O foco deste artigo é detalhar as melhores práticas para a fabricação de meios para microrganismos anaeróbios fastidiosos adquiridos de um ambiente. Esses métodos ajudam a gerenciar culturas anaeróbias e podem ser aplicados para apoiar o crescimento de microrganismos indescritíveis não cultivados, a "matéria escura microbiana".
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Artigo de método
Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pesquisa de microrganismos anaeróbios dependente da cultura baseia-se na competência metodológica. Esses métodos devem criar e manter condições adequadas de crescimento (por exemplo, pH e fontes de carbono) para microrganismos anaeróbios, ao mesmo tempo em que permitem que as amostras sejam extraídas sem comprometer o ambiente artificial. Para isso, métodos que são informados e simulam um ambiente in situ podem ser de grande auxílio na cultura de microrganismos desse ambiente. Aqui, delineamos um método anaeróbio informado e simulado in situ para cultivo de microrganismos terrestres superficiais e subsuperficiais, enfatizando a coleta de amostras anaeróbias com o mínimo de perturbação. Este protocolo detalha a produção de um meio líquido anaeróbio personalizável, a aquisição ambiental e o crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios. O protocolo também abrange componentes críticos de um biorreator anaeróbio usado para simulações ambientais de sedimentos e meios líquidos anaeróbios para culturas ambientalmente adquiridas. Incluímos dados preliminares de sequenciamento de próxima geração de um microbioma mantido ao longo da vida útil de um biorreator onde a cultura ativa se ajustou dinamicamente em resposta a uma fonte de carbono experimental.
Introdução
A maioria dos microrganismos permanece sem cultura; Isto é suportado pela grande disparidade entre as células observada através da microscopia contrastada pelos poucos microrganismos cultivados com sucesso usando placas de ágar. Staley e Konopka chamaram essa disparidade de "Anomalia da Grande Contagem de Placas"1. A diversidade estimada não contabilizada é suportada por dados metagenômicos e metatranscriptômicos mostrando muitos gêneros novos distribuídos em curvas de abundância de postos de vários ambientesdiferentes 2. Microrganismos que têm sido observados (geralmente por sequenciamento aleatório de uma comunidade microbiana), mas não foram cultivados, têm sido referidos como "matéria escura microbiana"3,4.
Na era da -ômica, a cultura de microrganismos continua sendo imperativa para avaliar completamente os dados genômicos e verificar a função/fenótipo dos genes presentes. O sequenciamento de microrganismos cultivados ainda é a única maneira de obter genomas completos com confiança até que tecnologias como a metagenômica shotgun e genomas montados em metagenomas do ambiente se tornem admissivelmente infalíveis5. Avaliações genômicas juntamente com microrganismos cultivados fornecem fortes inferências para a compreensão da "matéria escura microbiana". Muitos membros da "matéria escura microbiana" desempenham funções cruciais que afetam a ciclagem de nutrientes e outros elementos e a produção de produtos naturais valiosos, apoiam sistemas ecológicos e executam serviços ecológicos. Do ponto de vista médico, cerca de metade de todos os produtos farmacêuticos atualmente comercializados são produtos e derivados de produtos de bactérias, e suspeita-se que o perfil de espécies não cultivadas revele os antibióticos do futuro. Para ter acesso a essa maioria inculta, uma variedade de metodologias de cultivo deve ser aumentada6. Entre os membros da "matéria escura microbiana", os microrganismos anaeróbios oligotróficos são amplamente subnotificados e provavelmente possuem vias bioquímicas ecológica e industrialmente valiosas7, tornando-os importantes alvos de cultivo. No entanto, microrganismos oligotróficos anaeróbios são mais difíceis de cultivar do que seus homólogos aeróbios e copiotróficos devido a tempos de incubação mais longos frequentemente exigidos, condições fastidiosas (por exemplo, temperaturas in vitro não padronizadas específicas) e o uso de receitas de meios especializados.
