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Artigo de método

Técnicas de cultivo in vitro para modelar a organogênese hepática, construir assembleides,

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DOI:

10.3791/66229

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18 de abril de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

Neste artigo

Resumo

Os organoides revolucionam a modelagem personalizada de tecidos para desenvolvimento de órgãos, descoberta de medicamentos e pesquisa de doenças. A engenharia organoide avança na criação de tecidos sintéticos intrincados. O objetivo é integrar morfogênese, tecnologia de assembloides e biomatrizes para avançar na engenharia de tecidos. Este protocolo auxilia na modelagem da organogênese hepática e no estabelecimento de diretrizes para a construção de tecidos sintéticos.

Resumo

A doença hepática crônica atingiu proporções epidêmicas, afetando mais de 800 milhões de pessoas em todo o mundo. O tratamento atual, o transplante hepático ortotópico, tem várias limitações. Soluções promissoras surgiram no campo da medicina regenerativa do fígado, com a organogênese hepática com potencial significativo. A organogênese hepática precoce, ocorrendo entre E8.5 e 11.5, envolve a formação de interações epitelial-mesenquimais que levam à morfogênese, formação do cordão hepático e migração coletiva. No entanto, há uma carência de métodos para modelagem in vitro desse processo. Neste estudo, é apresentada uma série detalhada de métodos, possibilitando a modelagem de vários estágios e aspectos da organogênese hepática com linhagens celulares humanas. Em uma série de métodos, a tecnologia asemblóide com esferoides hepáticos (HEP) e mesenquimais (MES) é utilizada, replicando estruturas iniciais encontradas na organogênese hepática, modelando a morfogênese precoce e demonstrando a migração celular intersticial como visto in vivo. Esses sistemas assembloides inovadores ajudam a identificar fatores que influenciam a formação e migração de assembloides. Sistemas de cultivo de esferoides HEP também foram empregados para modelar a migração coletiva e a morfogênese ramificada. O meio condicionado mesenquimal (M-CM) desempenha um papel significativo no início da migração de ramificação dependente da dose. Todos os métodos apresentados mostraram-se altamente reprodutíveis com alta taxa de sucesso. Ao vincular esses eventos, nosso trabalho permitirá recriar eventos morfogenéticos sequenciais para fazer engenharia reversa da organogênese in vitro e in vivo.

Introdução

A migração de células hepáticas desempenha um papel significativo na organogênese hepática, doença e terapia celular. Durante a organogênese hepática (E8.5-9.0, camundongo), o epitélio pré-hepático do intestino anterior ventral começa a expressar genes hepáticos devido a sinais indutivos que emanam do mesênquima e do coração circundantes. Em E9.0, o epitélio do intestino anterior engrossa à medida que as células fazem a transição de uma morfologia colunar cuboidal para uma pseudoestratificada, formando o divertículo hepático1,2. Nesta fase crítica, o divertículo hepático é composto por apenas ~ 1.500 células. Em seguida, o endoderma hepático que reveste o divertículo hepático engrossa, delamina e forma cordões de hepatoblastos migratórios (HBs). Esses HBs co-migram com células endoteliais e células mesenquimais, ramificando-se no tecido mesenquimal circundante, iniciando a migração celular coletiva tridimensional para formar o fígado bud3,4. De fato, durante este estágio, as células passam coletivamente por (1) co-migração ou movimento junto com outros tipos de células, (2) morfogênese ramificada ou formação de estruturas semelhantes a tubos ramificados e (3) migração intersticial ou migração em cima ou entre outras células. Em E11.5, a migração cessa e o fígado primitivo se forma, expandindo-se 103 fold3. A migração de células hepáticas também pode ser necessária em estágios posteriores da organogênese hepática, pois a expressão de HBs fetais de ratos mostrou evidências de genes altamente regulados associados à migração celular coletiva 3D, morfogênese e remodelação da matriz extracelular5. Além de seu papel na organogênese hepática precoce, a migração coletiva 3D está intrinsecamente ligada à disseminação local e metástase do carcinoma hepatocelular avançado (CHC), levando a um prognóstico pior e aumento da resistência ao tratamento6. Os hepatócitos adultos e fetais também empregam migração coletiva ao se moverem do baço para dentro do fígado durante a repopulação do fígado. Estudos de imagem in vivo demonstraram que os hepatócitos transplantados entram na veia porta e, em seguida, nos capilares em poucas horas, migrando através dos sinusóides hepáticos e através do tecido hepático7,8,9. Finalmente, estudos recentes demonstram que as HBs migratórias surgem durante a regeneração do fígado murino e humano, com algumas evidências de movimento em sheets10. No geral, a migração coletiva do fígado, capaz de múltiplos modos de morfogênese, desempenha um papel significativo na organogênese, câncer, terapia com células de hepatócitos e regeneração hepática.

