Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

Resumo

O foco deste artigo é detalhar as melhores práticas para a fabricação de meios para microrganismos anaeróbios fastidiosos adquiridos de um ambiente. Esses métodos ajudam a gerenciar culturas anaeróbias e podem ser aplicados para apoiar o crescimento de microrganismos indescritíveis não cultivados, a "matéria escura microbiana".

Resumo

A pesquisa de microrganismos anaeróbios dependente da cultura baseia-se na competência metodológica. Esses métodos devem criar e manter condições adequadas de crescimento (por exemplo, pH e fontes de carbono) para microrganismos anaeróbios, ao mesmo tempo em que permitem que as amostras sejam extraídas sem comprometer o ambiente artificial. Para isso, métodos que são informados e simulam um ambiente in situ podem ser de grande auxílio na cultura de microrganismos desse ambiente. Aqui, delineamos um método anaeróbio informado e simulado in situ para cultivo de microrganismos terrestres superficiais e subsuperficiais, enfatizando a coleta de amostras anaeróbias com o mínimo de perturbação. Este protocolo detalha a produção de um meio líquido anaeróbio personalizável, a aquisição ambiental e o crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios. O protocolo também abrange componentes críticos de um biorreator anaeróbio usado para simulações ambientais de sedimentos e meios líquidos anaeróbios para culturas ambientalmente adquiridas. Incluímos dados preliminares de sequenciamento de próxima geração de um microbioma mantido ao longo da vida útil de um biorreator onde a cultura ativa se ajustou dinamicamente em resposta a uma fonte de carbono experimental.

Introdução

A maioria dos microrganismos permanece sem cultura; Isto é suportado pela grande disparidade entre as células observada através da microscopia contrastada pelos poucos microrganismos cultivados com sucesso usando placas de ágar. Staley e Konopka chamaram essa disparidade de "Anomalia da Grande Contagem de Placas"¹. A diversidade estimada não contabilizada é suportada por dados metagenômicos e metatranscriptômicos mostrando muitos gêneros novos distribuídos em curvas de abundância de postos de vários ambientes^{diferentes 2}. Microrganismos que têm sido observados (geralmente por sequenciamento aleatório de uma comunidade microbiana), mas não foram cultivados, têm sido referidos como "matéria escura microbiana"^3,4.

Na era da -ômica, a cultura de microrganismos continua sendo imperativa para avaliar completamente os dados genômicos e verificar a função/fenótipo dos genes presentes. O sequenciamento de microrganismos cultivados ainda é a única maneira de obter genomas completos com confiança até que tecnologias como a metagenômica shotgun e genomas montados em metagenomas do ambiente se tornem admissivelmente infalíveis⁵. Avaliações genômicas juntamente com microrganismos cultivados fornecem fortes inferências para a compreensão da "matéria escura microbiana". Muitos membros da "matéria escura microbiana" desempenham funções cruciais que afetam a ciclagem de nutrientes e outros elementos e a produção de produtos naturais valiosos, apoiam sistemas ecológicos e executam serviços ecológicos. Do ponto de vista médico, cerca de metade de todos os produtos farmacêuticos atualmente comercializados são produtos e derivados de produtos de bactérias, e suspeita-se que o perfil de espécies não cultivadas revele os antibióticos do futuro. Para ter acesso a essa maioria inculta, uma variedade de metodologias de cultivo deve ser aumentada⁶. Entre os membros da "matéria escura microbiana", os microrganismos anaeróbios oligotróficos são amplamente subnotificados e provavelmente possuem vias bioquímicas ecológica e industrialmente valiosas⁷, tornando-os importantes alvos de cultivo. No entanto, microrganismos oligotróficos anaeróbios são mais difíceis de cultivar do que seus homólogos aeróbios e copiotróficos devido a tempos de incubação mais longos frequentemente exigidos, condições fastidiosas (por exemplo, temperaturas in vitro não padronizadas específicas) e o uso de receitas de meios especializados.

As técnicas atuais de desenvolvimento para cultivar membros da "matéria escura microbiana", incluindo novos microrganismos anaeróbios oligotróficos, melhoraram muito nossa compreensão e aumentaram a representação desses microrganismos dentro da árvore filogenética. As técnicas atuais que utilizam meios informados para o cultivo de novos microrganismos (isto é, meios derivados do conhecimento do(s) microrganismo(s) de interesse) podem ser separadas em três métodos distintos. O primeiro dos métodos envolve a remoção direta de uma seção discreta do ambiente para transferência para uma câmara de crescimento in vitro que já contém os microrganismos de interesse dentro de uma membrana. A seção discreta (por exemplo, água do mar) atua para fornecer aos microrganismos de interesse o habitat geoquímico que eles usam in situ, enquanto a membrana interrompe o movimento das células através (células de interesse permanecerão dentro; células estranhas que chegaram com a seção discreta permanecerão sem). Ao incluir compostos naturalmente disponíveis para atingir microrganismos em seu habitat natural, tais microrganismos podem ser cultivados⁸. O segundo método utiliza metatranscriptômica ou genômica para elucidar capacidades metabólicas, fornecendo pistas para parâmetros de cultivo estreitos para um planejamento de meio alvo. Esta abordagem fornece um perfil eco-fisiológico que pode ser usado para direcionar o enriquecimento de tipos específicos de microrganismos fora de um ambiente. As provisões do meio são atendidas para os genes identificados presentes que se presume suportarem o(s) microrganismo(s) ^alvo(s) para reduzir a diversidade de enriquecimento9,10. Uma ressalva é que a informação genômica não infere diretamente a expressão dos genes, enquanto a informação transcriptômica infere.

O terceiro método engloba mídias ambientalmente informadas e simuladas, distintas do primeiro, que não simula as mídias, mas utiliza diretamente o ambiente como fonte de mídia. Este terceiro método requer o reconhecimento ambiental da geoquímica de um local de campo contendo microrganismos de interesse. Com esse conhecimento, componentes primários e parâmetros físicos são identificados para produzir um meio simulado ambientalmente informado. O meio então recebe uma infusão direta de sedimento ou líquido contendo microrganismos do ambiente para o meio. Este método é particularmente valioso nos casos em que o microbiologista de cultura não tem acesso a quantidades suficientes de ambiente de origem (conforme necessário para o primeiro método) nem a dados metatranscriptômicos ou genômicos apropriados (conforme necessário para o segundo).