As técnicas atuais de desenvolvimento para cultivar membros da "matéria escura microbiana", incluindo novos microrganismos anaeróbios oligotróficos, melhoraram muito nossa compreensão e aumentaram a representação desses microrganismos dentro da árvore filogenética. As técnicas atuais que utilizam meios informados para o cultivo de novos microrganismos (isto é, meios derivados do conhecimento do(s) microrganismo(s) de interesse) podem ser separadas em três métodos distintos. O primeiro dos métodos envolve a remoção direta de uma seção discreta do ambiente para transferência para uma câmara de crescimento in vitro que já contém os microrganismos de interesse dentro de uma membrana. A seção discreta (por exemplo, água do mar) atua para fornecer aos microrganismos de interesse o habitat geoquímico que eles usam in situ, enquanto a membrana interrompe o movimento das células através (células de interesse permanecerão dentro; células estranhas que chegaram com a seção discreta permanecerão sem). Ao incluir compostos naturalmente disponíveis para atingir microrganismos em seu habitat natural, tais microrganismos podem ser cultivados8. O segundo método utiliza metatranscriptômica ou genômica para elucidar capacidades metabólicas, fornecendo pistas para parâmetros de cultivo estreitos para um planejamento de meio alvo. Esta abordagem fornece um perfil eco-fisiológico que pode ser usado para direcionar o enriquecimento de tipos específicos de microrganismos fora de um ambiente. As provisões do meio são atendidas para os genes identificados presentes que se presume suportarem o(s) microrganismo(s) alvo(s) para reduzir a diversidade de enriquecimento9,10. Uma ressalva é que a informação genômica não infere diretamente a expressão dos genes, enquanto a informação transcriptômica infere.
O terceiro método engloba mídias ambientalmente informadas e simuladas, distintas do primeiro, que não simula as mídias, mas utiliza diretamente o ambiente como fonte de mídia. Este terceiro método requer o reconhecimento ambiental da geoquímica de um local de campo contendo microrganismos de interesse. Com esse conhecimento, componentes primários e parâmetros físicos são identificados para produzir um meio simulado ambientalmente informado. O meio então recebe uma infusão direta de sedimento ou líquido contendo microrganismos do ambiente para o meio. Este método é particularmente valioso nos casos em que o microbiologista de cultura não tem acesso a quantidades suficientes de ambiente de origem (conforme necessário para o primeiro método) nem a dados metatranscriptômicos ou genômicos apropriados (conforme necessário para o segundo).
O protocolo a seguir é um exemplo do terceiro método; É informado e tem como objetivo simular ambientes de interesse. Três receitas de meios ingênuos visando diferentes culturas de microrganismos anaeróbios adquiridas no campo são apresentadas em paralelo dentro do protocolo. As três culturas representadas são culturas mistas originárias do solo (doravante, cultura mista de solo), culturas mistas originárias de um poço (doravante, cultura mista de poço) e um metanogênio isolado originário de um poço (doravante, metanogênio isolado de poço). As identidades e quantidades compostas nas receitas de mídia compartilhadas aqui são destinadas como um guia inicial; eles são capazes e incentivados a serem personalizados para o ambiente do leitor e microrganismos de interesse.
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Protocolo
1. Produção de meio líquido anaeróbio personalizável
- Meio para frascos de cultura (produção de 500 mL)
- Medir e adicionar compostos a um frasco de 1 L e ajustar o pH usando a coluna na Tabela 1 correspondente à cultura de interesse do leitor (as quantidades na Tabela 1 são registradas para a produção de 1.000 mL, ajustar de acordo). Misture os compostos até homogeneizar girando o frasco.
- Aqueça o líquido até ferver por micro-ondas na garrafa por 5-6 min. Abra o micro-ondas com frequência e gire o líquido suavemente usando uma luva resistente ao calor. Abra o micro-ondas rapidamente se o líquido ficar parado depois de borbulhar; caso contrário, o líquido pode rapidamente se expandir e transbordar a garrafa.
- Anexar uma pipeta de vidro estéril de 10 mL a uma configuração de coletor de gás N2 (com base no projeto de Balch et al.11, embora não exija uma coluna de cobre aquecida para o gás N2 de pureza; consulte Arquivo Suplementar 1 para obter mais informações sobre coletores de gás). Abra o coletor para ventilar O2 e permitir que o gás N2 flua.
- Coloque a ponta da pipeta no líquido e ajuste o fluxo de gás para que as bolhas sejam moderadamente vigorosas. Lave o líquido com N2 até que o frasco não esteja mais muito quente para tocar.
Observação : isso depende do conteúdo da mídia, mas geralmente leva ~ 20 min. - Enquanto espera o frasco esfriar, coloque 10 frascos estéreis de cultura de 100 mL; ou, se preparar meios para coleta de cultura mista de solo, colocar dois frascos estéreis de 500 mL.
- Quando a garrafa de mídia estiver fria ao toque, puxe a ponta da pipeta para cima no headspace da garrafa. Adicione 0,125 g de NaHCO3 e 0,300 g de Na2S∙9 H2O e aguarde até que a resazurina fique incolor.
