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Monitoramento da glicose no sangue na prole de camundongos após injeção intracitoplasmática de espermatozóides

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DOI:

10.3791/66212

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17 de maio de 2024

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de camundongo de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) e transferência de embriões (ET), permitindo-nos observar mudanças relacionadas à idade no metabolismo da glicose que podem ser atribuídas à ICSI, fornecendo informações sobre seus potenciais impactos de longo prazo no desenvolvimento humano.

Resumo

A vida humana é consideravelmente longa, enquanto os modelos de camundongos podem simular toda a vida humana em um período relativamente curto, com um ano de vida do camundongo aproximadamente equivalente a 40 anos humanos. A injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é uma tecnologia de reprodução assistida comumente usada na prática clínica. No entanto, dado seu surgimento relativamente recente há cerca de 30 anos, os efeitos a longo prazo dessa técnica no desenvolvimento humano permanecem obscuros. Neste estudo, estabelecemos o método ICSI combinado com transferência de embriões (ET) usando um modelo de camundongo. Os resultados demonstraram que o esperma normal de camundongos, após ser submetido a cultura in vitro e subsequente ICSI, exibiu uma taxa de fertilização de 89,57% e uma taxa de duas células de 87,38%. Após o TE, a taxa de natalidade da prole foi de aproximadamente 42,50%. Além disso, à medida que os camundongos envelheciam, foram observadas flutuações nos níveis de metabolismo da glicose, o que pode estar associado à aplicação da técnica ICSI. Essas descobertas significam que a técnica ICSI-ET de camundongos fornece uma plataforma valiosa para avaliar o impacto das anormalidades espermáticas no desenvolvimento embrionário e seus efeitos a longo prazo na saúde da prole, particularmente no que diz respeito ao metabolismo da glicose. Este estudo fornece informações importantes para pesquisas futuras sobre os efeitos potenciais da técnica ICSI no desenvolvimento humano, enfatizando a necessidade de uma investigação aprofundada sobre as implicações de longo prazo dessa tecnologia.

Introdução

As questões de fertilidade surgiram como um dos principais focos de preocupação médica e sociológica, especialmente na sociedade moderna, onde o declínio das taxas de fertilidade e o aumento da gravidade da prevalência e gravidade da infertilidade ganharam destaque. A Tecnologia de Reprodução Assistida (ART) oferece uma ampla gama de possibilidades para enfrentar esses desafios, com a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides (ICSI) comumente utilizada como intervenção terapêutica.

Desde que Palermo relatou a primeira gravidez bem-sucedida alcançada por meio de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) em 1992, a ICSI tornou-se uma técnica fundamental nas Tecnologias de Reprodução Assistida (ART)1. No entanto, considerando que a ICSI tem sido usada em ambientes clínicos há apenas 30 anos, um período relativamente curto em comparação com a vida humana, os efeitos a longo prazo da ICSI, especialmente no desenvolvimento da prole, não foram extensivamente investigados e elucidados. Atualmente, camundongos caracterizados por seu histórico genético uniforme e vida útil mais curta surgiram como um modelo alternativo amplamente utilizado na pesquisa médica. Além disso, o modelo de camundongo pode recapitular toda a vida humana dentro de um período de tempo comprimido, onde um ano em camundongos corresponde aproximadamente a 40 anos em humanos2.

Na última década, vários estudos de pequena escala relataram que indivíduos concebidos por ICSI podem ter um risco aumentado de desenvolver síndromes metabólicas, como níveis anormais de açúcar no sangue, mais tarde na vida 3,4. Embora as evidências não sejam definitivas, esse achado levantou sérias preocupações na comunidade científica em relação às implicações de longo prazo da ICSI para a saúde. Essa situação ressalta a necessidade premente de avaliações mais rigorosas da TARV e suas consequências para a saúde a longo prazo. Particularmente à luz das limitações e considerações éticas dos estudos em humanos, o desenvolvimento de modelos animais que possam recapitular com precisão o desenvolvimento da prole humana após a ICSI tornou-se cada vez mais crucial. Nesse contexto, o modelo ICSI-ET (Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides-Transferência de Embriões) de camundongos, devido à sua capacidade de imitar a ICSI humana e facilitar o monitoramento de longo prazo dos resultados de saúde da prole, tornou-se uma ferramenta eficaz para avaliar os riscos potenciais à saúde da tecnologia ICSI para a prole5.

Este estudo tem como objetivo investigar o impacto da tecnologia ICSI-ET em um fenótipo metabólico prevalente, ou seja, a saúde metabólica da glicose da prole, empregando monitoramento aleatório da glicose no sangue, teste de glicose no sangue em jejum e testes de tolerância à glicose para avaliar o estado metabólico da glicose de camundongos. O monitoramento aleatório da glicose no sangue é utilizado para capturar as flutuações naturais no metabolismo da glicose durante as atividades fisiológicas normais, enquanto os testes de glicose no sangue em jejum e tolerância à glicose são empregados para avaliar possíveis estados pré-diabéticos.

