O foco deste artigo é detalhar as melhores práticas para a fabricação de meios para microrganismos anaeróbios fastidiosos adquiridos de um ambiente. Esses métodos ajudam a gerenciar culturas anaeróbias e podem ser aplicados para apoiar o crescimento de microrganismos indescritíveis não cultivados, a "matéria escura microbiana".
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Artigo de método
Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pesquisa de microrganismos anaeróbios dependente da cultura baseia-se na competência metodológica. Esses métodos devem criar e manter condições adequadas de crescimento (por exemplo, pH e fontes de carbono) para microrganismos anaeróbios, ao mesmo tempo em que permitem que as amostras sejam extraídas sem comprometer o ambiente artificial. Para isso, métodos que são informados e simulam um ambiente in situ podem ser de grande auxílio na cultura de microrganismos desse ambiente. Aqui, delineamos um método anaeróbio informado e simulado in situ para cultivo de microrganismos terrestres superficiais e subsuperficiais, enfatizando a coleta de amostras anaeróbias com o mínimo de perturbação. Este protocolo detalha a produção de um meio líquido anaeróbio personalizável, a aquisição ambiental e o crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios. O protocolo também abrange componentes críticos de um biorreator anaeróbio usado para simulações ambientais de sedimentos e meios líquidos anaeróbios para culturas ambientalmente adquiridas. Incluímos dados preliminares de sequenciamento de próxima geração de um microbioma mantido ao longo da vida útil de um biorreator onde a cultura ativa se ajustou dinamicamente em resposta a uma fonte de carbono experimental.
Introdução
A maioria dos microrganismos permanece sem cultura; Isto é suportado pela grande disparidade entre as células observada através da microscopia contrastada pelos poucos microrganismos cultivados com sucesso usando placas de ágar. Staley e Konopka chamaram essa disparidade de "Anomalia da Grande Contagem de Placas"1. A diversidade estimada não contabilizada é suportada por dados metagenômicos e metatranscriptômicos mostrando muitos gêneros novos distribuídos em curvas de abundância de postos de vários ambientesdiferentes 2. Microrganismos que têm sido observados (geralmente por sequenciamento aleatóri....
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Protocolo
1. Produção de meio líquido anaeróbio personalizável
- Meio para frascos de cultura (produção de 500 mL)
- Medir e adicionar compostos a um frasco de 1 L e ajustar o pH usando a coluna na Tabela 1 correspondente à cultura de interesse do leitor (as quantidades na Tabela 1 são registradas para a produção de 1.000 mL, ajustar de acordo). Misture os compostos até homogeneizar girando o frasco.
- Aqueça o líquido até ferver por micro-ondas na garrafa por 5-6 min. Abra o micro-ondas com frequência e gire o líquido suavemente usando uma luva resistente ao calor. Abra o micro-ondas rapidamente se o líqu....
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Resultados
Aqui nós mostramos os resultados de um estudo de biorreator usando um método de preparação de meio de cultura misto de poço e um método de configuração de biorreator como descrito aqui. O meio de cultura misto do furo foi modificado para conter como fonte de carbono uma lama de espigas de milho processada por Dissolução Hidrotérmica Oxidativa (OHD)13,14. Meio de cultura modificado foi bombeado para o biorreator por 44 dias a uma taxa de 0,4 mL/min. No dia 23, um .......
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Discussão
A seção de produção de meios deste protocolo (seção 1) deve sua estrutura à técnica de Hungate modificada de Miller e Wolin17, que tem sido amplamente utilizada desde sua publicação. A praticidade deste protocolo expandido advém de sua natureza descritiva e de seu pareamento com a aquisição in situ de microrganismos. Frascos de cultura contendo meios ambientalmente informados e simulados foram usados para cultivar com sucesso os seguintes ex-membros da "matéria escura microbiana" adquirid.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer a linhagem de informação e orientação que influenciou/evoluiu essas técnicas ao longo dos anos. O Dr. Hamilton-Brehm como ex-aluno de pós-graduação, pós-doc e atual professor tem uma dívida de gratidão com aqueles que dedicaram tempo para ensinar técnicas anaeróbicas: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser e Dr. Brian Hedlund. A Nature Conservancy e a American Rivers apoiaram este trabalho através dos subsídios G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, respectivamente. Quaisquer opiniões, descobertas, conclusões ou recomendações expressas neste artigo são dos autores e não refletem necessariamente as ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais GeraisFrasco de | |||
| borosillicado de 1 L | Fisher Scientific | ||
| com ponta deslizante | da Fisher Scientific | ||
| Frasco de cultura de 100 mL | da Fisher Scientific | ||
| Frisador de mão de 20 mm | Agulha Fisher Scientifc | ||
| 23 G | Fisher Scientifc | ||
| de 500 mL | Fisher Scientific | ||
| Vedação de alumínio | Cânula Fisher Scientifc | ||
| , 31,5 cm de comprimento | Cânula Fisher Scientific | ||
| 6 cm de comprimento | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Montado a partir de peças da empresa | |
| Coletor de gás | Swagelok | Montado a partir de muitas partes | |
| diferentes Isqueiro | Lowe's | ||
| N2 gás | Airgas | ||
| Luvas de nitrilo | Fisher Scientific | ||
| Tampa de borracha (para garrafas GL45) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rolha de borracha (para frascos de cultura) | Ace Glass | ||
| Placa quente de agitação | Corning | ||
| Oligoelementos | ATCC | ||
| Vitaminas | ATCC | ||
| < forte > materiais específicos do biorreator< / forte > | |||
| # 10 rolha de borracha | Ace Glass | ||
| #7 rolha de borracha | Seringa Fisher Scientifc | ||
| de 1 mL com ponta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" válvula de esfera de mangueira Amazon | |||
| 10 mL com ponta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| garrafa de borossilicato de 3,5 L | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" adaptador de mangueira barb encaixe | Amazon | ||
| 60 mL seringa com ponta luer lock garrafão | Fisher Scientifc | ||
| 8 L | Allen Glass | ||
| Conector de mangueira angular para tampa superior aberta GL14 | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate biorreator | Allen Scientific Glass | Feito sob encomenda | |
| Drill | Lowe's | ||
| Fêmea luer lock adaptador acoplador | Amazon | ||
| GL14 tampa superior aberta | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 tampa superior aberta | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 tampa superior aberta | Ace Glass | ||
| PTFE septo de silicone para tampa superior aberta GL14 | Ace Vidro | 7625-06 | |
| PTFE enfrentou septo de silicone para GL18 tampa superior aberta | Ace Glass | 7625-07 | |
| Suporte | Fisher Scientific | ||
| Grampo de corrente de suporte de anel | Amazon | ||
| Anel de suporte | Tubulação de silicone Fisher Scientific | ||
| ; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Tubo de silicone; 3/16" id, 3/8" od | Conector | ||
| para tampa superior aberta GL14 | Ace Glass | 7623-22 | |
| Torneira de três vias | Amazon | ||
| Torneira de duas vias | Amazon | ||
| Minibomba de fluxo variável de fluxo ultra baixo | VWR | ||
| Banho-maria | Fisher Septo de borracha branca Scientifc | ||
| para tubos de 13-18 mm OD | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
Referências
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L.
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Reimpressões e permissões