CUIDADO: Na2S∙9 H2O é corrosivo, tóxico e irritante. Use equipamentos de proteção individual ao manusear e enxágue bem as ferramentas metálicas após o contato. - Enquanto espera que a resazurin mude de cor, prenda cânulas de metal à configuração do coletor de gás e coloque as pontas da cânula em garrafas de cultura. Ajuste o fluxo de N2 para dentro das garrafas a uma taxa moderada, para que o líquido adicionado na etapa subsequente não perca devido ao fluxo de gás.
- Uma vez que a resazurina é incolor, alíquota 50 mL de líquido em cada frasco de cultura ou 250 mL de líquido em cada frasco de 500 mL.
- Tampe cada frasco com uma rolha de borracha do tamanho de um fósforo imediatamente após a remoção das cânulas. Fixe a rolha com um selo de alumínio (para frascos de cultura) ou uma tampa de rosca aberta GL45 (para frascos de 500 mL).
- Coloque as garrafas em uma lixeira autoclavável e encha a lixeira com água da torneira até que os níveis de água correspondam aos das garrafas.
NOTA: Isso garantirá que os frascos não se rompam devido ao estresse causado por diferenciais de temperatura no vidro durante a autoclavagem. - Autoclave os frascos a 121 °C por 30 min.
- Meio para biorreator (produção de 8 L)
- Preparação do garrafão
- Abra a válvula de uma válvula de esfera de farpa de mangueira de 1/4" (6,4 mm). Conecte dois comprimentos de 6 cm de diâmetro interno (ID) de 1/4" (6,4 mm) e 1/2" (12,7 mm) de diâmetro externo (OD) em cada extremidade da válvula de esfera de farpa da mangueira.
- Conecte a uma extremidade do conjunto um encaixe de adaptador de farpa de mangueira de 5/16"-1/4" (7,9 mm-6,4 mm). Fixe a outra extremidade do conjunto à farpa da mangueira de um garrafão de 8 L.
- Use uma gravata zip para proteger a conexão entre a farpa da mangueira do garrafão e a tubulação, e a conexão entre o encaixe do adaptador da mangueira e a tubulação.
- Autoclave o garrafão com montagem a 121 °C por 30 min.
- Produção média
- Feche a válvula da válvula de esfera de farpa da mangueira no conjunto de garrafão de 8 L.
- Medir e adicionar compostos ao garrafão de 8 L e ajustar o pH usando a coluna na Tabela 1 correspondente à cultura de interesse do leitor (as quantidades na Tabela 1 são registradas para a produção de 1.000 mL, ajustar de acordo). Adicione uma barra de agitação e use uma placa quente agitada para misturar os compostos até homogeneizar.
- Aqueça o líquido até ferver com a placa quente agitada. Deixe o líquido ferver por 30 min.
NOTA: O aquecimento do líquido para ferver depende do conteúdo do meio, mas pode levar 2-3 h. - Anexar uma pipeta de vidro estéril de 10 mL a uma configuração de coletor de gás N2 (com base no projeto de Balch et al.11, embora não exija uma coluna de cobre aquecida para o gás N2 de pureza; consulte Arquivo Suplementar 1 para obter mais informações sobre coletores de gás). Abra o coletor para ventilar O2 e permitir que o gás N2 flua.
- Desligue o fogo, coloque a ponta da pipeta no líquido e ajuste o fluxo de gás para que as bolhas sejam moderadamente vigorosas, mas não transbordem. Lave o líquido com N2 por 30 min.
- Puxe a ponta da pipeta para cima no headspace do garrafão. Adicione 2,0 g de NaHCO3 e 4,8 g de Na2S∙9 H2O e aguarde até que a resazurina fique incolor.
CUIDADO: Na2S∙9 H2O é corrosivo, tóxico e irritante. Use equipamentos de proteção individual ao manusear e enxágue bem as ferramentas metálicas após o contato. - Uma vez que a resazurina esteja incolor, remova a pipeta de vidro e tampe imediatamente o garrafão com uma rolha #10. Torça um fio sobre a rolha e ao redor do lábio do garrafão para prender a rolha.
- Preparação do garrafão
2. Aquisição in situ de microrganismos anaeróbios ambientais
- Aquisição de amostras anaeróbias superficiais (cultivo misto de solo)
- Traga a(s) garrafa(s) de meio de cultura de solo misto feito como acima e um corer para o campo.
NOTA: Um bit de solo de conicidade padrão Giddings 2 5/8" é usado pelos autores (Tabela de Materiais). No entanto, qualquer corer de solo ou espátula que possa coletar amostras até a profundidade desejada pode ser usado. - Empurre (acionamento de estaca/estaca) o corer no sedimento até que o topo do cilindro de coleta de amostras esteja nivelado com a superfície do sedimento.