O protocolo a seguir é um exemplo do terceiro método; É informado e tem como objetivo simular ambientes de interesse. Três receitas de meios ingênuos visando diferentes culturas de microrganismos anaeróbios adquiridas no campo são apresentadas em paralelo dentro do protocolo. As três culturas representadas são culturas mistas originárias do solo (doravante, cultura mista de solo), culturas mistas originárias de um poço (doravante, cultura mista de poço) e um metanogênio isolado originário de um poço (doravante, metanogênio isolado de poço). As identidades e quantidades compostas nas receitas de mídia compartilhadas aqui são destinadas como um guia inicial; eles são capazes e incentivados a serem personalizados para o ambiente do leitor e microrganismos de interesse.

Protocolo

1. Produção de meio líquido anaeróbio personalizável

1. Meio para frascos de cultura (produção de 500 mL)
   1. Medir e adicionar compostos a um frasco de 1 L e ajustar o pH usando a coluna na Tabela 1 correspondente à cultura de interesse do leitor (as quantidades na Tabela 1 são registradas para a produção de 1.000 mL, ajustar de acordo). Misture os compostos até homogeneizar girando o frasco.
   2. Aqueça o líquido até ferver por micro-ondas na garrafa por 5-6 min. Abra o micro-ondas com frequência e gire o líquido suavemente usando uma luva resistente ao calor. Abra o micro-ondas rapidamente se o líquido ficar parado depois de borbulhar; caso contrário, o líquido pode rapidamente se expandir e transbordar a garrafa.
   3. Anexar uma pipeta de vidro estéril de 10 mL a uma configuração de coletor de gás N₂ (com base no projeto de Balch et ^al.11, embora não exija uma coluna de cobre aquecida para o gás N₂ de pureza; consulte Arquivo Suplementar 1 para obter mais informações sobre coletores de gás). Abra o coletor para ventilar O₂ e permitir que o gás N₂ flua.
   4. Coloque a ponta da pipeta no líquido e ajuste o fluxo de gás para que as bolhas sejam moderadamente vigorosas. Lave o líquido com N₂ até que o frasco não esteja mais muito quente para tocar.
      Observação : isso depende do conteúdo da mídia, mas geralmente leva ~ 20 min.
   5. Enquanto espera o frasco esfriar, coloque 10 frascos estéreis de cultura de 100 mL; ou, se preparar meios para coleta de cultura mista de solo, colocar dois frascos estéreis de 500 mL.
   6. Quando a garrafa de mídia estiver fria ao toque, puxe a ponta da pipeta para cima no headspace da garrafa. Adicione 0,125 g de NaHCO₃ e 0,300 g de Na₂S∙9 H₂O e aguarde até que a resazurina fique incolor.
      CUIDADO: Na₂S∙9 H₂O é corrosivo, tóxico e irritante. Use equipamentos de proteção individual ao manusear e enxágue bem as ferramentas metálicas após o contato.
   7. Enquanto espera que a resazurin mude de cor, prenda cânulas de metal à configuração do coletor de gás e coloque as pontas da cânula em garrafas de cultura. Ajuste o fluxo de N₂ para dentro das garrafas a uma taxa moderada, para que o líquido adicionado na etapa subsequente não perca devido ao fluxo de gás.
   8. Uma vez que a resazurina é incolor, alíquota 50 mL de líquido em cada frasco de cultura ou 250 mL de líquido em cada frasco de 500 mL.
   9. Tampe cada frasco com uma rolha de borracha do tamanho de um fósforo imediatamente após a remoção das cânulas. Fixe a rolha com um selo de alumínio (para frascos de cultura) ou uma tampa de rosca aberta GL45 (para frascos de 500 mL).
   10. Coloque as garrafas em uma lixeira autoclavável e encha a lixeira com água da torneira até que os níveis de água correspondam aos das garrafas.
       NOTA: Isso garantirá que os frascos não se rompam devido ao estresse causado por diferenciais de temperatura no vidro durante a autoclavagem.
   11. Autoclave os frascos a 121 °C por 30 min.
2. Meio para biorreator (produção de 8 L)
   1. Preparação do garrafão
      1. Abra a válvula de uma válvula de esfera de farpa de mangueira de 1/4" (6,4 mm). Conecte dois comprimentos de 6 cm de diâmetro interno (ID) de 1/4" (6,4 mm) e 1/2" (12,7 mm) de diâmetro externo (OD) em cada extremidade da válvula de esfera de farpa da mangueira.
      2. Conecte a uma extremidade do conjunto um encaixe de adaptador de farpa de mangueira de 5/16"-1/4" (7,9 mm-6,4 mm). Fixe a outra extremidade do conjunto à farpa da mangueira de um garrafão de 8 L.
      3. Use uma gravata zip para proteger a conexão entre a farpa da mangueira do garrafão e a tubulação, e a conexão entre o encaixe do adaptador da mangueira e a tubulação.
      4. Autoclave o garrafão com montagem a 121 °C por 30 min.
   2. Produção média
      1. Feche a válvula da válvula de esfera de farpa da mangueira no conjunto de garrafão de 8 L.
      2. Medir e adicionar compostos ao garrafão de 8 L e ajustar o pH usando a coluna na Tabela 1 correspondente à cultura de interesse do leitor (as quantidades na Tabela 1 são registradas para a produção de 1.000 mL, ajustar de acordo). Adicione uma barra de agitação e use uma placa quente agitada para misturar os compostos até homogeneizar.
      3. Aqueça o líquido até ferver com a placa quente agitada. Deixe o líquido ferver por 30 min.
         NOTA: O aquecimento do líquido para ferver depende do conteúdo do meio, mas pode levar 2-3 h.
      4. Anexar uma pipeta de vidro estéril de 10 mL a uma configuração de coletor de gás N₂ (com base no projeto de Balch et ^al.11, embora não exija uma coluna de cobre aquecida para o gás N₂ de pureza; consulte Arquivo Suplementar 1 para obter mais informações sobre coletores de gás). Abra o coletor para ventilar O₂ e permitir que o gás N₂ flua.
      5. Desligue o fogo, coloque a ponta da pipeta no líquido e ajuste o fluxo de gás para que as bolhas sejam moderadamente vigorosas, mas não transbordem. Lave o líquido com N₂ por 30 min.
      6. Puxe a ponta da pipeta para cima no headspace do garrafão. Adicione 2,0 g de NaHCO₃ e 4,8 g de Na₂S∙9 H₂O e aguarde até que a resazurina fique incolor.
         CUIDADO: Na₂S∙9 H₂O é corrosivo, tóxico e irritante. Use equipamentos de proteção individual ao manusear e enxágue bem as ferramentas metálicas após o contato.
      7. Uma vez que a resazurina esteja incolor, remova a pipeta de vidro e tampe imediatamente o garrafão com uma rolha #10. Torça um fio sobre a rolha e ao redor do lábio do garrafão para prender a rolha.