Numerosos estudos genéticos exploraram as vias moleculares subjacentes à migração de células coletivas do fígado 3D. Esses estudos revelam que a ausência de cordões hepáticos dificulta a formação do fígado, ressaltando a necessidade da formação do cordão hepático e suas interações com as células de suporte para a formação do fígado1,11,12,13. Esses estudos também demonstram que o crescimento do fígado é iniciado por vários fatores, incluindo FGF-2 secretado pelo mesoderma cardíaco, BMP4 secretado pelo mesênquima circundante, HGF e interações de células endoteliais. Além disso, os fatores de transcrição associados à migração, incluindo HEX, PROX1 e TBX3, desempenham papéis cruciais2,14. Em conclusão, estudos genéticos fornecem evidências de que a sinalização do fator solúvel, levando à expressão do fator de transcrição, impulsiona a migração, a sinalização e as interações moleculares entre HBs e seu mesênquima circundante.

Embora a migração celular no início da organogênese hepática tenha sido extensivamente investigada, os estudos in vitro atuais de migração hepática frequentemente empregam ensaios 2D utilizando células HCC altamente migratórias juntamente com modelos tumorais in vivo15. Esses estudos forneceram informações sobre vários fatores que influenciam a migração hepática, incluindo TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 e miRNAs21,22,23. Embora tenha havido um progresso notável na compreensão dos mecanismos moleculares na migração de células hepáticas 3D, as disparidades distintas entre a migração celular 2D e 3D sugerem que os ensaios 2D possuem limitações inerentes. Além disso, esses modelos geralmente carecem da inclusão de tipos de células mesenquimais, que são essenciais tanto para a migração quanto para o crescimento. Embora tenha havido avanços no desenvolvimento de modelos 3D para migração hepática que integram o mesênquima de suporte, esses modelos enfatizam principalmente a co-migração em vez de explorar os diversos modos de migração coletiva.

A capacidade de gerar tecidos a partir de esferoides por meio de vários processos morfogenéticos e de automontagem facilita a exploração científica de tecidos sintéticos. Esses tecidos têm amplas aplicações no desenvolvimento e triagem de medicamentos, modelagem de doenças, terapia e outras aplicações biomédicas e biotecnológicas. Os detalhes metodológicos de vários sistemas de cultivo in vitro 3D projetados para exibir diferentes modos de migração coletiva 3D do fígado são fornecidos. Esses sistemas compreendem (1) cultura co-esferóide com esferoides HEP e MES em uma matriz, (2) gotículas de matriz esferóide HEP cultivadas com M-CM, (3) esferoides mistos HEP-MES e (4) matriz esferóide HEP cultivada com alta densidade de células MES. Esses sistemas permitem uma modelagem robusta da migração coletiva do fígado em um ambiente 3D, avançando assim nossa compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes à organogênese hepática, câncer e terapia.

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Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado no estudo estão listados na Tabela de Materiais. As abreviações usadas neste artigo são definidas no Arquivo Suplementar 1.