Protocolo

O protocolo do ICSI-ET descrito abaixo segue as diretrizes e foi aprovado pela Animal Ethical Review do Instituto de Pesquisa da Planned Parenthood de Xangai. Procedimentos de segurança: Sempre use equipamento de proteção individual (EPI) apropriado ao manusear produtos químicos ou materiais biológicos. Uso de coifas: Execute todos os procedimentos que envolvam produtos químicos voláteis ou geração de aerossóis dentro de uma capela de exaustão certificada ou gabinete de biossegurança. Use camundongos fêmeas (cepa B6D2F1 de 6-8 semanas de idade) para o procedimento de superovulação.

1. ICSI em camundongos

  1. Superovulação de camundongos
    1. Administre uma injeção intraperitoneal de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) na dose de 7,5 UI por camundongo por volta das 20:00 do primeiro dia.
    2. Administre uma injeção intraperitoneal de gonadotrofina coriônica humana (HCG) na dose de 7,5 UI por camundongo por volta das 20:00 (48 horas após a injeção de PMSG) no terceiro dia.
  2. Preparar o meio HTF em alíquotas de 1 ml e deixá-las descobertas para equilíbrio durante a noite a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% no mesmo dia da injeção de HCG em ratinhos fêmeas.
  3. Preparação de gotículas de fertilização ICSI
    1. No mesmo dia da injeção de HCG em camundongos fêmeas, divida uma tampa de 50 x 9 mm em metades superior e inferior. Use a metade superior para criar 4-6 gotículas de 5 μL cada, usando 10% de polivinilpirrolidona (PVP) para colocação de espermatozoides. Use a metade inferior para criar 8-10 gotículas de 5 μL cada, usando meio M2 para o procedimento ICSI.
    2. Cubra as gotículas do meio PVP e M2 com aproximadamente 3 mL de óleo mineral (Figura 1).
  4. Preparação de pratos de cultura
    1. No mesmo dia da injeção de HCG em camundongos fêmeas, dispensar 12 gotas de meio KSOM (MR-020P-D) de 20 μL uniformemente em uma placa de cultura de células de 35 x 10 mm. Cubra as gotas com aproximadamente 3 mL de óleo mineral.
  5. Colheita de esperma:
    1. Eutanasiar camundongos machos por luxação cervical aproximadamente às 9h00 do quarto dia (13 h após a injeção de HCG).
    2. Isole a cauda do epidídimo e limpe-a completamente para eliminar qualquer tecido adiposo e restos de sangue, enxugando suavemente com gaze estéril e enxaguando em meio HTF pré-aquecido.
    3. Abra o epidídimo da cauda para permitir que o esperma nade livremente para o meio HTF. Aperte suavemente a cauda usando uma pinça para liberar os espermatozoides, colete-os em tubos HTF pré-equilibrados e mantenha-os descobertos em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% para capacitação de espermatozóides para uso posterior.
  6. Recuperação de oócitos
    1. Eutanásia de camundongos fêmeas estimulados para a recuperação de oócitos por luxação cervical por volta das 9h30 do quarto dia. Faça cuidadosamente uma incisão ao longo da linha média da pele abdominal e da camada muscular para expor a cavidade abdominal.
    2. Use uma pinça fina para isolar suavemente o tecido de ambos os lados dos ovidutos, especialmente as regiões inchadas da ampola, e transfira-o para o meio M2 em uma placa de cultura esterilizada. Repita este procedimento até que os ovidutos de todos os camundongos designados sejam coletados.
    3. Sob um microscópio de dissecação, use uma agulha de seringa de 1 mL para perfurar suavemente a seção transparente da ampola inchada do oviduto, facilitando a liberação de complexos cumulus-oócitos (COCs) no meio.
    4. Usando a mesma seringa, escolha e transfira cuidadosamente os COCs para um novo prato contendo 100 μL de meio M2 fresco. Repita esta etapa até que todos os COCs sejam transferidos com sucesso dos segmentos originais do oviduto.
    5. Limpe o sangue e os fluidos teciduais e, sob um microscópio de dissecação, rasgue a ampola do oviduto usando uma agulha de 25 G, resultando na liberação de vários COCs.
    6. Remover o oviduto e os fragmentos de tecido, transferir os COCs para gotículas de meio M2 contendo hialuronidase (HY) e pré-aquecê-los a 37 °C.