2. Aquisição in situ de microrganismos anaeróbios ambientais

1. Aquisição de amostras anaeróbias superficiais (cultivo misto de solo)
   1. Traga a(s) garrafa(s) de meio de cultura de solo misto feito como acima e um corer para o campo.
      NOTA: Um bit de solo de conicidade padrão Giddings 2 5/8" é usado pelos autores (Tabela de Materiais). No entanto, qualquer corer de solo ou espátula que possa coletar amostras até a profundidade desejada pode ser usado.
   2. Empurre (acionamento de estaca/estaca) o corer no sedimento até que o topo do cilindro de coleta de amostras esteja nivelado com a superfície do sedimento.
   3. Torça o corer 90° para liberar o núcleo e puxe para cima até que a amostra seja extraída do ambiente.
   4. Em sedimentos soltos (como o que pode ser encontrado ao coletar amostras de áreas úmidas), cubra a base do núcleo com uma nova mão enluvada de nitrilo à medida que está sendo extraída para evitar que a amostra caia ou se espalhe na água na extração.
   5. Aproximar-se rapidamente pelo olho 6-7 cm acima da base do núcleo. Use uma nova mão enluvada de nitrilo para cortar no núcleo e separar o fundo 6-7 cm.
   6. Transfira imediatamente o fundo do núcleo para a garrafa de cultura. Se o solo/sedimento for muito grande, forme-o rapidamente para caber na garrafa mais facilmente, minimizando ao máximo a exposição à atmosfera aeróbica.
   7. Uma vez que a amostra é transferida, reposicione imediatamente a rolha e segure-a no lugar com uma tampa de rosca.
   8. Mantenha a amostra fresca. Refrigerar o frasco de recolha a 4 °C no regresso ao laboratório.
2. Aquisição de amostras anaeróbias subsuperficiais (cultura mista de poço)
   1. Coloque uma garrafa estéril de 1 L junto ao coletor de gás. Tampe a garrafa com uma rolha de borracha. Pinge 100% de etanol na rolha e ateie fogo usando um isqueiro.
   2. Conecte uma agulha estéril de 23 G à configuração do coletor de gás N₂ . Abra o coletor para ventilar O₂ e permitir que o gás N₂ (ou Ar) flua a uma taxa moderada.
   3. Quando a rolha não estiver mais em chamas, insira a agulha no frasco. Introduza no frasco uma segunda agulha estéril de 23 G não ligada ao coletor de gás. Lave a garrafa por 1-2 min.
   4. Extrair a agulha não ligada ao coletor de gás. Pressurize o frasco por 1 min. Extrair a agulha restante.
   5. Leve o frasco pressurizado e uma agulha esterilizada de 23 G para o local do furo. Retirar líquido do poço seguindo os métodos de Merino et ^al.12.
      NOTA: Dependendo do método, conexão e vazão do poço, isso altera a estratégia de aquisição de uma amostra de água. Se houver um fluxo contínuo de água, coletar água conforme descrito na etapa 2.2.6. será suficiente. Se o fluxo de água for coletado em lote ou de baixa vazão, um método alternativo de entrada/saída pode ser usado. Em todas as situações, minimizar a contaminação e tentar garantir que a amostra coletada seja representativa do ambiente desejado. Esta é uma afirmação amplamente generalizada porque tem sido experiência dos autores que cada evento de coleta de amostras de sites governamentais ou privados tinha que ser altamente adaptável à acessibilidade disponível.
   6. Abra rapidamente o frasco, bombeie o líquido para enchê-lo totalmente e feche o frasco.
   7. Insira a agulha de 23 G que foi trazida para o local na rolha de borracha do frasco para aliviar a pressão no frasco. Extraia a agulha.
   8. Mantenha a amostra fresca. Refrigerar o frasco de recolha a 4 °C no regresso ao laboratório.