1. Preparação de solução de agarose de baixa eletroendosmose (EEO) a 1%

  1. Pese 2,5 g de pó de agarose com baixo teor de EEO e transfira para um copo.
    NOTA: Certifique-se de que o béquer tenha pelo menos o dobro do tamanho do volume desejado para acomodar o borbulhamento durante a preparação da solução.
  2. Utilizar um cilindro graduado para medir 250 mL de água destilada e despejar no béquer, visando uma concentração final (p/v) de 1%.
  3. Cubra a abertura do copo com filme plástico, deixando um pequeno orifício para ventilação. Aqueça o copo no micro-ondas por 30 s.
  4. Remova cuidadosamente o béquer e gire o conteúdo. Repita esse processo a cada 30 s até a dissolução completa.
    CUIDADO: Manuseie os copos de micro-ondas com cuidado, usando luvas adequadas. Monitore a solução de perto para evitar superaquecimento ou transbordamento.
  5. Uma vez obtida uma solução homogénea, retire o copo do micro-ondas. Agite suavemente a solução antes de transferi-la para um frasco pré-esterilizado. Autoclave a solução e armazene a solução de agarose à temperatura ambiente (RT) até que esteja pronta para uso.

2. Revestimento de placa de 96 poços

NOTA: Microplacas esferóides de 384 poços ultrabaixas podem ser utilizadas nesses e em outros experimentos.

  1. Afrouxe a tampa do frasco contendo a solução estéril de agarose a 1%. Aquecer a solução no micro-ondas em intervalos de 30 s até passar para a fase líquida; em seguida, aperte a tampa.
    CUIDADO: Manuseie os copos de micro-ondas com cuidado, usando luvas adequadas. Monitore a solução de perto para evitar superaquecimento ou transbordamento.
    NOTA: Execute estas etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecidos estéril.
  2. Transfira 55-65 μL da solução de agarose a 1% por alvéolo para revestir a placa de 96 poços cultivada em tecido e gire imediatamente a placa.
  3. Uma vez que a solução de agarose a 1% tenha sido transferida para o número desejado de poços, coloque as placas em uma geladeira a 4 ° C por 20-30 min para permitir que a agarose solidifique. Antes de usar, leve a placa à temperatura ambiente (Figura 1A).

3. Preparação de esferóides HEP

  1. Cultive células HepG2-WT em um frasco T-75 usando meio de crescimento completo (cDMEM) composto por Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep). Manter a cultura celular a 37 °C e 5% de CO2, trocando o meio de crescimento diariamente.
  2. Ao atingir 80% de confluência, enxágue as células com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e descarte o enxágue. Adicione 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA ao frasco e incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 5-10 min.
  3. Adicione quantidades iguais de cDMEM e lave as células do frasco. Uma vez que as células se desprendem, transfira a mistura para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL e centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 5 min em RT.
    NOTA: Todas as etapas de centrifugação descritas neste protocolo foram realizadas à temperatura ambiente (TR). No entanto, esses procedimentos de centrifugação podem ser realizados alternativamente em temperaturas frias.
  4. Ressuspenda a suspensão celular em cDMEM fresco e conte as células para determinar a concentração final em células/mL (Figura 1B).
  5. Coloração de corante das células
    NOTA: Esta é uma etapa opcional.
    1. Transfira a quantidade desejada de suspensão celular para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL e centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
    2. Ressuspenda o pellet celular em um meio de crescimento sem soro para atingir uma concentração final de 1,0 x 106 células / mL. Adicione 5 μL de solução fluorescente de marcação celular por mL de suspensão celular e incube a suspensão celular a 37 °C e 5% de CO2 em rotação por 20 min.
      NOTA: O meio de crescimento sem soro é DMEM e é suplementado apenas com 1% de caneta-estreptococo. Ajuste o tempo de incubação para uma coloração uniforme com base na densidade da suspensão celular.
    3. Uma vez concluída a incubação, centrifugar a suspensão celular a 450 x g durante 5 min e ressuspender o sedimento celular em cDMEM fresco. Repita este processo de lavagem mais duas vezes (Figura 1C).
  6. Formação de esferóides
    1. Suspenda as células em cDMEM fresco para atingir uma concentração final de 5,0 x 104 células/mL com base na contagem de células. Misture bem a suspensão celular e transfira 100 μL de suspensão celular por poço para a placa de 96 poços revestida com agarose.
      NOTA: A densidade da suspensão celular está definida para atingir 5.000 células por poço na placa de 96 poços revestida com agarose. Para o uso de placas de 384 poços, as células são suspensas em uma concentração final de 2,0 x 105 células/mL, e 50 μL de suspensão celular são transferidos por poço para atingir uma concentração de 10.000 células por poço.
    2. Centrifugar a placa a 340 x g durante 10 min e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante 5-9 dias (Figura 1D).
      NOTA: Troque o meio de crescimento a cada dois dias após o revestimento, removendo suavemente 50% do cDMEM e substituindo-o. Os esferóides HEP são adequados para o modelo assembloide HEP-MES ou modelo M-CM.