    7. Após a incubação por aproximadamente 5 min, faça uma pipetagem suave para facilitar a separação das células do cumulus e dos oócitos. Transferir os ovócitos metafásicos II (MII) da solução contendo HY para o meio M2 fresco; em seguida, execute a transferência sequencial em várias gotículas de meio M2.
    8. Após 2-3 rodadas de lavagens, transfira os oócitos para gotículas de meio de cultura KSOM e mantenha-os em uma incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% para uso posterior.
  7. Por volta das 10h00 do quarto dia, sonicar 100 μL do espermatozóide capacitado (ver passo 1.5.2.) durante 5 s para separar as cabeças das caudas a uma frequência de 46 kHz, com uma potência de 50 watts.
    NOTA: Ao sonicar o esperma para truncar a cauda, tenha cuidado para controlar o tempo, que não deve exceder 5 s. Alguns segundos após a sonicação, o esperma pode ser observado ao microscópio invertido; pare de sonicar quando aproximadamente metade dos espermatozoides mostrar caudas truncadas.
  8. Procedimento ICSI
    1. Use uma agulha de micromanipulação disponível comercialmente com uma ponta plana e um diâmetro interno de 6 μm, ajustada em um ângulo de 25°, para a injeção. Encha a agulha com o fluido operacional com a porção cheia medindo um comprimento de 0,5 cm dentro da agulha. Certifique-se de que o nível do fluido atinja ~ 0.5 cm.
      NOTA: Mantenha a temperatura ambiente a 19 °C durante a injeção para evitar altas temperaturas que possam reduzir a taxa de sobrevivência dos oócitos fertilizados. A precisão em garantir que o nível do líquido atinja 0,5 cm é crucial para manter a integridade do processo de injeção e garantir a viabilidade dos oócitos.
    2. Instale a agulha de injeção no braço direito do micromanipulador, fixada com segurança apertando a tampa de retenção. Instale uma pipeta de retenção de micromanipulação de ponta plana disponível comercialmente projetada para oócitos de camundongos no braço esquerdo do micromanipulador e posicione a agulha de injeção e a pipeta de retenção no campo de visão do microscópio.
    3. Adicione 1 μL de esperma sonicado a uma gota de solução de PVP usando uma pipeta.
    4. Colocar 20 ovócitos MII numa gota de meio M2.
    5. Use a agulha de injeção para aspirar 10-20 cabeças de esperma em solução de PVP. Em seguida, mova a agulha de injeção para a gota que contém os ovócitos.
    6. Determine diretamente a posição do fuso metafásico dentro do oócito sob um microscópio de polarização para garantir que o aparelho do fuso não esteja do lado da injeção, com o corpo polar normalmente localizado na posição de 12 ou 6 horas em relação à orientação do oócito.
    7. Mantenha o oócito em contato com o fundo da placa de cultura. Ajuste o plano focal para que a zona pelúcida do oócito e a agulha de injeção fiquem no mesmo plano.
    8. Ao entrar em contato da agulha de injeção com a zona pelúcida, aplique uma leve pressão negativa na agulha de injeção, puxando uma parte da zona pelúcida.
    9. Ative simultaneamente pulsos piezoelétricos com uma configuração de intensidade de 5 e uma frequência de 1, criando efetivamente uma perfuração na zona pelúcida e permitindo a passagem da agulha de injeção.
    10. Avance a agulha de injeção no espaço perivitelino, empurrando a cabeça do esperma para a ponta da agulha. Insira a agulha de injeção no oócito até atingir o lado oposto da zona pelúcida.
    11. Use pulsos piezoelétricos ajustados para uma intensidade de 1 e uma frequência de 1 para criar um pequeno poro na membrana plasmática, garantindo que a cabeça do esperma seja injetada no ooplasma com entrada mínima de PVP e preservação ideal da integridade do oócito.
    12. Repita a etapa 1.8.11 até que todos os 20 oócitos sejam injetados, seguido por uma incubação de 15 minutos a 19 °C.
    13. Transfira os oócitos sobreviventes para o meio KSOM e coloque-os na incubadora. Observe as taxas de formação de 2 células, 4 células, mórula e blastocisto.
      NOTA: O tempo para injeção intracitoplasmática de espermatozóide único (ICSI) no oócito deve ser controlado, com o objetivo de concluir o procedimento dentro de 14-18 h após a injeção de HCG.