3. Crescimento in vitro de microrganismos anaeróbios adquiridos no campo

1. Crescimento por garrafa de cultura
   1. Defina um frasco estéril com rolha de N₂ e os frascos de cultura e garrafa de coleta preparados como acima. Pingar 100% etanol nas rolhas e ateá-las fogo usando um isqueiro.
   2. Montar uma agulha de 23 G numa seringa de 1 ml. Quando as rolhas não estiverem mais em chamas, insira a agulha no frasco de N₂ e retire ~1 mL de N₂. Extraia a agulha.
   3. Pressione lentamente o êmbolo para soltar o N₂. Assim que a seringa estiver vazia, introduza a agulha no frasco de recolha e retire 0,5 ml da amostra ambiental. Extraia a agulha.
   4. Insira a agulha no frasco de cultura e injete a amostra. Extraia a agulha.
   5. Gire o frasco e coloque-o em uma incubadora à temperatura, conforme informado pela Tabela 1 ou pelo ambiente de interesse do leitor.
      NOTA: O progresso da cultura (frasco ou biorreator) é monitorado usando um hemocitômetro de Petroff-Hauser de 0,02 mm de profundidade. O enriquecimento de microrganismos anaeróbios ou fastidiosos normalmente não atinge densidades celulares onde OD₆₀₀ é utilizável, e outros métodos de detecção são impraticáveis para monitoramento rotineiro e repetitivo. Os limites de detecção, o controle de qualidade e os cálculos estatísticos dependem do tipo de câmara de contagem de células e das necessidades do usuário.
2. Crescimento por biorreator
   1. Preparação de um balão com uma seringa modificada
      1. Retire o êmbolo de três seringas luer lock de 10 mL (uma para cada montagem final). Corte a flange de cada seringa e lime a extremidade cortada para que não perfure os balões. Limpe todos os chips arquivados da seringa modificada.
      2. Prepare um balão duplo colocando um balão dentro de outro.
      3. Esticar a extremidade do balão duplo sobre a seringa modificada de 10 mL.
      4. Separe ligeiramente a extremidade do balão externo do balão interno. Esprema todo o ar preso entre os balões.
      5. Aperte uma gravata em torno da base dos balões para prender os balões à seringa.
   2. Preparação de uma rolha modificada
      1. Retire os êmbolos de dez seringas luer lock de 1 mL (duas para cada rolha a ser modificada). Corte a flange das seringas.
      2. Defina duas rolhas de borracha tamanho #10 (para garrafões de 8 L) e três tamanhos para garrafas com acabamento de rosca GL45 (para garrafas de captura). Usando uma broca de 1/4" (6,4 mm), faça dois furos na parte superior de cada rolha de borracha com largura suficiente para que as seringas modificadas caibam e se ajustem o suficiente para que o ajuste seja hermético.
      3. Introduza as seringas modificadas através dos orifícios da rolha de borracha.
      4. Limpar e autoclavar a rolha modificada a 121 °C durante 30 minutos.
   3. Preparação da montagem do biorreator
      1. Desinfetar com etanol 70% todas as torneiras, conectores adaptadores fêmeas de bloqueio luer e outros materiais de biorreatores não autoclaváveis, e autoclave a 121 °C por 30 min todos os tubos (após corte no comprimento), rolhas, lã de vidro e outros materiais de biorreatores autoclaváveis.
      2. Coloque um biorreator estéril (Figura 1 e Figura 2) em um suporte de anel e fixe-o com uma cinta de corrente. Estabeleceu-se também um banho-maria, uma bomba peristáltica, o garrafão de 8 L com tampa contendo meio (a partir da etapa 1.2 do protocolo), um frasco de 3,5 L (frasco de captura sem amostragem) e um frasco de 500 mL (garrafa de captura de amostragem).
      3. Tapando o garrafão
         1. Coloque um balão com uma seringa modificada. Conecte uma torneira de três vias à ponta de bloqueio da seringa.
         2. Pegue o conjunto do balão e conecte a torneira de três vias à tubulação de um tanque de N₂. Vire a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera.
         3. Abra o tanque de gás e encha o balão com N₂. Uma vez cheio, gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade do balão. Feche o tanque de gás e desconecte a tubulação do tanque da torneira de três vias.
         4. Conecte o seguinte em sequência: uma torneira de três vias (do balão com a seringa modificada), uma torneira bidirecional, um acoplador adaptador de bloqueio luer fêmea e a ponta de bloqueio luer de uma das seringas modificadas da rolha.
         5. À ponta de bloqueio da outra seringa, conecte uma torneira bidirecional. Feche ambas as válvulas das torneiras bidirecionais no conjunto modificado da rolha.
         6. Destorça o fio que segura a rolha #10 do garrafão tamanho não modificado. Substitua rapidamente a rolha não modificada pelo conjunto de rolha modificado e torça o fio como antes para fixar o conjunto de rolha modificado ao garrafão.
            NOTA: Se estiver confiante e preparado, o conjunto de rolha modificado pode ser utilizado para rolha o garrafão na etapa final da preparação média (etapa 1.2.2.7).
         7. Vire a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera. Abra a torneira bidirecional em sequência. O gás do balão e o headspace do garrafão de 8 L agora estão conectados.
      4. Tampa das garrafas de captura sem amostragem e amostragem
         1. Rolha a garrafa de captura sem amostragem de 3,5 L com uma rolha modificada dimensionada para garrafas com acabamento de rosca GL45, aplicando etanol 70% na base da rolha para ajudar a encaixá-la na garrafa. Tampe o frasco com uma tampa de rosca aberta GL45.
         2. Conecte o seguinte em sequência: um balão com a ponta de bloqueio luer da seringa modificada, uma torneira de três vias, um acoplador adaptador de bloqueio luer fêmea e a ponta de bloqueio luer de uma das seringas modificadas da rolha. Gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta diretamente para a atmosfera.
         3. À ponta de bloqueio luer da outra seringa, conecte um acoplador adaptador luer lock fêmea.
         4. Repita os três passos acima para o frasco de recolha de amostras de 500 ml.
      5. Configuração da tubulação
         1. Meça a distância entre as portas da camisa d'água do biorreator e as farpas da mangueira de banho-maria. Corte dois comprimentos de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância.
         2. Monte dois conectores de mangueira retos com tampas de rosca de topo aberto GL14. Fixe cada uma delas a uma das duas extremidades das duas tubulações.
         3. Torça as tampas de rosca nas portas da camisa de água do biorreator. Fixe as outras extremidades da tubulação às farpas da mangueira de banho-maria para que a água flua para fora do banho-maria, entre na parte inferior da camisa d'água do biorreator, saia na parte superior da camisa d'água e retorne ao banho-maria. Aperte as amarras de zíper ao redor das extremidades da tubulação para prender a tubulação às farpas da mangueira de banho-maria.
         4. Para bombas semelhantes à Minibomba de Fluxo Variável VWR Ultra Low Flow, rosqueie o conjunto de tubos com fenda OD de 3/16" (4,8 mm) que o acompanha através da bomba.
         5. Meça a distância entre o conjunto da tubulação do garrafão e o conjunto da tubulação da bomba peristáltica. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância.
         6. Fixe uma extremidade da tubulação à farpa da mangueira do conjunto da tubulação do garrafão e a outra à farpa da mangueira do conjunto da tubulação da bomba peristáltica, orientada de modo que o meio flua do garrafão e através da bomba peristáltica.
         7. Meça a distância entre o conjunto da tubulação peristáltica da bomba e a porta inferior do biorreator. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância.
         8. Conecte uma extremidade desta tubulação à farpa da mangueira do conjunto da tubulação da bomba peristáltica e prenda cuidadosamente a outra à porta inferior do biorreator. Tomando cuidado para não quebrar o vidro, mas também para prender a conexão, aperte uma gravata em torno da extremidade da tubulação para prender a tubulação à porta inferior do biorreator.