4. Preparação de esferoides MES

  1. Cultive células HFF / MRC-5 em um frasco T-175 usando cDMEM composto de DMEM, suplementado com 10% de FBS e 1% de Pen-Strep. Manter a cultura celular a 37 °C e 5% de CO2, trocando o meio em dias alternados.
  2. Ao atingir 80% de confluência, realize um enxágue das células com 1x PBS e descarte o enxágue. Adicione 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA ao frasco e incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 5-10 min.
  3. Adicione quantidades iguais de cDMEM e lave as células do frasco. Assim que as células se soltarem, transfira a mistura para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL e centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
  4. Ressuspenda a suspensão celular em cDMEM fresco e conte as células para determinar a concentração final em células/mL (Figura 1B).
  5. Coloração de corantes de células
    NOTA: Esta é uma etapa opcional.
    1. Transfira a quantidade desejada de suspensão celular para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL e centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
    2. Ressuspenda o pellet celular em um meio de crescimento sem soro para atingir uma concentração final de 1,0 x 106 células / mL. Adicione 5 μL de solução fluorescente de marcação celular por mL de suspensão celular e incube a suspensão celular a 37 °C e 5% de CO2 em rotação por 20 min.
      NOTA: O meio de crescimento sem soro é DMEM e é suplementado apenas com 1% de caneta-estreptococo. Ajuste o tempo de incubação para uma coloração uniforme com base na densidade da suspensão celular.
    3. Uma vez concluída a incubação, centrifugar a suspensão celular a 450 x g durante 5 min e ressuspender o sedimento celular em cDMEM fresco. Repita este processo de lavagem mais duas vezes (Figura 1C).
  6. Formação de esferóides
    1. Suspenda as células em cDMEM fresco para atingir uma concentração final de 1,0 x 105 células/mL com base na contagem de células. Misture bem a suspensão celular e transfira 100 μL de suspensão celular por poço para a placa de 96 poços revestida com agarose.
      NOTA: A densidade da suspensão celular é definida para atingir uma densidade de 10.000 células por poço na placa de 96 poços revestida com agarose.
    2. Centrifugar a placa a 340 x g durante 10 min e incubar a 37 °C e 5% de CO2 durante 5-9 dias (Figura 1D).
      NOTA: Troque o meio de crescimento a cada dois dias após o revestimento, removendo suavemente 50% do cDMEM e substituindo-o. Os esferóides MES são adequados para o modelo assembloide HEP-MES.

5. Formação de assembloides HEP-MES

NOTA: Consulte a etapa 3 e a etapa 4 para a formação de esferóides HEP (Figura 2A) e MES (Figura 2B).