2. Transplante uterino de blastocistos de camundongos

  1. Preparação de camundongos machos vasectomizados
    NOTA: Use camundongos machos ICR com idade entre 6 e 8 semanas para o estudo.
    1. Induzir anestesia por injeção intraperitoneal de 2,25% de 2,2,2-tribromoetanol na dose de 0,2 mL / 10 g de peso corporal. A ausência de qualquer resposta à dor indica anestesia bem-sucedida.
      NOTA: Embora o protocolo atual não inclua a aplicação de pomada veterinária nos olhos de animais anestesiados, é recomendado como prática recomendada para prevenir o ressecamento ocular e garantir a saúde e o conforto dos animais durante os procedimentos. Durante todo o processo cirúrgico e de recuperação, todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados antes do uso, e a área cirúrgica foi preparada com soluções antissépticas para garantir um ambiente operacional limpo.
    2. Para se proteger contra possíveis estresses ou lesões, abrigue os camundongos que foram submetidos à cirurgia individualmente durante a fase inicial de recuperação.
    3. Administre buprenorfina na dosagem de 0,05 mg/kg de peso corporal para garantir o alívio ideal da dor.
      NOTA: Para garantir o bem-estar dos camundongos, monitore de perto os camundongos durante o período de recuperação e não os deixe sozinhos até que recuperem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
    4. Preparar o sítio cirúrgico na região abdominal inferior, superior aos testículos. Retire o pelo e desinfete com iodopovidona. Usando uma tesoura estéril, faça uma incisão longitudinal de 1 cm ao longo da linha alba. Remova suavemente qualquer sangue com papel estéril e sem poeira e prossiga para dissecar sem rodeios os músculos abdominais ao longo da linha alba e acessar a cavidade abdominal.
    5. Usando uma pinça curva, segure e exponha suavemente o testículo esquerdo e sua almofada de gordura associada. Identifique o ducto deferente e isole-o cuidadosamente com uma pinça pontiaguda, criando um segmento de 10 mm para manipulação.
    6. Esterilize a pinça curva segurando-a na chama externa de uma lâmpada de álcool por vários segundos. Segure suavemente o ducto deferente, fazendo com que fique achatado e branqueado devido à cauterização. Crie um segundo ponto de cauterização 3-5 mm distal ao primeiro. Usando uma tesoura cirúrgica estéril, excisar o segmento do ducto deferente entre os dois pontos de cauterização.
    7. Inspecione cuidadosamente as extremidades cauterizadas do ducto deferente, certificando-se de que um segmento curto, achatado e branqueado permaneça. Usando uma pinça curva, retorne suavemente o testículo e sua almofada de gordura associada à cavidade abdominal.
    8. Repita o procedimento descrito na etapa 2.1.6 no lado contralateral (direito).
    9. Feche o local da cirurgia usando suturas, normalmente colocando um ponto na camada muscular e três pontos na pele. Garantir o alinhamento adequado da incisão cirúrgica e desinfetar com iodopovidona. Transfira o animal para uma almofada de aquecimento para observação, monitorando por 10-15 min até que o animal recupere a consciência. Uma vez recuperado, devolva o animal à sua gaiola.
      NOTA: Após a cirurgia de vasectomia, os camundongos requerem um período de recuperação de 14 dias, seguido por um experimento de acasalamento experimental de 1 semana.
    10. Durante esta semana, acasale continuamente os machos vasectomizados com as fêmeas e observe o estado de gravidez de todas as fêmeas que apresentam tampões copulatórios. O acasalamento bem-sucedido é indicado pela presença de um tampão vaginal branco-amarelado e em blocos no orifício vaginal da fêmea.
      1. Emparelhe os ratos entre 16:00 e 18:00 no primeiro dia e verifique os tampões vaginais entre 7:00 e 9:00 no segundo dia. Considere as fêmeas com tampões vaginais em um estado pseudográvido em 0,5 dias e use-as para experimentos subsequentes de transferência de embriões. Devolva as fêmeas sem tampões vaginais ao grupo receptor.
        NOTA: Essas fêmeas sem tampões vaginais podem continuar a ser usadas para acasalamento para preparar fêmeas pseudográvidas. Certifique-se de que todas as fêmeas conectadas não engravidem; Só então os machos vasectomizados podem ser usados para experimentos formais.
      2. Embora os machos vasectomizados possam acasalar diariamente, reserve 1 dia de descanso entre as sessões de acasalamento.
        NOTA: Com base em nossa experiência, os machos vasectomizados podem manter uma alta taxa de plug copulatório por mais de um ano. No entanto, machos vasectomizados que não conseguem produzir tampões copulatórios em fêmeas de acasalamento por 4-6 tentativas consecutivas devem ser removidos do estudo.
  2. Preparação de fêmeas pseudográvidas
    1. Gere camundongos fêmeas pseudográvidos acasalando camundongos fêmeas ICR (com idades entre 7 e 10 semanas, pesando mais de 25 g) com camundongos machos vasectomizados (3-6 meses de idade) na proporção de 1:1.
      NOTA: Os machos vasectomizados foram utilizados para estimular o colo uterino das fêmeas, resultando na ativação dos corpos lúteos.
  3. Preparação da pipeta para transferência de blastocistos
    1. Retirar os embriões a transplantar da incubadora e transferi-los para uma gota de meio M2 à temperatura de 37 °C.
    2. Use uma pipeta de transferência para aspirar um pequeno volume de líquido, extrair uma pequena quantidade de ar e aspirar de 6 a 10 embriões. Por fim, aspire outro pequeno volume de ar para selar a pipeta.
      NOTA: O comprimento do fluido na pipeta de transferência não deve exceder 0.5 cm.
  4. Transplante uterino (blastocistos)
    1. Pese os camundongos fêmeas pseudo-grávidas (2,5 dias após o acasalamento) e anestesize-os por injeção intraperitoneal de 1,25% de 2,2,2-tribromoetanol na dose de 0,2 mL / 10 g de peso corporal. Pressione suavemente a orelha com uma pinça.
    2. Depois de administrar anestesia aos camundongos e garantir a assepsia por meio de desinfecção com álcool, faça uma incisão longitudinal na linha média no abdômen ventral. Aproveitando o tecido subcutâneo solto, desloque a incisão para o lado esquerdo ou direito conforme necessário para o transplante. Use uma tesoura pequena para realizar a dissecção romba da camada muscular da parede abdominal a ~0,5 cm lateral à coluna lombar para acessar a cavidade peritoneal.
    3. Usando uma pinça atraumática, exteriorize cuidadosamente os ovários, ovidutos e útero.
    4. Usando a ponta de uma agulha de seringa, faça uma pequena incisão em ângulo ascendente na parede uterina abaixo da junção útero-tubária, evitando vasos sanguíneos. Esta incisão fornece acesso à cavidade uterina; Insira suavemente o oviduto 2-3 mm através do pequeno orifício.
    5. Expulse cuidadosamente a pequena bolha de ar no final da pipeta de transferência enquanto observa cuidadosamente a pipeta de transferência durante a injeção lenta dos embriões. Uma vez confirmada a expulsão da porção central do meio de cultura, interrompa o procedimento e remova suavemente a pipeta de transferência.
    6. Reposicione os ovários, ovidutos e útero de volta à cavidade abdominal. Suturar a camada muscular e a pele separadamente. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento até que eles se recuperem da anestesia. Para garantir o bem-estar dos camundongos, monitore de perto os camundongos durante o período de recuperação e não os deixe sozinhos até que recuperem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
  5. Observação da gravidez
    1. Após a cirurgia, observe os camundongos por 18 a 21 dias para monitorar o número de filhotes nascidos. Em caso de distocia (parto difícil), faça uma cesariana. Permitir que os camundongos recém-nascidos sejam adotados por mães lactantes da mesma faixa etária.