- Torça o corer 90° para liberar o núcleo e puxe para cima até que a amostra seja extraída do ambiente.
- Em sedimentos soltos (como o que pode ser encontrado ao coletar amostras de áreas úmidas), cubra a base do núcleo com uma nova mão enluvada de nitrilo à medida que está sendo extraída para evitar que a amostra caia ou se espalhe na água na extração.
- Aproximar-se rapidamente pelo olho 6-7 cm acima da base do núcleo. Use uma nova mão enluvada de nitrilo para cortar no núcleo e separar o fundo 6-7 cm.
- Transfira imediatamente o fundo do núcleo para a garrafa de cultura. Se o solo/sedimento for muito grande, forme-o rapidamente para caber na garrafa mais facilmente, minimizando ao máximo a exposição à atmosfera aeróbica.
- Uma vez que a amostra é transferida, reposicione imediatamente a rolha e segure-a no lugar com uma tampa de rosca.
- Mantenha a amostra fresca. Refrigerar o frasco de recolha a 4 °C no regresso ao laboratório.
- Traga a(s) garrafa(s) de meio de cultura de solo misto feito como acima e um corer para o campo.
- Aquisição de amostras anaeróbias subsuperficiais (cultura mista de poço)
- Coloque uma garrafa estéril de 1 L junto ao coletor de gás. Tampe a garrafa com uma rolha de borracha. Pinge 100% de etanol na rolha e ateie fogo usando um isqueiro.
- Conecte uma agulha estéril de 23 G à configuração do coletor de gás N2 . Abra o coletor para ventilar O2 e permitir que o gás N2 (ou Ar) flua a uma taxa moderada.
- Quando a rolha não estiver mais em chamas, insira a agulha no frasco. Introduza no frasco uma segunda agulha estéril de 23 G não ligada ao coletor de gás. Lave a garrafa por 1-2 min.
- Extrair a agulha não ligada ao coletor de gás. Pressurize o frasco por 1 min. Extrair a agulha restante.
- Leve o frasco pressurizado e uma agulha esterilizada de 23 G para o local do furo. Retirar líquido do poço seguindo os métodos de Merino et al.12.
NOTA: Dependendo do método, conexão e vazão do poço, isso altera a estratégia de aquisição de uma amostra de água. Se houver um fluxo contínuo de água, coletar água conforme descrito na etapa 2.2.6. será suficiente. Se o fluxo de água for coletado em lote ou de baixa vazão, um método alternativo de entrada/saída pode ser usado. Em todas as situações, minimizar a contaminação e tentar garantir que a amostra coletada seja representativa do ambiente desejado. Esta é uma afirmação amplamente generalizada porque tem sido experiência dos autores que cada evento de coleta de amostras de sites governamentais ou privados tinha que ser altamente adaptável à acessibilidade disponível. - Abra rapidamente o frasco, bombeie o líquido para enchê-lo totalmente e feche o frasco.
- Insira a agulha de 23 G que foi trazida para o local na rolha de borracha do frasco para aliviar a pressão no frasco. Extraia a agulha.
- Mantenha a amostra fresca. Refrigerar o frasco de recolha a 4 °C no regresso ao laboratório.
3. Crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios adquiridos no campo
- Crescimento por garrafa de cultura
- Defina um frasco estéril com rolha de N2 e os frascos de cultura e garrafa de coleta preparados como acima. Pingar 100% etanol nas rolhas e ateá-las fogo usando um isqueiro.
- Montar uma agulha de 23 G numa seringa de 1 ml. Quando as rolhas não estiverem mais em chamas, insira a agulha no frasco de N2 e retire ~1 mL de N2. Extraia a agulha.
- Pressione lentamente o êmbolo para soltar o N2. Assim que a seringa estiver vazia, introduza a agulha no frasco de recolha e retire 0,5 ml da amostra ambiental. Extraia a agulha.
- Insira a agulha no frasco de cultura e injete a amostra. Extraia a agulha.
- Gire o frasco e coloque-o em uma incubadora à temperatura, conforme informado pela Tabela 1 ou pelo ambiente de interesse do leitor.
NOTA: O progresso da cultura (frasco ou biorreator) é monitorado usando um hemocitômetro de Petroff-Hauser de 0,02 mm de profundidade. O enriquecimento de microrganismos anaeróbios ou fastidiosos normalmente não atinge densidades celulares onde OD600 é utilizável, e outros métodos de detecção são impraticáveis para monitoramento rotineiro e repetitivo. Os limites de detecção, o controle de qualidade e os cálculos estatísticos dependem do tipo de câmara de contagem de células e das necessidades do usuário.