  1. Colete os esferoides HFF/MRC-5 individualmente usando uma pipeta da placa de 96 poços. Transfira-os para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL contendo cDMEM fresco. Deixe os esferoides assentarem no tubo por 5 min e, em seguida, enxágue suavemente com cDMEM morno.
    NOTA: Execute o processo de enxágue com cuidado e cuidado.
  2. Transfira suavemente um único esferóide HFF/MRC-5 usando uma pipeta para um poço contendo um esferóide HepG2-WT. Adicione o Matrigel (MG) com fator de crescimento reduzido (TFG) ou colágeno (CG) em uma diluição de 1:1 e 1:5 e incube a 37 °C a 5% de CO2 por 3 h (Figura 2C).
    NOTA: Descongele o MG durante a noite no gelo em uma geladeira de 2 ° C a 8 ° C. Certifique-se de usar pipetas, pontas e tubos pré-resfriados ao manusear o MG, pois ele forma um gel acima de 10 °C.
  3. Após a incubação, adicione 75 μL de cDMEM fresco a cada poço e incube a 37 °C a 5% de CO2 por 2-3 dias.
    NOTA: Troque o meio de crescimento a cada dois dias após o revestimento, removendo suavemente 50% do cDMEM e substituindo-o. Os assemblóides ainda se formarão sem mudanças de mídia por até 3-4 dias. A formação de assembloides HEP-MES pode ocorrer sem o uso da matriz.

6. Formação de gotículas esferóides HEP

NOTA: Consulte a etapa 3 para a formação de esferóides HEP (Figura 3A). Dois materiais diferentes podem ser usados para suspender os esferóides HEP em gotículas. Os dois métodos são fornecidos abaixo.

  1. Gotículas GFR MG
    1. Colete os esferóides HepG2-WT individualmente usando uma pipeta da placa de 96 poços, permitindo que eles se depositem em uma centrífuga cônica estéril de 15 mL no gelo.
    2. Em um tubo de centrífuga cônico estéril separado de 15 mL, misture 1 mL de GFR MG gelado e meio de crescimento de controle gelado a uma diluição de 1:1. Aspirar o meio com uma pipeta do tubo de 15 ml contendo os esferóides HepG2-WT e colocá-lo no gelo.
      NOTA: Descongele o MG durante a noite no gelo em uma geladeira de 2 ° C a 8 ° C. Certifique-se de pipetas, pontas e tubos pré-resfriados ao manusear o MG, pois ele forma um gel acima de 10 °C.
    3. Adicione a solução de MG aos esferoides HepG2-WT, garantindo uma distribuição uniforme dos esferoides dentro da solução de MG.
    4. Usando uma pipeta de 200 μL, colete um volume de 15 μL de um único esferóide na solução de MG e semeie-o lentamente em uma placa de Petri de 60 mm (Figura 3B).
      NOTA: Se mais de um esferóide for semeado por gota, remova e semeie novamente. Os esferoides são reposicionados, se necessário, para garantir que estejam no centro da gota. Para uma semeadura ideal de esferoides, considere o uso de pipetagem reversa para minimizar a formação de bolhas de ar.
  2. Gotículas CG de cauda de rato
    NOTA: Toda a preparação do CG deve ser feita no gelo.
    1. Colete os esferóides HepG2-WT individualmente usando uma pipeta da placa de 96 poços, permitindo que eles se depositem em um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL em gelo (Figura 3B).
    2. Em um tubo de microcentrífuga, adicione 358,8 μL de água deionizada, 100 μL de PBS 10x, 12,1 μL de NaOH 1 N e 529,1 μL de GC de cauda de rato para um volume total de 1 mL.
      NOTA: O CG de cauda de rato de estoque deve sempre ser adicionado no final.
    3. Adicione a solução CG aos esferoides HepG2-WT, garantindo uma distribuição uniforme dos esferoides dentro da solução CG.
    4. Usando uma pipeta de 200 μL, colete um volume de 15 μL de um único esferóide na solução de CG e semeie-o lentamente em uma placa de Petri de 60 mm.
      NOTA: Se mais de um esferóide for semeado por gota, remova e semeie novamente. Os esferoides são reposicionados para garantir que estejam no centro da gota. Para uma semeadura ideal de esferoides, considere o uso de pipetagem reversa para minimizar a formação de bolhas de ar.
  3. Incubar as gotículas a 37 °C e 5% de CO2 durante 60 min antes de adicionar o meio de crescimento.
  4. Adicione lentamente 5 mL do meio de crescimento desejado à placa de Petri e incube a 37 ° C e 5% de CO2 com trocas de meio de crescimento a cada três dias (Figura 3C).
    NOTA: M-CM foi usado no ensaio de formação de gotículas HEP.