3. Glicose no sangue aleatória, glicose no sangue em jejum e teste de tolerância à glicose

  1. Rastreando níveis aleatórios de glicose no sangue durante o crescimento do camundongo
    1. Desde o nascimento dos camundongos, monitore o nível aleatório de glicose no sangue a cada 4 semanas às 9h, após uma boa noite de alimentação e diversão.
      1. Perfure a ponta da cauda do rato para obter sangue da veia da cauda.
      2. A primeira gota de sangue tem um valor de medição de açúcar mais alto devido à presença do fluido tecidual misturado a ela. Portanto, limpe a primeira gota de sangue usando papel absorvente limpo suavemente.
      3. Meça a glicose no sangue a partir da segunda gota (~ 4 μL) da veia da cauda com um glicosímetro portátil.
  2. Rastreando mudanças na glicose no sangue em jejum e tolerância à glicose durante o desenvolvimento de camundongos
    NOTA: Considerando que o primeiro ponto de tempo de amostragem de sangue é de 15 min, todos os camundongos precisam ser injetados em 15 min. Como cada injeção de camundongo levou de 20 a 30 segundos, para garantir que as injeções sejam concluídas dentro desse período, o número máximo de camundongos que podem ser usados em cada teste não pode exceder 30.
    1. Realize os testes de glicemia de jejum e tolerância à glicose a cada 4 semanas após o nascimento em camundongos em jejum noturno.
      1. No primeiro dia, prepare roupas de cama de aparas irradiadas frescas, gaiolas limpas, tampas e garrafas de água. Transfira os ratos para uma gaiola fresca sem comida. Adicione tags de não alimentação às gaiolas.
      2. Prepare uma injeção suficiente de glicose a 10% (estéril e sem pirogênio) e seringas de 1 mL.
      3. Certifique-se de que os ratos de cada grupo jejuem por 16 horas, das 17h00 do dia 1 às 9h00 do dia 2, mas permita o livre acesso à água. Meça os níveis de glicose no sangue em jejum conforme descrito nas etapas 3.1.1.1-3.1.1.3 usando um medidor de glicose.
    2. Pese os ratos e marque suas caudas para facilitar a identificação rápida. Prepare seringas de glicose com 10 μL / g de peso de camundongo.
    3. Em intervalos de 30 s, injete 10 μL / g de glicose na cavidade intraperitoneal do camundongo.
      NOTA: Atenção especial deve ser dada às técnicas de injeção aqui para evitar um volume de injeção de líquido impreciso. Os principais pontos de operação são os seguintes:
      1. Imobilize o mouse e prenda a cauda com uma mão. Mantenha a cabeça ligeiramente mais baixa que as nádegas para que os órgãos da cavidade abdominal se desloquem em direção à cabeça, deixando espaço suficiente para a injeção.
      2. Posicione a agulha entre a linha média e o osso do quadril, insira-a através da pele em um ângulo de 45 graus e, em seguida, guie suavemente a agulha mais fundo na cavidade abdominal, mantendo-a alinhada paralelamente à superfície da pele por ~0,5 cm.
        NOTA: Preste atenção a qualquer resistência durante a injeção para determinar se os órgãos internos foram perfurados acidentalmente.
      3. Ejete a seringa na cavidade abdominal.
      4. Registe a hora em que a injeção começou e utilize um temporizador para controlar a taxa de injeção. Defina o cronômetro para 90 s para três mouses para evitar perder tempo ao manusear o cronômetro.
    4. Faça a medição da glicose no sangue da veia da cauda nos intervalos desejados (0 antes da administração de glicose, 15, 30, 60, 90 e 120 min após a carga de glicose).
      NOTA: O teste de glicose no sangue subsequente também deve levar de 20 a 30 segundos para cada camundongo.
    5. Devolva os ratos às gaiolas de suas casas equipadas com comida e água após o experimento.

Resultados

Em nosso laboratório, alcançamos uma taxa de fertilização de 89,57% e uma taxa de 2 células de 87,38% usando ICSI com espermatozóides caudais epididimais em camundongos. A taxa de natalidade da prole após o TE é de aproximadamente 42,50%. Notavelmente, todas as taxas de fertilização, taxas de 2 células e taxas de natalidade da prole são comparáveis aos níveis alcançados na TARV humana, permitindo uma simulação abrangente de diferentes estágios das técnicas de TARV humana em camundongos. Mais detalhes são fornecidos na Tabela 1 e na Tabela 2. Não houve flutuação significativa nos níveis aleatórios de glicose no sangue entre camundongos nascidos naturalmente e camundongos ICSI durante o processo de crescimento e desenvolvimento (Figura 2). No entanto, camundongos ICSI machos mostraram níveis continuamente altos de glicose no sangue em jejum durante todo o experimento (Figura 3), indicando comprometimento da homeostase da glicose no sangue em jejum. Curiosamente, camundongos ICSI fêmeas não mostraram alterações em comparação com o grupo controle. No GTT, o nível de glicose no sangue mostrou mudança significativa entre camundongos ICSI machos e o grupo controle (Figura 4), e não houve essa diferença em camundongos fêmeas. Esses resultados sugeriram que a prole obtida usando a tecnologia ICSI pode sofrer de diabetes, e o resultado foi relacionado ao sexo. Embora os camundongos fêmeas não apresentassem o fenótipo de diabetes, o fenótipo de sobrepeso de camundongos ICSI machos e fêmeas foi consistente (Figura 5).