- Crescimento por biorreator
- Preparação de um balão com uma seringa modificada
- Retire o êmbolo de três seringas luer lock de 10 mL (uma para cada montagem final). Corte a flange de cada seringa e lime a extremidade cortada para que não perfure os balões. Limpe todos os chips arquivados da seringa modificada.
- Prepare um balão duplo colocando um balão dentro de outro.
- Esticar a extremidade do balão duplo sobre a seringa modificada de 10 mL.
- Separe ligeiramente a extremidade do balão externo do balão interno. Esprema todo o ar preso entre os balões.
- Aperte uma gravata em torno da base dos balões para prender os balões à seringa.
- Preparação de uma rolha modificada
- Retire os êmbolos de dez seringas luer lock de 1 mL (duas para cada rolha a ser modificada). Corte a flange das seringas.
- Defina duas rolhas de borracha tamanho #10 (para garrafões de 8 L) e três tamanhos para garrafas com acabamento de rosca GL45 (para garrafas de captura). Usando uma broca de 1/4" (6,4 mm), faça dois furos na parte superior de cada rolha de borracha com largura suficiente para que as seringas modificadas caibam e se ajustem o suficiente para que o ajuste seja hermético.
- Introduza as seringas modificadas através dos orifícios da rolha de borracha.
- Limpar e autoclavar a rolha modificada a 121 °C durante 30 minutos.
- Preparação da montagem do biorreator
- Desinfetar com etanol 70% todas as torneiras, conectores adaptadores fêmeas de bloqueio luer e outros materiais de biorreatores não autoclaváveis, e autoclave a 121 °C por 30 min todos os tubos (após corte no comprimento), rolhas, lã de vidro e outros materiais de biorreatores autoclaváveis.
- Coloque um biorreator estéril (Figura 1 e Figura 2) em um suporte de anel e fixe-o com uma cinta de corrente. Estabeleceu-se também um banho-maria, uma bomba peristáltica, o garrafão de 8 L com tampa contendo meio (a partir da etapa 1.2 do protocolo), um frasco de 3,5 L (frasco de captura sem amostragem) e um frasco de 500 mL (garrafa de captura de amostragem).
- Tapando o garrafão
- Coloque um balão com uma seringa modificada. Conecte uma torneira de três vias à ponta de bloqueio da seringa.
- Pegue o conjunto do balão e conecte a torneira de três vias à tubulação de um tanque de N2. Vire a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera.
- Abra o tanque de gás e encha o balão com N2. Uma vez cheio, gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade do balão. Feche o tanque de gás e desconecte a tubulação do tanque da torneira de três vias.
- Conecte o seguinte em sequência: uma torneira de três vias (do balão com a seringa modificada), uma torneira bidirecional, um acoplador adaptador de bloqueio luer fêmea e a ponta de bloqueio luer de uma das seringas modificadas da rolha.
- À ponta de bloqueio da outra seringa, conecte uma torneira bidirecional. Feche ambas as válvulas das torneiras bidirecionais no conjunto modificado da rolha.
- Destorça o fio que segura a rolha #10 do garrafão tamanho não modificado. Substitua rapidamente a rolha não modificada pelo conjunto de rolha modificado e torça o fio como antes para fixar o conjunto de rolha modificado ao garrafão.
NOTA: Se estiver confiante e preparado, o conjunto de rolha modificado pode ser utilizado para rolha o garrafão na etapa final da preparação média (etapa 1.2.2.7). - Vire a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera. Abra a torneira bidirecional em sequência. O gás do balão e o headspace do garrafão de 8 L agora estão conectados.
- Tampa das garrafas de captura sem amostragem e amostragem
- Rolha a garrafa de captura sem amostragem de 3,5 L com uma rolha modificada dimensionada para garrafas com acabamento de rosca GL45, aplicando etanol 70% na base da rolha para ajudar a encaixá-la na garrafa. Tampe o frasco com uma tampa de rosca aberta GL45.
- Conecte o seguinte em sequência: um balão com a ponta de bloqueio luer da seringa modificada, uma torneira de três vias, um acoplador adaptador de bloqueio luer fêmea e a ponta de bloqueio luer de uma das seringas modificadas da rolha. Gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta diretamente para a atmosfera.
- À ponta de bloqueio luer da outra seringa, conecte um acoplador adaptador luer lock fêmea.
- Repita os três passos acima para o frasco de recolha de amostras de 500 ml.
- Configuração da tubulação
- Meça a distância entre as portas da camisa d'água do biorreator e as farpas da mangueira de banho-maria. Corte dois comprimentos de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância.