         9. Meça e corte aproximadamente 5" (127mm) de comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD.
         10. Conecte um conector adaptador de bloqueio luer fêmea a uma torneira de três vias. Fixe qualquer extremidade da torneira de três vias à tubulação.
         11. Monte um conector de mangueira angulado com tampa de rosca aberta GL14. Fixe-o na outra extremidade da tubulação.
         12. Torça a tampa de rosca na porta vertical superior do biorreator. Gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade apontando para o biorreator.
         13. Meça a distância entre o conjunto de porta vertical mais superior e o conjunto de garrafas de captura sem amostragem. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância. Corte as flanges de duas seringas luer lock de 1 mL e insira-as nas extremidades da tubulação.
         14. Conecte uma extremidade deste conjunto de tubulação à torneira de três vias do conjunto de porta vertical mais superior e conecte a outra extremidade ao conector do adaptador de bloqueio luer fêmea no conjunto de garrafas de captura sem amostragem.
         15. Meça a distância entre o conjunto de porta vertical mais superior e o conjunto de garrafas de captura de amostragem. Corte um comprimento de 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) tubo de silicone OD para cobrir esta distância. Corte as flanges de duas seringas luer lock de 1 mL e insira-as nas extremidades da tubulação.
         16. Conecte uma extremidade deste conjunto de tubulação à torneira de três vias do conjunto de porta vertical mais superior e conecte a outra ao conector do adaptador de bloqueio luer fêmea no conjunto da garrafa de captura de amostragem.
   4. Enchimento do biorreator
      1. Tampe uma das portas GL18 do biorreator com um septo de borracha branca. Tampar a outra porta GL18 e as demais portas GL14 expostas verticalmente com septos de silicone (PTFE voltados para o vidro) e tampas de parafuso superiores abertas do tamanho GL18/GL14.
      2. Com uma haste de 50 cm de comprimento, embale 0,9 g de lã de vidro na base do biorreator.
      3. Autoclave 1,3 L de areia a 121 °C por 30 min. Encha o biorreator com a areia usando um funil.
         NOTA: Outros tipos de sedimentos informados pelo ambiente do leitor e microrganismos de interesse podem ser substituídos aqui.
      4. Coloque a tubulação em um tanque de N₂ na parte superior do biorreator e lave o headspace do biorreator com N₂ por 2 min. Tampar imediatamente o biorreator com uma rolha de tamanho #7 e uma tampa de rosca aberta GL45.
      5. Da garrafa de captura sem amostragem, desconecte a tubulação e gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade apontando para o balão. Conecte a tubulação a um tanque de N₂ ao conector adaptador de bloqueio luer fêmea e lave o headspace do biorreator com N₂ por 2 min. Reconecte imediatamente a tubulação e devolva a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera.
      6. Repita o passo acima para o frasco de captura de amostragem.
      7. Gire a torneira de três vias da porta vertical mais alta do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura de amostragem. Bombeie o líquido do garrafão para o biorreator. Pause a bomba, ventile o balão da garrafa de amostragem e encha o balão do garrafão com N₂ , conforme necessário.
      8. Uma vez que o biorreator tenha sido preenchido com o meio, ajuste a vazão da bomba para 0,6 mL/min (valor digital de 40 na Mini-Bomba).
         NOTA: Outras vazões desejadas pelo leitor podem ser substituídas aqui.
      9. Defina a temperatura do banho-maria, conforme informado pela Tabela 1 ou pelo ambiente de interesse do leitor.
         NOTA: O inóculo pode ser adicionado neste ponto ou mais tarde, dependendo das especificidades do estudo. Se estiver a ser inoculado neste momento, avance para o passo 3.2.4.10. Se inocular mais tarde, avance para o passo 3.2.5.
      10. Definir um frasco de recolha ou frasco de cultura inoculado e um frasco estéril com rolha de N₂. Pingar 100% etanol nas rolhas e ateá-las fogo usando um isqueiro.
      11. Montar uma agulha de 23 G numa seringa de 60 ml. Quando as rolhas não estiverem mais em chamas, insira a agulha no frasco de N₂ e retire ~50 mL de N₂. Extraia a agulha.
      12. Pressione lentamente o êmbolo para soltar o N₂. Assim que a seringa estiver vazia, introduza a agulha no frasco de recolha e retire 50 ml da amostra ambiental. Extraia a agulha.
      13. Troque a agulha 23G por uma agulha longa estéril de metal (cânula, comprimento 31,5 cm). Insira a agulha longa de metal através do septo de borracha branca na porta GL18 do biorreator.
      14. Empurre a agulha para dentro do sedimento e injete o inóculo. Extraia a agulha.
   5. Manutenção de biorreatores em execução
      1. A cada dia que o biorreator estiver funcionando, realize o seguinte:
         1. Verifique o nível do banho-maria. Se estiver baixo, adicione mais água (use água destilada para a longevidade do equipamento, reduzindo a corrosão e o acúmulo de minerais).
         2. Verificar o balão da garrafa de captura sem amostragem; Um balão cheio inibirá o fluxo do meio. Quando estiver cheio, gire a torneira de três vias para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura. Aperte o balão para esvaziá-lo; em seguida, devolva a torneira de três vias para bloquear a extremidade aberta para a atmosfera; Repita até que o balão esteja vazio.
         3. Confira o balão do garrafão de 8 L. Se estiver baixo, feche a torneira bidirecional em sequência e desconecte a torneira de três vias da torneira bidirecional. Recarregue e volte a ligar o conjunto do balão seguindo os passos 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 e 3.2.3.3.7.
         4. Verifique o nível do meio no garrafão de 8 L. Se estiver baixo, montar outro garrafão de 8 L e preparar mais médio seguindo os passos do protocolo 1.2. e 3.2.3.3. Pause a bomba, feche a válvula de esfera de farpa da mangueira, desconecte rapidamente o garrafão antigo e conecte o novo garrafão.
            OBS: Para uma vazão de 0,6 mL/min, será necessário novo meio a cada 9 dias.
         5. Verifique o nível do meio na garrafa de captura não amostral. Se estiver cheia, montar outra garrafa de captura sem colheita de amostras de acordo com o passo 3.2.3.4.1. Lave o novo frasco com N₂, desconecte rapidamente o balão com a seringa e tubulação modificadas do frasco antigo e conecte-o ao novo frasco.
         6. Retire a rolha modificada de uma garrafa de captura completa sem amostragem. Autoclave o líquido a 121 °C por 30 min; em seguida, dispor do líquido de acordo com as políticas institucionais do leitor. Limpe e autoclave todas as peças do conjunto de garrafas de captura sem amostragem para prepará-las para o próximo uso.
      2. Realize a amostragem a cada 7 (ou número desejado pelo leitor) dias fazendo o seguinte:
         1. Gire a torneira de três vias da porta vertical superior do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura sem amostragem. Coletar 250 mL de líquido.
            NOTA: Para uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min, a coleta de 250 mL levará ~7 h.
         2. Retorne a torneira de três vias da porta vertical superior do biorreator para bloquear a extremidade apontando para a garrafa de captura de amostragem. Desconecte a tubulação e a garrafa de captura de amostragem da torneira de três vias da porta vertical mais alta do biorreator.
         3. Após o teste, armazenamento e/ou eliminação adequada do líquido de amostragem, limpe todas as partes do conjunto do frasco de recolha de amostragem, excepto o balão com a seringa modificada. Autoclave todas as peças a 121 °C por 30 min, exceto o balão com a seringa modificada e conectores fêmeas do adaptador luer lock. Remontar para o próximo dia de amostragem.
            NOTA: É altamente recomendável ter redundância duplicada ou triplicada de peças, tampas, tubos e septos para rápido reparo e substituição, se necessário.