Usando o protocolo de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) descrito aqui, alcançamos altas taxas de fertilização e desenvolvimento embrionário em camundongos. Em um experimento representativo, 89,57% dos oócitos foram fertilizados após ICSI, como evidenciado pela formação de dois pronúcleos. Às 24 h após a ICSI, 87,38% dos zigotos se desenvolveram para o estágio embrionário de 2 células. Após a transferência de embriões para fêmeas receptoras, a taxa de natalidade de filhotes vivos foi de 42,50% (resultados positivos). Usando o protocolo otimizado de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) descrito aqui, geramos com eficiência descendentes de oócitos e espermatozoides de camundongos. É importante ressaltar que uma caracterização completa de animais derivados de ICSI revelou perturbações metabólicas na ausência de defeitos grosseiros de desenvolvimento.

Em comparação com os controles criados naturalmente, camundongos ICSI machos, mas não fêmeas, apresentaram homeostase de glicose prejudicada, evidenciada por glicose no sangue em jejum elevada (Figura 3) e tolerância à glicose reduzida em testes de tolerância à glicose intraperitoneal (Figura 4). Essas alterações podem resultar de deficiências de reprogramação durante a fertilização mediada por ICSI ou anormalidades genéticas / epigenéticas sutis incorridas durante a manipulação de espermatozoides.

Além disso, camundongos ICSI machos e fêmeas apresentaram aumento do peso corporal em comparação com os controles (Figura 5), sugerindo uma propensão à obesidade. Embora a técnica ICSI de camundongos modele de forma confiável os resultados de ICSI humanos, os fenótipos metabólicos observados ressaltam a necessidade de interpretar cautelosamente os resultados dos modelos animais de ICSI. A avaliação abrangente do crescimento, saúde e comportamento é fundamental para determinar a adequação dos camundongos ICSI para aplicações a jusante.

Em conjunto, esses dados ilustram a utilidade do protocolo ICSI de camundongos para gerar descendentes de forma eficiente para estudos, ao mesmo tempo em que destacam a importância de avaliar minuciosamente os resultados fenotípicos em animais derivados de ICSI. As anormalidades metabólicas específicas do sexo observadas neste exemplo ressaltam a necessidade de interpretação cuidadosa dos resultados dos modelos de camundongos ICSI.

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Figura 1: Diagrama da preparação da placa para injeção intracitoplasmática de espermatozóides em camundongos. A tampa da placa de cultura de células foi dividida em metades superior e inferior. A metade superior continha gotículas de solução de polivinilpirrolidona a 10% para colocação de espermatozoides. A metade inferior continha gotículas de meio M2 para a realização do procedimento de ICSI. Todas as gotículas foram cobertas com óleo mineral para evitar a evaporação. Essa configuração de placa permitiu a transferência sequencial de espermatozoides e oócitos entre gotículas de PVP e M2 para permitir o processo de ICSI. As áreas separadas impediram a mistura de meios durante o procedimento. Abreviaturas: ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides; PVP = polivinilpirrolidona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Níveis aleatórios semanais de glicose no sangue em camundongos controle (n = 5) e ICSI (n = 5) criados naturalmente durante o desenvolvimento pós-natal. Os níveis de glicose no sangue foram medidos semanalmente após jejum noturno da veia caudal de camundongos controle e ICSI usando um glicosímetro. Os dados são apresentados como média ± EPM. A significância estatística foi avaliada por meio de uma ANOVA de duas vias, ns, P > 0,05. Abreviaturas: SEM = Erro Padrão da Média; ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides; ns = não significativo; NM = acasalamento natural. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Níveis semanais de glicose no sangue em jejum no controle criado naturalmente (n = 7 para machos, n = 7 para fêmeas) e camundongos tratados com ICSI (n = 7 para machos, n = 7 para fêmeas) durante o desenvolvimento pós-natal. Após o jejum noturno, os níveis de glicose no sangue foram medidos semanalmente a partir da veia da cauda de camundongos controlados em jejum e tratados com ICSI usando um glicosímetro. Observou-se que camundongos machos tratados com ICSI, mas não fêmeas, exibiram níveis significativamente elevados de glicose no sangue em jejum em comparação com seus controles pareados por sexo a partir de 8 semanas de idade. Os dados são apresentados como média ± EPM. A significância estatística foi avaliada por meio de uma ANOVA de duas vias, ns, P > 0,05, *** P < 0,001, **** P < 0,0001). Abreviaturas: SEM = Erro Padrão da Média; ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides; ns = não significativo; NM = acasalamento natural. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Teste de tolerância à glicose intraperitoneal em camundongos machos criados naturalmente (n = 5) e tratados com ICSI (n = 5) às 16 semanas de idade. Após um jejum noturno, os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal de glicose (2 g / kg de peso corporal). Os níveis de glicose no sangue foram então medidos 0, 30, 60 e 120 minutos após a injeção. Camundongos machos tratados com ICSI exibiram níveis significativamente mais altos de glicose no sangue em 30, 60 e 120 minutos durante o IPGTT em comparação com o controle criado naturalmente. Os dados são apresentados como média ± EPM. As análises foram realizadas por meio de ANOVA de duas vias. ns, P > 0,05. *P < 0,05. Abreviaturas: IPGTT = Teste de tolerância à glicose intraperitoneal; EPM = Erro Padrão da Média; ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides; ns = não significativo; NM = acasalamento natural. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Rastreamento do peso corporal de controles criados naturalmente (n = 5 machos, n = 5 fêmeas) e camundongos tratados com ICSI (n = 5 machos, n = 5 fêmeas) de 4 a 20 semanas de idade. Medições semanais revelaram que camundongos machos e fêmeas tratados com ICSI exibiram peso corporal significativamente aumentado em comparação com seus controles pareados por gênero, começando com 8 semanas de idade. Os dados são apresentados como média ± EPM. As análises foram realizadas por meio de ANOVA de duas vias. P < 0,001. P < 0,0001. Abreviaturas: SEM = Erro Padrão da Média; ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides; ns = não significativo; NM = acasalamento natural. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