- Monte dois conectores de mangueira retos com tampas de rosca de topo aberto GL14. Fixe cada uma delas a uma das duas extremidades das duas tubulações.
- Torça as tampas de rosca nas portas da camisa de água do biorreator. Fixe as outras extremidades da tubulação às farpas da mangueira de banho-maria para que a água flua para fora do banho-maria, entre na parte inferior da camisa d'água do biorreator, saia na parte superior da camisa d'água e retorne ao banho-maria. Aperte as amarras de zíper ao redor das extremidades da tubulação para prender a tubulação às farpas da mangueira de banho-maria.
- Para bombas semelhantes à Minibomba de Fluxo Variável VWR Ultra Low Flow, rosqueie o conjunto de tubos com fenda OD de 3/16" (4,8 mm) que o acompanha através da bomba.
- Meça a distância entre o conjunto da tubulação do garrafão e o conjunto da tubulação da bomba peristáltica. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância.
- Fixe uma extremidade da tubulação à farpa da mangueira do conjunto da tubulação do garrafão e a outra à farpa da mangueira do conjunto da tubulação da bomba peristáltica, orientada de modo que o meio flua do garrafão e através da bomba peristáltica.
- Meça a distância entre o conjunto da tubulação peristáltica da bomba e a porta inferior do biorreator. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância.
- Conecte uma extremidade desta tubulação à farpa da mangueira do conjunto da tubulação da bomba peristáltica e prenda cuidadosamente a outra à porta inferior do biorreator. Tomando cuidado para não quebrar o vidro, mas também para prender a conexão, aperte uma gravata em torno da extremidade da tubulação para prender a tubulação à porta inferior do biorreator.
- Meça e corte aproximadamente 5" (127mm) de comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD.
- Conecte um conector adaptador de bloqueio luer fêmea a uma torneira de três vias. Fixe qualquer extremidade da torneira de três vias à tubulação.
- Monte um conector de mangueira angulado com tampa de rosca aberta GL14. Fixe-o na outra extremidade da tubulação.
- Torça a tampa de rosca na porta vertical superior do biorreator. Gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade apontando para o biorreator.
- Meça a distância entre o conjunto de porta vertical mais superior e o conjunto de garrafas de captura sem amostragem. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância. Corte as flanges de duas seringas luer lock de 1 mL e insira-as nas extremidades da tubulação.
- Conecte uma extremidade deste conjunto de tubulação à torneira de três vias do conjunto de porta vertical mais superior e conecte a outra extremidade ao conector do adaptador de bloqueio luer fêmea no conjunto de garrafas de captura sem amostragem.
- Meça a distância entre o conjunto de porta vertical mais superior e o conjunto de garrafas de captura de amostragem. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância. Corte as flanges de duas seringas luer lock de 1 mL e insira-as nas extremidades da tubulação.
- Conecte uma extremidade deste conjunto de tubulação à torneira de três vias do conjunto de porta vertical mais superior e conecte a outra ao conector do adaptador de bloqueio luer fêmea no conjunto da garrafa de captura de amostragem.
- Enchimento do biorreator
- Tampe uma das portas GL18 do biorreator com um septo de borracha branca. Tampar a outra porta GL18 e as demais portas GL14 expostas verticalmente com septos de silicone (PTFE voltados para o vidro) e tampas de parafuso superiores abertas do tamanho GL18/GL14.
- Com uma haste de 50 cm de comprimento, embale 0,9 g de lã de vidro na base do biorreator.
- Autoclave 1,3 L de areia a 121 °C por 30 min. Encha o biorreator com a areia usando um funil.
NOTA: Outros tipos de sedimentos informados pelo ambiente do leitor e microrganismos de interesse podem ser substituídos aqui. - Coloque a tubulação em um tanque de N2 na parte superior do biorreator e lave o headspace do biorreator com N2 por 2 min. Tampar imediatamente o biorreator com uma rolha de tamanho #7 e uma tampa de rosca aberta GL45.
- Da garrafa de captura sem amostragem, desconecte a tubulação e gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade apontando para o balão. Conecte a tubulação a um tanque de N2 ao conector adaptador de bloqueio luer fêmea e lave o headspace do biorreator com N2 por 2 min. Reconecte imediatamente a tubulação e devolva a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera.
- Repita o passo acima para o frasco de captura de amostragem.
- Gire a torneira de três vias da porta vertical mais alta do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura de amostragem. Bombeie o líquido do garrafão para o biorreator. Pause a bomba, ventile o balão da garrafa de amostragem e encha o balão do garrafão com N2 , conforme necessário.
- Uma vez que o biorreator tenha sido preenchido com o meio, ajuste a vazão da bomba para 0,6 mL/min (valor digital de 40 na Mini-Bomba).