Resultados

Aqui nós mostramos os resultados de um estudo de biorreator usando um método de preparação de meio de cultura misto de poço e um método de configuração de biorreator como descrito aqui. O meio de cultura misto do furo foi modificado para conter como fonte de carbono uma lama de espigas de milho processada por Dissolução Hidrotérmica Oxidativa (OHD)^13,14. Meio de cultura modificado foi bombeado para o biorreator por 44 dias a uma taxa de 0,4 mL/min. No dia 23, um inóculo proveniente do poço BLM-1 na região do Vale da Morte, em Nevada, EUA, foi adicionado¹⁵. Amostras líquidas do biorreator foram coletadas em frasco de coleta nos dias 1, 8, 15, 22, 23 (após a inoculação), 30, 37 e 44.

Para rastrear o estado geral da cultura de inóculo (e dos habitantes sobreviventes do pré-inóculo em autoclave do sedimento do biorreator), amostras líquidas do biorreator foram observadas por contagem direta de células. A contagem direta de células do líquido amostrado foi feita com hemocitômetro de Petroff-Hauser. Para conhecer a identidade dos membros microbianos do biorreator, o DNA foi extraído de amostras líquidas do biorreator, e os genes do 16S rRNA foram analisados por Next Generation Sequencing (NGS). Os dados de NGS foram processados internamente usando mothur seguindo o MiSeq SOP¹⁶.

Antes da inoculação, a contagem direta de células estava frequentemente abaixo do limite de detecção (b.d.l.) de 1,0 × 10⁶ células/mL. O dia 23 (após a inoculação) apresentou baixa contagem de células de 2,6 × 10⁶ células/mL, enquanto nos dias seguintes 30, 37 e 44 apresentaram contagem de células acima de 1,0 × 10⁷ células/mL (Figura 3). Embora as contagens celulares tenham sido b.d.l. nos dias 1, 8 e 22, o DNA foi extraído para NGS de todos os momentos, indicando a presença basal de microrganismos pré-inóculo no sedimento, mesmo após a autoclave. O gênero majoritário presente (determinado pelo número de leituras em cada Unidade Taxonômica Operacional (UTO)) foi estável nos dias 8, 15 e 22, sendo identificado como Geobacillus. Após a inoculação com o inóculo BLM-1 no 23º dia, Geobacillus deixou de dominar, e novos gêneros majoritários surgiram, juntamente com uma infinidade de gêneros de menor presença, que, em sua maioria, mantiveram presença até o final do estudo (Figura 4). A partir destes, concluímos que o inóculo BLM-1 foi uma cultura ativa e dinamicamente deslocada dentro do biorreator.

Um estudo adicional dos dados do NGS revelou membros da "matéria escura microbiana". OTUs com nomes taxonômicos atribuídos contendo as palavras "não classificado" ou "não culto" foram usadas como proxy para OTUs contendo membros da "matéria escura microbiana". Os dados de NGS foram coletados para o dia 44 (o último dia de pós-inoculação com microrganismos do furo BLM-1) e filtrados para não conter OTUs que tivessem leituras nos dados pré-inoculação (dias 1, 8, 15 ou 22), pois essas OTUs provavelmente não estavam no inóculo. Os dados filtrados do dia 44 NGS continham 1.844 OTUs e 3.396 leituras. Destas, 366 OTUs (20%) e 925 leituras (27%) não foram classificadas em nível de filo, e 1252 OTUs (68%) e 2357 leituras (69%) não foram classificadas ou não cultivadas em nível de gênero. Embora de curto prazo, este estudo piloto apoia o potencial de um biorreator com meios ambientalmente informados para cultivar membros da "matéria escura microbiana".