OvócitosZigotosTaxa de fertilização (%)de 2 célulasTaxa de 2 células (%)4-8 célulasTaxa de 4-8 células (%)MórulaTaxa de MorulaBlastocistosTaxa de blastocistos
Cauda espermatozoides ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
Cauda espermatozóide ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
Cauda esperma ICSI3605083.334284377432642856
Total23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

Tabela 1: Resultados de desenvolvimento após ICSI em camundongos. Abreviatura: ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides.

Não.Não. de embriões transferidosNão. de nascimento (%)MachoFêmeaTaxa de natalidade (%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
Total401710742.5

Tabela 2: Resultados do nascimento após transplante uterino de embriões de camundongos ICSI. Abreviatura: ICSI = injeção intracitoplasmática de espermatozoides.

Discussão

Este estudo integrou técnicas de injeção intracitoplasmática de espermatozóides de camundongos (ICSI) e transferência de embriões (ET) para recapitular de forma abrangente a tecnologia de reprodução assistida humana (ART) e examinar o impacto da ICSI em conjunto com o ET no desenvolvimento da prole. A aplicação da técnica ICSI com espermatozoides normais de camundongos proporcionou altas taxas de fertilização (86,76%) e 2 células (88,48%). Após o TE, a taxa de natalidade dos camundongos descendentes foi de aproximadamente 42,50%, indicando a robustez da plataforma técnica. O achado mais notável deste estudo foi a flutuação relacionada à idade nos níveis de metabolismo da glicose na prole de ICSI, o que pode ser atribuído à aplicação da técnica de ICSI6.

A observação de flutuações nos níveis do metabolismo da glicose constitui um achado notável neste estudo. Esse achado implica potenciais implicações de longo prazo da técnica ICSI na saúde da prole, especificamente em relação ao metabolismo da glicose7. Para elucidar as razões por trás desse fenômeno, realizamos um exame abrangente das etapas técnicas essenciais englobadas no procedimento ICSI. Descobrimos que o controle da temperatura de microinjeção (19 °C), a duração do corte do ultrassom (dentro de 5 s) e o volume do fluido de transferência (<0,5 cm) foram importantes para manter a viabilidade embrionária elevada e as taxas de implantação. O controle do efeito de sifão da pipeta de transferência surgiu como uma etapa crítica para a transferência precisa de embriões. Ao preparar a pipeta de transferência, garantir a uniformidade no diâmetro do tubo é fundamental para mitigar o efeito de sifão e controlar melhor o movimento do líquido dentro do tubo. Essa medida é fundamental para aumentar a taxa de sucesso e a precisão da transferência de embriões. Além disso, evitar a cultura in vitro prolongada e a superlotação durante a transferência de embriões também ajudou a melhorar a competência de desenvolvimento. Empregando protocolos otimizados, atingimos uma taxa de fertilização de 86,76% e uma taxa de natalidade de 42,50% após o TE, sugerindo que o procedimento de ICSI em si não prejudicou inerentemente a viabilidade. Portanto, as flutuações no metabolismo da glicose foram mais plausivelmente associadas a alterações intracelulares sutis induzidas pelo processo de TARV do que a danos evidentes ao embrião.

Embora a TARV seja amplamente considerada segura, evidências crescentes indicam que mesmo a prole aparentemente normal da TARV pode apresentar vários riscos à saúde mais tarde na vida devido às características reprodutivas não naturais e aos períodos críticos de intervenção durante o desenvolvimento de gametas e embriões 5,8,9,10,11,12,13 . Nossas descobertas fornecem novos insights sobre os potenciais efeitos metabólicos da TARV e destacam a necessidade de mais estudos sobre os impactos de longo prazo da TARV na saúde da prole14.

