial candidato a medicamento para o tratamento da ND.

O estudo investigou o potencial mecanismo de ação da JWSJS na redução da apoptose renal na ND. Os resultados do docking molecular mostraram que a quercetina, o ácido palmitoleico e a luteolina têm atividades regulares de ligação a alvos-chave, incluindo MAPK1, MAPK3 e EGFR. Selecionamos esses alvos para um estudo mais aprofundado devido à sua ação comum em várias vias. Em ratos com ND, o tratamento com JWSJS resultou em uma diminuição significativa nos níveis de FBG e GSP, melhora no UTP e LDL-C, ganho de peso e melhora das manifestações microscópicas do tecido renal, indicando a eficácia potencial da JWSJS no tratamento da ND.

A apoptose é um modo crítico de morte celular, e a desregulação pode aumentar o risco de várias doenças38. Estudos anteriores demonstraram que os ratos com ND apresentaram aumento da expressão das proteínas relacionadas à apoptose BAX e caspase-3 e aumento significativo no número de células apoptóticas no tecido renal39,40. Os resultados mostraram que o tratamento com JWSJS reverteu essas alterações, sugerindo que ele pode atenuar a apoptose de podócitos em condições diabéticas.

Uma investigação mais aprofundada sobre o potencial mecanismo de ação do JWSJS mostrou que ele tem um efeito multialvo e multivia no ND. Nós nos concentramos em estudar MAPK1, MAPK3 e EGFR, pois eles tinham o maior número de vias de enriquecimento. A via ERK, que está envolvida em vários processos fisiológicos e patológicos, como crescimento celular, proliferação, diferenciação, apoptose e secreção anormal de esteróides, é uma via essencial na via de transdução de sinal MAPK 13,41,42,43. Inferiu que a JWSJS resgatou a apoptose de podócitos inibindo a via de sinalização EGFR / MAPK3 / 1.

Também descobrimos que o JWSJS poderia regular a expressão de p-EGFR e p-MAPK3 / 1, resultando em níveis marcadamente regulados de Bcl-2, mas uma regulação negativa perceptível de Bax. Isso, por sua vez, levou à redução da apoptose das células renais. Resultados semelhantes foram encontrados em estudos anteriores. Por exemplo, Chen relatou que a deleção de EGFR em podócitos atenuou a nefropatia diabética44. Alguns pesquisadores descobriram que a via EGFR/ERK promoveu a proliferação e diferenciação de células epiteliais intestinais suínas9. A inibição do EGFR pode regular negativamente a expressão de TGF-β e BAX, melhorando assim a fibrose renal e a apoptose45. Esses achados sugerem que a JWSJS é uma prescrição de medicina tradicional chinesa com um papel significativo na terapia adjuvante da ND, inibindo a via de sinal EGFR / MAPK3 / 1. No entanto, mais estudos são necessários para entender completamente o potencial mecanismo de ação da JWSJS no tratamento da ND.

Houve várias limitações para este estudo. Primeiro, a dependência de modelos animais pode não replicar totalmente a resposta humana ao JWSJS. Além disso, as previsões de farmacologia de rede, embora perspicazes, requerem validação adicional por meio de dados experimentais. Mais estudos clínicos em seres humanos são necessários para validar os achados. Em segundo lugar, embora a farmacologia de rede seja uma ferramenta útil para analisar as relações droga-doença, os resultados devem ser interpretados com cautela, pois são baseados em previsões e não em dados experimentais. Em terceiro lugar, o mecanismo de ação do JWSJS para o tratamento da ND permanece obscuro, e o estudo se concentrou apenas nos alvos potenciais de MAPK1, MAPK3 e EGFR.

Os métodos utilizados neste estudo podem ser aplicados a outras formulações da medicina tradicional chinesa, potencialmente levando à descoberta de novas opções terapêuticas para ND e outras doenças complexas. Além disso, essa abordagem estabelece as bases para a integração da medicina tradicional e moderna em futuras pesquisas farmacológicas. Mais estudos são necessários para elucidar completamente os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos da JWSJS. Finalmente, o estudo não investigou os potenciais efeitos colaterais ou toxicidade do JWSJS, que são considerações importantes no desenvolvimento de qualquer novo medicamento. Mais pesquisas são necessárias para avaliar a segurança da JWSJS e garantir sua aplicação clínica.

Em resumo, este estudo investiga principalmente o potencial terapêutico de Jiawei Shengjiang San para nefropatia diabética utilizando farmacologia de rede, docking molecular e validação animal in vivo . Enfatiza os aspectos processuais, com foco na metodologia empregada para entender as interações entre o JWSJS e a via de sinalização EGFR/MAPK3/1 e como essas interações potencialmente reduzem a apoptose das células renais na ND.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo projeto geral da Fundação de Ciências Naturais da Província de Hebei, China (nº H2019423037).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2 vezes; SYBR Green qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
Quantificação de proteína urinária de 24 horas (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidinaShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Instrumento de análise bioquímica automáticaHitachi, Japão7170A
Etanol anidroBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Anticorpos primários Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Anticorpos primários Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscópioOlympus, JapãoBX53
Substituto de clorofórmioECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Software Desmond Nova York, NY, EUALançamento 2019-1
Banho de Água Digital de Temperatura ConstanteChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Anticorpos primários Affinity, EUAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, EUA14900
Glicemia de jejum (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyserMultiskan; Thermo, EUAN/A
GAPDH  Anticorpos primários Affinity, EUAAF7021
Proteína sérica glicada de rato (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Microscópio eletrônico de transmissãoHitachi, JapãoH-7650
Solução de coloração de hematoxilina/eosina (HE)Servicebio, EUAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, EUAN/A
Instrumento de Amplificação de PCR em Tempo RealApplied Biosystems, EUAiQ5 
Comprimidos de irbesartanHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
  Grânulos JWSJSGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging systemKodak, USAIS2000
Colesterol de baixa densidade (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies Affinity, EUAAF0155
Centrífuga Médica para RatosHunan Xiangyi Desenvolvimento de Instrumentos de Laboratório, China TGL-16K
Mini sistema de transferência trans-blotBio-Rad, EUAN/A
Sistema de eletroforese Mini-PROTEANBio-Rad, EUA/A
Espectrofotômetro NanoVue PlusHealthcare Bio-Sciences AB, Suécia111765
p-EGFR Anticorpos primários Affinity, USAAF3044Rat
Ácido periódico-Schiff (PAS) solução de coloraçãoServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Anticorpos primários Affinity, USAAF1015Rat
Secondary anticorpos  Santa Cruz, EUAsc-2357Rabbit
StreptozotocinSigma, EUAS0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis KitGeneCopeia, USAQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, Beijing, ChinaR1100
Ultra-Clean WorkbenchSuzhou Purification Equipment, ChinaSW-CJ-1F 
N

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