Figura 1: Esquema do biorreator de borossilicato projetado sob medida usado para cultivo anaeróbio. (A) Vista do biorreator de um lado. (B) Girar A em 90° (sentido horário) em torno do eixo z dá a visão). (C) Vista superior do biorreator. O design encamisado permite o controle de temperatura com água ou óleo. As duas portas da jaqueta podem ser vistas no lado direito da vista em B. A câmara interna pode ser preenchida com sedimentos de qualquer tipo ou pode ser deixada vazia de sedimentos para cultivo planctônico. Três portas de amostragem (vistas no lado direito da vista em A) permitem remover material em diferentes profundidades da coluna do biorreator. As aberturas padrão de 45, 18 e 14 GL podem ser seladas usando septos de teflon ou butil que manterão uma vedação estanque por 1-6 meses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Montagem ativa do biorreator. Os utensílios de vidro apresentados na foto da esquerda para a direita são (A) garrafão de 8 L, (B) biorreator (ver Figura 1) e (C) garrafa de captura sem amostragem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Contagem direta de células do estudo do biorreator. As populações microbianas dentro do biorreator foram monitoradas usando uma câmara de contagem de células do hemocitômetro de Petroff-Hauser de 0,02 mm. Inóculo foi adicionado no início do dia 23. As contagens de células para os dias 1, 8 e 22 estavam abaixo do limite de detecção. O limite de detecção efetivo da contagem direta de células é de 1 × 10⁶ células/mL. Abreviação: b.d.l. = abaixo do limite de detecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Sequenciamento de próxima geração do biorreator. As OTUs são representadas em gráficos de barras empilhadas indicando a porcentagem de leituras pertencentes a OTUs únicas de cada ponto de tempo do estudo do biorreator. OTUs únicas foram atribuídas à taxonomia associada em um ponto de corte de gênero. O gênero 'Outro' é definido como todos os gêneros com menos de 10% de leituras em cada ponto de tempo. O número total de leituras de DNA representadas é de 506.358. O número de leituras para cada ponto de tempo é listado na parte superior do gráfico. Inóculo foi adicionado no início do dia 23. Abreviação: OTU = Unidade Taxonômica Operacional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composto	Quantidade para cultura mista de solo	Quantidade para cultura mista de poço	Quantidade de metanogênio isolado em poço
Água destilada	1000,0 mL	1000,0 mL	1000,0 mL
HEPES	3.600 gr	-	-
MOPS	-	-	2.000 gr
MgCl2 ∙6 H2O	0.400 gr	0.400 gr	0.400 gr
Kcl	0.500 gr	0,250 gr	0.500 gr
NH4Cl	0,268 gr	0,268 gr	0,268 gr
Na2SO4	-	0,284 gr	1.500 gr
Na2HPO4 ∙2 H2O	-	-	0,356 gr
1 M KH2PO4 a pH 6	1,0 mL	1,0 mL	-
1 M H3BO3 a pH 9,4	1,0 mL	1,0 mL	1,0 mL
Minerais residuais	1,0 mL	-	1,0 mL
Vitaminas	-	-	1,0 mL
1 mg/ml de resazurina sódica	0,4 mL	0,3 mL	0,4 mL
Ajuste de pH para	-	7.0	7.0
Ajuste de pH por	-	NaOH	KOH
Temperatura de incubação	25 °C	60 °C	47 °C

Tabela 1: Composição da mídia. Lista de compostos e parâmetros físicos para cada meio. A mídia apresentada é ingênua; não contêm carbono e fontes de energia, pois estas podem ser específicas e devem ser informadas pelos microrganismos do leitor e pelo ambiente de interesse. Veja a seção de discussão para ideias de possíveis adições de carbono e fontes de energia.

Arquivo suplementar 1: Configuração do coletor de gás. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A seção de produção de meios deste protocolo (seção 1) deve sua estrutura à técnica de Hungate modificada de Miller e Wolin¹⁷, que tem sido amplamente utilizada desde sua publicação. A praticidade deste protocolo expandido advém de sua natureza descritiva e de seu pareamento com a aquisição in situ de microrganismos. Frascos de cultura contendo meios ambientalmente informados e simulados foram usados para cultivar com sucesso os seguintes ex-membros da "matéria escura microbiana" adquiridos in situ: bactérias anaeróbias subsuperficiais Thermoanaerosceptrum fracticalcis cepa DRI13¹⁸, Caldiatribacterium inferamans cepa SIUC1 (número de acesso MT023787; manuscrito em preparação) e Anaerothermus hephaesti cepa SIUC3 (número de acesso MK618647; manuscrito em preparação) e bactéria anaeróbia subsuperficial não caracterizada cepa DRI14 (número de acesso KR708540).

Um dos focos deste protocolo é que ele é feito para ser altamente adaptável a ambientes anaeróbios superficiais e subsuperficiais e microrganismos. Primeiro, a composição do meio é encorajada a ser alterada para refletir a composição do ambiente de interesse. Por exemplo, 3.000 mg/L de NaCl podem ser adicionados à receita ao simular um ambiente com concentrações iônicas de 3.000 mg/L para Na⁺ e Cl^-; ou 650 mL de areia e 650 mL de xisto podem ser colocados no biorreator ao simular um ambiente com uma relação de volume de 1:1 de arenito/xisto. Em segundo lugar, a composição do meio pode ser modificada para favorecer o crescimento de microrganismos específicos de interesse. Particularmente, mídias ingênuas como as três mídias deste artigo são preparadas e dependentes de tais modificações. Exemplos de carbono e fontes de energia incluem fumarato¹⁸, peptona¹⁸, matéria orgânica contendo celulose¹⁹, acetato²⁰, extrato de levedura^19,20, xilitol (cepa SIUC1), formate (cepa SIUC3) e outras fontes potenciais como H₂/CO₂, citrato e glicose. Finalmente, a composição do meio pode ser alterada dependendo do estudo desejado. Por exemplo, o principal interesse do estudo descrito na seção de resultados representativos foi descobrir como microrganismos anaeróbios subsuperficiais representativos responderiam a uma única lama orgânica mista (uma lama de espigas de milho processada por OHD^13,14); Assim, sua receita continha essa fonte de carbono em vez de opções mais convencionais. Outras alterações potenciais para estudos específicos incluem a adição de plásticos, ácidos e metais pesados, ou outros xenobióticos para estudos de biorremediação; a adição de polímeros de carbono recalcitrantes, como celulose e plásticos, para estudos de produtos despolimerizados de valor agregado; e a adição de estrume e resíduos vegetais para compostagem em pequena escala e outros estudos agrícolas.