É essencial reconhecer que este estudo empregou um modelo murino; consequentemente, os resultados podem não ser diretamente transferíveis para seres humanos. No entanto, dados os paralelos biológicos substanciais entre camundongos e humanos, esses achados mantêm um significado referencial considerável15. Além disso, é importante reconhecer que os pacientes submetidos a ICSI na prática clínica geralmente apresentam anormalidades espermáticas. Por outro lado, este estudo utilizou camundongos normais para procedimentos de ICSI, faltando dados sobre a prole de ICSI de camundongos com anormalidades espermáticas. No entanto, é razoável antecipar que as anormalidades espermáticas teriam um impacto mais profundo nos efeitos a longo prazo da técnica ICSI. Assim, os resultados deste estudo mantêm um mérito referencial notável.

Outra limitação do nosso estudo é a discrepância metodológica entre nosso modelo de camundongo e as práticas clínicas humanas na imobilização de espermatozoides. Na aplicação clínica da ICSI, é prática comum imobilizar o esperma humano interrompendo fisicamente a cauda com uma micropipeta. No entanto, em nossos experimentos com modelos de camundongos, empregamos o corte ultrassônico da cauda para preparar o esperma, um método usado rotineiramente na manipulação embrionária de camundongos. Reconhecemos que essa abordagem pode inadvertidamente introduzir variabilidade e viés potencial no modelo, especialmente considerando os possíveis danos à integridade e função do esperma que o ultrassom pode causar. Essa diferença metodológica pode limitar a traduzibilidade direta de nossos achados. Em nosso trabalho futuro, planejamos explorar o uso de micropipetas para interromper as caudas do esperma de camundongos. Esse ajuste visa minimizar quaisquer efeitos não intencionais no esperma e replicar melhor as condições e resultados observados em procedimentos de ICSI em humanos. Estamos comprometidos em melhorar continuamente nossas práticas de pesquisa para aumentar a relevância clínica de nossas descobertas.

Com base na plataforma tecnológica acima mencionada, em pesquisas futuras, investigaremos ainda mais o impacto da técnica ICSI em outros aspectos da saúde da prole, como a saúde cardiovascular e o sistema imunológico. Além disso, estudos de acompanhamento de longo prazo também são imperativos para entender de forma abrangente os efeitos de longo prazo da ICSI.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Plano de Projeto Principal do Fundo Especial de Desenvolvimento para a Zona Nacional de Demonstração de Inovação Independente de Xangai Zhangjiang (ZJ2022-ZD-006), Projeto de Financiamento Direcionado da Comissão Municipal de Ciência e Tecnologia de Xangai (22DX1900400), Programa Juvenil da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (20204Y0276). a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070849).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,25% de avertin (2,2,2-tribromoetanol)Nanjing AibeiM2960para anestesia
Placas de Petri bacteriológicas estilo 35 x 10 mm com tampa estanque, poliestireno virgem de grau cristalino, estérilBD353001
Placas de Petri Bacteriológicas estilo 50 x 9 mm com tampa hermética, poliestireno virgem de grau cristalino, estérilBD351006
Armário de BiossegurançaESCOclass figure-materials-1 BSCOperações assépticas, fabricação de pratos de cultura, alíquotas de reagentes, etc.
Incubadora de CO2Thermo8000DHMicroscópio
Dissecção de Cultura de EmbriõesOlympusSZX16Uso na transferência de embriões de camundongos
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 é um líquido totalmente fluorado termicamente estável com alta rigidez dielétrica e resistividade, usado como glicosímetro portátil de fluido operacional
RocheAccuChek performaBlood medição de glicose
HTFMerckMR-070-DO Fluido Tubário Humano EmbryoMax (HTF) (1x), líquido projetado para uso com fertilização in vitro de camundongo, está disponível em um formato de 50 mL e foi otimizado e validado para cultura de embriões.
Microinjetor HidráulicoEppendorfCellTram 4r Óleo, 5196000030Para injeção de esperma
Microscópio InvertidoNikonTI2-UHost de observação de micromanipulação
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Pó, sem Vermelho de Fenol, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Médio (1x), Líquido, com Micromanipulador de Vermelho de Fenol
NARISHIGENTX-N4Óleo mineral para braço de micromanipulação
SIGMAM8410é adequado para uso como camada de cobertura para controlar a evaporação e a contaminação cruzada em várias aplicações de biologia molecular.
Cortador de agulhasNanjing AibeiSutter MF-800Uso para fabricação de agulhas de micromanipulação
Extrator de agulhasNanjing AibeiSutter modelo p-100Uso para fazer agulhas de micromanipulação
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Aplicação da agulha de injeção ICSI.
Micromanipulador piezoelétrico (quebrador de membrana)EppendorfEppendorf PiezoXpertUso de micropulsos para quebrar a zona pelúcida e o oolema do oócito
Microinjetor pneumáticoEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Para fixar o oócito
Gonadotrofina Coriônica Humana (Hcg)Nanjing AibeiM2520Reagente de esterilização, injeção intraperitoneal. 50 UI/mL
Gonadotrofina sérica de égua grávida pronta para uso (PMSG)Nanjing AibeiM2620Reagente de esterilização, injeção intraperitoneal. 50 UI/mL
EstereomicroscópioOlympusSZX7Recuperação de oócitos e observação do desenvolvimento embrionário
de O óleo mineral

Referências

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