NOTA: Outras vazões desejadas pelo leitor podem ser substituídas aqui. - Defina a temperatura do banho-maria, conforme informado pela Tabela 1 ou pelo ambiente de interesse do leitor.
NOTA: O inóculo pode ser adicionado neste ponto ou mais tarde, dependendo das especificidades do estudo. Se estiver a ser inoculado neste momento, avance para o passo 3.2.4.10. Se inocular mais tarde, avance para o passo 3.2.5. - Definir um frasco de recolha ou frasco de cultura inoculado e um frasco estéril com rolha de N2. Pingar 100% etanol nas rolhas e ateá-las fogo usando um isqueiro.
- Montar uma agulha de 23 G numa seringa de 60 ml. Quando as rolhas não estiverem mais em chamas, insira a agulha no frasco de N2 e retire ~50 mL de N2. Extraia a agulha.
- Pressione lentamente o êmbolo para soltar o N2. Assim que a seringa estiver vazia, introduza a agulha no frasco de recolha e retire 50 ml da amostra ambiental. Extraia a agulha.
- Troque a agulha 23G por uma agulha longa estéril de metal (cânula, comprimento 31,5 cm). Insira a agulha longa de metal através do septo de borracha branca na porta GL18 do biorreator.
- Empurre a agulha para dentro do sedimento e injete o inóculo. Extraia a agulha.
- Manutenção de biorreatores em execução
- A cada dia que o biorreator estiver funcionando, realize o seguinte:
- Verifique o nível do banho-maria. Se estiver baixo, adicione mais água (use água destilada para a longevidade do equipamento, reduzindo a corrosão e o acúmulo de minerais).
- Verificar o balão da garrafa de captura sem amostragem; Um balão cheio inibirá o fluxo do meio. Quando estiver cheio, gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura. Aperte o balão para esvaziá-lo; em seguida, devolva a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera; Repita até que o balão esteja vazio.
- Confira o balão do garrafão de 8 L. Se estiver baixo, feche a torneira bidirecional em sequência e desconecte a torneira de três vias da torneira bidirecional. Recarregue e volte a ligar o conjunto do balão seguindo os passos 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 e 3.2.3.3.7.
- Verifique o nível do meio no garrafão de 8 L. Se estiver baixo, montar outro garrafão de 8 L e preparar mais médio seguindo os passos do protocolo 1.2. e 3.2.3.3. Pause a bomba, feche a válvula de esfera de farpa da mangueira, desconecte rapidamente o garrafão antigo e conecte o novo garrafão.
OBS: Para uma vazão de 0,6 mL/min, será necessário novo meio a cada 9 dias. - Verifique o nível do meio na garrafa de captura não amostral. Se estiver cheia, montar outra garrafa de captura sem colheita de amostras de acordo com o passo 3.2.3.4.1. Lave o novo frasco com N2, desconecte rapidamente o balão com a seringa e tubulação modificadas do frasco antigo e conecte-o ao novo frasco.
- Retire a rolha modificada de uma garrafa de captura completa sem amostragem. Autoclave o líquido a 121 °C por 30 min; em seguida, dispor do líquido de acordo com as políticas institucionais do leitor. Limpe e autoclave todas as peças do conjunto de garrafas de captura sem amostragem para prepará-las para o próximo uso.
- Realize a amostragem a cada 7 (ou número desejado pelo leitor) dias fazendo o seguinte:
- Gire a torneira de três vias da porta vertical superior do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura sem amostragem. Coletar 250 mL de líquido.
NOTA: Para uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, a coleta de 250 mL levará ~7 h. - Retorne a torneira de três vias da porta vertical superior do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura de amostragem. Desconecte a tubulação e a garrafa de captura de amostragem da torneira de três vias da porta vertical mais alta do biorreator.
- Após o teste, armazenamento e/ou eliminação adequada do líquido de amostragem, limpe todas as partes do conjunto do frasco de recolha de amostragem, excepto o balão com a seringa modificada. Autoclave todas as peças a 121 °C por 30 min, exceto o balão com a seringa modificada e conectores fêmeas do adaptador luer lock. Remontar para o próximo dia de amostragem.
NOTA: É altamente recomendável ter redundância duplicada ou triplicada de peças, tampas, tubos e septos para rápido reparo e substituição, se necessário.
- Gire a torneira de três vias da porta vertical superior do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura sem amostragem. Coletar 250 mL de líquido.