7. Preparação do M-CM

  1. Colha células HFF/MRC-5 e semeie-as em um frasco tratado com cultura de tecidos T-75 a uma densidade de semeadura de 5.000 células/cm2 e incube o frasco a 37 °C e 5% de CO2 por 72 h em 15 mL de cDMEM.
    NOTA: Monitore o frasco durante este período para garantir a saúde celular ideal.
  2. Após 72 h de incubação, recolher o M-CM num tubo de centrifugação cónico estéril de 15 ml. Centrifugue o M-CM a 290 x g por 5 min para remoção de detritos e filtre usando um filtro de 0.2 μm para esterilização (Figura 4A).
  3. Diluir o M-CM com meio de crescimento completo numa proporção de diluição de 1:1 a 1:7 e adicionar à experiência desejada (Figura 4B).
    NOTA: Utilize M-CM no ensaio de formação de gotículas HEP.

8. Formação de esferoides mistos HEP-MES

NOTA: Consulte as etapas 3.1-3.5. para preparação da suspensão da célula HepG2-WT e as etapas 4.1-4.5 para a preparação da suspensão da célula HFF/MRC-5.

  1. Suspenda as células HepG2-WT em cDMEM fresco para atingir uma concentração final de 1,0 x 105 células/mL para cada suspensão celular.
  2. Suspenda as células HFF / MRC-5 em cDMEM fresco para atingir uma concentração final de 1,0 x 105 células / mL para cada suspensão celular.
  3. Transfira as suspensões de células HepG2-WT e HFF/MRC-5 para um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL na proporção de 1:1 para obter uma concentração final de 2,0 x 105 células/mL. Misture bem a suspensão celular e transfira 100 μL de suspensão celular por poço para a placa de 96 poços revestida com agarose.
    NOTA: A densidade da suspensão celular é definida para obter 20.000 células por poço na placa de 96 poços revestida com agarose.
  4. Centrifugue a placa a 340 x g por 10 min e incube a 37 ° C e 5% de CO2 por 1-2 dias ( Figura 5C).
  5. Adição de hidrogéis de fibrina
    NOTA: Esta é uma etapa opcional que é feita em 72 h após o revestimento dos esferoides mistos HEP-MES.
    1. Em um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mL, misture fibrinogênio (3,25 mg/mL) e trombina (12,5 unidades/mL) na proporção de 4:1 para a formação de fibrina e coloque o tubo em gelo.
  6. Transfira a fibrina para cada poço com um esferóide misto pré-existente em uma diluição de 1:1 com cDMEM atual no poço. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 durante 30 min.
  7. Após a incubação, adicione 75 μL de cDMEM fresco a cada poço e incube a 37 °C a 5% de CO2 por 1-2 dias.
    NOTA: Troque o meio de crescimento a cada dois dias após o revestimento, removendo suavemente 50% do cDMEM e substituindo-o.

9. Modelo migratório MES de alta densidade

NOTA: Consulte a etapa 3 para a preparação do esferóide HepG2-WT (Figura 6A) e as etapas 4.1-4.5 para a preparação da suspensão da célula HFF/MRC-5 (Figura 6B).

  1. Suspenda as células HFF/MRC-5 em cDMEM fresco para atingir uma concentração final de 6,0 x 105 células/mL e coloque-as no gelo.
  2. Misture a suspensão de células HFF / MRC-5 e MG / CG gelada em uma diluição de 1: 1 ( Figura 6C).
    NOTA: A densidade da suspensão celular é definida para obter 30.000 células por poço na placa de 96 poços revestida com agarose. Descongele o MG durante a noite no gelo em uma geladeira de 2 ° C a 8 ° C. Certifique-se de pipetas, pontas e tubos pré-resfriados ao manusear o MG, pois ele forma um gel acima de 10 °C.
  3. Transferir 100 μL de solução de HFF/MRC-5 e MG usando uma pipeta para um poço contendo um esferóide HepG2-WT. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO2 durante 30 min.
  4. Após a incubação, adicione 75 μL de cDMEM fresco a cada poço e incube a 37 °C a 5% de CO2 por até 12 dias.