Se a análise pós-redutora de um meio for desejada, como medições de pH, Potencial de Redução de Oxidação (ORP) e Oxigênio Dissolvido (OD), isso pode ser realizado indiretamente, sacrificando um número representativo de frascos médios para entender com confiança o caráter desse lote. Ao expor uma garrafa média selada ao ar, é altamente recomendável que as leituras de ORP e DO sejam feitas com menos de 1 minuto após a abertura. Medições não dependentes de oxigênio (por exemplo, pH) podem ser feitas sem urgência após a abertura inicial. Microrganismos anaeróbios fastidiosos tipicamente requerem valores de ORP < -200 mV para crescimento. Se o meio resultar em um valor de ORP de > -200 mV e/ou valores de OD >0,40 mg/L, Na₂S adicional (0,1-0,2 g/L) ou outro redutor (por exemplo, citrato de titânio, L-cisteína, ácido ascórbico) pode ser usado para reduzir ainda mais o meio.

A resazurina é frequentemente usada como um indicador de oxigênio (como neste protocolo); no entanto, é mais precisamente um indicador redox²¹, indicando a presença de oxigênio indiretamente à medida que o oxigênio altera o potencial redox de uma solução. Resazurin em solução aparece inicialmente na cor azul. Após a exposição a agentes redutores, a solução muda irreversivelmente para uma cor rosa. Quando a solução é ainda mais reduzida, ela muda reversivelmente para incolor e retorna para rosa após a oxidação. Os autores observaram casos em que meios reduzidos contendo resazurina mudaram de azul para rosa, mas não conseguiram mudar para incolor. No entanto, os autores também observaram que tais meios muitas vezes mudam para incolor após a autoclavagem, e que o aumento do tempo gasto fervendo e lavando o meio geralmente permite que a resazurina mude para sua forma incolor após a adição de redutores. Se desejado, a concentração de oxigênio no meio pode ser verificada com uma sonda de oxigênio dissolvido.

Todos os materiais necessários para operar esses biorreatores e os próprios biorreatores de vidro feitos sob medida não excederam ~ US $ 5 mil (isso pressupõe que equipamentos de suporte já estejam disponíveis, como banhos de água, bombas e incubadoras). Essas técnicas de cultivo anaeróbio são economicamente amigáveis, em comparação com biorreatores automatizados comerciais que podem começar em > $ 10 mil. Além disso, muitos biorreatores comerciais estão mudando para recipientes de reator de uso único, o que muda a dinâmica de comparação e não é custo-efetivo para laboratórios/universidades de pesquisa menores substituírem continuamente. Além disso, os sistemas comerciais podem ter vieses químicos de fabricação (a partir dos plásticos usados, graxa em juntas/conexões ou água tratada quimicamente) que afetarão o sucesso do crescimento de microrganismos fastidiosos. O baixo custo, customizabilidade e versatilidade para coletar uma amostra ambiental anaeróbia, em combinação com um meio informado que pode ser inoculado, o que resulta na geração de enriquecimentos para estudo, aumenta muito as chances de aquisição de microrganismos únicos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais GeraisFrasco de
borosillicado de 1 L	Fisher Scientific
com ponta deslizante	da Fisher Scientific
Frasco de cultura de 100 mL	da Fisher Scientific
Frisador de mão de 20 mm	Agulha Fisher Scientifc
23 G	Fisher Scientifc
de 500 mL	Fisher Scientific
Vedação de alumínio	Cânula Fisher Scientifc
, 31,5 cm de comprimento	Cânula Fisher Scientific
6 cm de comprimento	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Montado a partir de peças da empresa
Coletor de gás	Swagelok		Montado a partir de muitas partes
diferentes Isqueiro	Lowe's
N2 gás	Airgas
Luvas de nitrilo	Fisher Scientific
Tampa de borracha (para garrafas GL45)	Glasgeratebau OCHS
Rolha de borracha (para frascos de cultura)	Ace Glass
Placa quente de agitação	Corning
Oligoelementos	ATCC
Vitaminas	ATCC
< forte > materiais específicos do biorreator< / forte >
# 10 rolha de borracha	Ace Glass
#7 rolha de borracha	Seringa Fisher Scientifc
de 1 mL com ponta luer lock	Fisher Scientifc
1/4" válvula de esfera de mangueira Amazon
10 mL com ponta luer lock	Fisher Scientifc
garrafa de borossilicato de 3,5 L	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" adaptador de mangueira barb encaixe	Amazon
60 mL seringa com ponta luer lock garrafão	Fisher Scientifc
8 L	Allen Glass
Conector de mangueira angular para tampa superior aberta GL14	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate biorreator	Allen Scientific Glass		Feito sob encomenda
Drill	Lowe's
Fêmea luer lock adaptador acoplador	Amazon
GL14 tampa superior aberta	Ace Glass	7621-04
GL18 tampa superior aberta	Ace Glass	7621-08
GL45 tampa superior aberta	Ace Glass
PTFE septo de silicone para tampa superior aberta GL14	Ace Vidro	7625-06
PTFE enfrentou septo de silicone para GL18 tampa superior aberta	Ace Glass	7625-07
Suporte	Fisher Scientific
Grampo de corrente de suporte de anel	Amazon
Anel de suporte	Tubulação de silicone Fisher Scientific
; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Tubo de silicone; 3/16" id, 3/8" od	Conector
para tampa superior aberta GL14	Ace Glass	7623-22
Torneira de três vias	Amazon
Torneira de duas vias	Amazon
Minibomba de fluxo variável de fluxo ultra baixo	VWR
Banho-maria	Fisher Septo de borracha branca Scientifc
para tubos de 13-18 mm OD	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's