- A cada dia que o biorreator estiver funcionando, realize o seguinte:
- Preparação de um balão com uma seringa modificada
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Resultados
Aqui nós mostramos os resultados de um estudo de biorreator usando um método de preparação de meio de cultura misto de poço e um método de configuração de biorreator como descrito aqui. O meio de cultura misto do furo foi modificado para conter como fonte de carbono uma lama de espigas de milho processada por Dissolução Hidrotérmica Oxidativa (OHD)13,14. Meio de cultura modificado foi bombeado para o biorreator por 44 dias a uma taxa de 0,4 mL/min. No dia 23, um ...
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Discussão
A seção de produção de meios deste protocolo (seção 1) deve sua estrutura à técnica de Hungate modificada de Miller e Wolin17, que tem sido amplamente utilizada desde sua publicação. A praticidade deste protocolo expandido advém de sua natureza descritiva e de seu pareamento com a aquisição in situ de microrganismos. Frascos de cultura contendo meios ambientalmente informados e simulados foram usados para cultivar com sucesso os seguintes ex-membros da "matéria escura microbiana" adquirid...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer a linhagem de informação e orientação que influenciou/evoluiu essas técnicas ao longo dos anos. O Dr. Hamilton-Brehm como ex-aluno de pós-graduação, pós-doc e atual professor tem uma dívida de gratidão com aqueles que dedicaram tempo para ensinar técnicas anaeróbicas: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser e Dr. Brian Hedlund. A Nature Conservancy e a American Rivers apoiaram este trabalho através dos subsídios G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, respectivamente. Quaisquer opiniões, descobertas, conclusões ou recomendações expressas neste artigo são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Nature Conservancy ou da American Rivers. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do SIU Advanced Energy Institute, que agradece o financiamento concedido através do Advanced Energy Resource Board. A NGS foi realizada pela LC Sciences.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais GeraisFrasco de | |||
| borosillicado de 1 L | Fisher Scientific | ||
| com ponta deslizante | da Fisher Scientific | ||
| Frasco de cultura de 100 mL | da Fisher Scientific | ||
| Frisador de mão de 20 mm | Agulha Fisher Scientifc | ||
| 23 G | Fisher Scientifc | ||
| de 500 mL | Fisher Scientific | ||
| Vedação de alumínio | Cânula Fisher Scientifc | ||
| , 31,5 cm de comprimento | Cânula Fisher Scientific | ||
| 6 cm de comprimento | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Montado a partir de peças da empresa | |
| Coletor de gás | Swagelok | Montado a partir de muitas partes | |
| diferentes Isqueiro | Lowe's | ||
| N2 gás | Airgas | ||
| Luvas de nitrilo | Fisher Scientific | ||
| Tampa de borracha (para garrafas GL45) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rolha de borracha (para frascos de cultura) | Ace Glass | ||
| Placa quente de agitação | Corning | ||
| Oligoelementos | ATCC | ||
| Vitaminas | ATCC | ||
| < forte > materiais específicos do biorreator< / forte > | |||
| # 10 rolha de borracha | Ace Glass | ||
| #7 rolha de borracha | Seringa Fisher Scientifc | ||
| de 1 mL com ponta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" válvula de esfera de mangueira Amazon | |||
| 10 mL com ponta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| garrafa de borossilicato de 3,5 L | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" adaptador de mangueira barb encaixe | Amazon | ||
| 60 mL seringa com ponta luer lock garrafão | Fisher Scientifc | ||
| 8 L | Allen Glass | ||
| Conector de mangueira angular para tampa superior aberta GL14 | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate biorreator | Allen Scientific Glass | Feito sob encomenda | |
| Drill | Lowe's | ||
| Fêmea luer lock adaptador acoplador | Amazon | ||
| GL14 tampa superior aberta | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 tampa superior aberta | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 tampa superior aberta | Ace Glass | ||
| PTFE septo de silicone para tampa superior aberta GL14 | Ace Vidro | 7625-06 | |
| PTFE enfrentou septo de silicone para GL18 tampa superior aberta | Ace Glass | 7625-07 | |
| Suporte | Fisher Scientific | ||
| Grampo de corrente de suporte de anel | Amazon | ||
| Anel de suporte | Tubulação de silicone Fisher Scientific | ||
| ; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Tubo de silicone; 3/16" id, 3/8" od | Conector | ||
| para tampa superior aberta GL14 | Ace Glass | 7623-22 | |
| Torneira de três vias | Amazon | ||
| Torneira de duas vias | Amazon | ||
| Minibomba de fluxo variável de fluxo ultra baixo | VWR | ||
| Banho-maria | Fisher Septo de borracha branca Scientifc | ||
| para tubos de 13-18 mm OD | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
Referências
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Reimpressões e permissões