10. Análise estatística

  1. Revise e analise os dados coletados usando o Microsoft Excel ou qualquer software estatístico/gráfico.
    NOTA: Para avaliação estatística entre dois grupos, foi realizado o teste t de Student (tipo II com duas caudas), sendo considerados valores de p iguais ou menores que 0,05 como tendo significância estatística e definidos no texto e nas legendas das figuras/figuras.

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Resultados

O interesse por tecidos sintéticos para diversas aplicações biomédicas, como modelagem de doenças, descoberta de fármacos e engenharia de tecidos (Figura 7), está em crescimento. Nesse campo, organoides, esferoides e células derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) estão sendo transformados em tecidos sintéticos, mais complexos e maiores. Essa transformação envolve a aplicação de princípios da morfogênese, o uso de ferramentas como microfabricação e a integração de biomatrize...

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Discussão

O presente protocolo engloba vários métodos para cultivar assembleias simples e complexas, bem como técnicas para induzir a migração celular coletiva 3D na organogênese hepática inicial24,25. Os protocolos descritos destacam várias etapas críticas, sendo a formação de esferóides um aspecto central em todas as metodologias. Micropoços (96 ou 384 poços) são utilizados com placas não aderentes ou revestidas de agarose para obter a formação de esferoides. Este método...

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Divulgações

NP é o fundador da Khufu Therapeutics, uma empresa de engenharia organoide que desenvolve tratamentos para doenças hepáticas agudas e crônicas.

Agradecimentos

Os autores gostariam de expressar sincera gratidão a Ogechi Ogoke e Osama Yousef por suas contribuições inestimáveis para os dados usados neste artigo. A NP foi apoiada pelos fundos iniciais da UB CBE, uma bolsa Mark Diamond, o C024316 de Ciência de Células-Tronco do Estado de Nova York, o centro de Células-Tronco da UB em Medicina Regenerativa (ScIRM), o Centro de Engenharia de Células, Genes e Tecidos da Universidade de Buffalo (CGTE).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microplaca de Microplaca de Esferóide de Ultra-Baixo Acessório Ultra-Baixo de Fundo Redondo Preto/Transparente de 384 poçosCorning3830
96-wl Flat,TC,STRL,1/pk,100/CSProdutos de Laboratório701001
BaixoEEOSigma-AldrichA0576
da ZEISSversão 4
, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500 / CSVendas de Produtos de Laboratório705001
Frasco de Cultura de Células, 175cm², Vent, TC, STRL, 5 / pk, 40 / CSVendas de Produtos de Laboratório709003
Frasco de Cultura de Células, 75cm², Vent, TC, STRL, 5 / pk, 100 / CSVendas de Produtos de Laboratório708003
Tubos de Centrífuga, 15mL, PP, STRL, grad, 50 / bg, 500 / CSVendas de Produtos de LaboratórioL226010
Colágeno I, cauda de rato, 100 mgde Corning354236
DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvatoThermoFisher Scientific10569010
EVOS Microscópio fluorescente de contraste de faseEVOSAMEFC4300R Sorodensidade de 1.360 x 1.024 pixels
, qualificado, Estados UnidosThermoFisher Scientific26140079
Fibrinogênio de plasma humanoSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
Membrana basal reduzida ao fator de crescimento de matrigel (TFG) Matriz, livre de LDEV, 10 mLCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT Kit de Bala de Crescimento de Células-Tronco Mesenquimais HumanasLonzaPT-3001
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Trombina de plasma humanoSigma-AldrichT6884-100UN100 unidades
Tripsina-EDTA (0,05%), fenol vermelhoThermoFisher Scientific25300062
Tripsina-EDTA (0,25%), fenol vermelhoThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Solução de Marcação de CélulasThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Solução de Marcação de CélulasThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Marcação de Células SoluçãoThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio microscópio de fluorescênciaZEISSSE64, densidade de 1.344 &vezes; 1.024 pixels
Placa de Cultura de Células Axiovision de fetal bovino de

Referências

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