Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.
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Artigo de método
Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sequenciamento de célula única permitiu o mapeamento de populações de células heterogêneas no estroma de órgãos hematopoiéticos. Essas metodologias fornecem uma lente através da qual estudar a heterogeneidade anteriormente não resolvida no estado estacionário, bem como as mudanças na representação do tipo de célula induzidas por estresses extrínsecos ou durante o envelhecimento. Aqui, apresentamos protocolos passo a passo para o isolamento de populações de células estromais de alta qualidade do timo murino e humano, bem como do osso murino e da medula óssea. As células isoladas por meio desses protocolos são adequadas para gerar conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade. Os impactos da digestão da amostra, depleção da linhagem hematopoiética, análise/classificação FACS e como esses fatores influenciam a compatibilidade com o sequenciamento de célula única são discutidos aqui. Com exemplos de perfis FACS indicando dissociação bem-sucedida e ineficiente e rendimentos de células estromais a jusante na análise pós-sequenciamento, são fornecidos indicadores reconhecíveis para os usuários. Considerar os requisitos específicos das células estromais é crucial para a aquisição de resultados reprodutíveis e de alta qualidade que possam avançar o conhecimento na área.
Introdução
No adulto saudável, a produção de novo de células sanguíneas ocorre na medula óssea e no timo. As células estromais nesses locais são essenciais para a manutenção da hematopoiese, mas o estroma constitui menos de 1% do tecido 1,2,3,4. A obtenção de isolados puros de hematopoiese que suportam o estroma, portanto, constitui um desafio significativo, particularmente para multiômica de célula única que requer processamento rápido para obter amostras de alta qualidade. Componentes de diferentes coquetéis de digestão podem interferir em certas eta....
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Protocolo
Todo o trabalho com tecido humano foi conduzido após a aprovação do Conselho de Revisão Interna do Hospital Geral de Massachusetts (IRB). Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts (IACUC). Camundongos C57Bl/6, com 8 a 10 semanas de idade, machos e fêmeas, foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação de tecido tímico murino
- Prepare os seguintes tampões e soluções.
- Meio 199 (M199) com 2% (....
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Resultados
Esses protocolos produzem variedades de células estromais reprodutíveis do timo e da medula óssea adequadas para análise de citometria de fluxo, bem como multiômica de célula única, como sequenciamento de scRNA. O tecido tímico murino sofre remodelação significativa em resposta a estressores, como o condicionamento citotóxico que precede o transplante de medula óssea ou o processo natural de envelhecimento. Como consequência, a celularidade tímica é drasticamente reduzida em ambas as configurações (F.......
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Discussão
As células estromais em órgãos hematopoiéticos são críticas para a produção normal de sangue e as perturbações do estroma hematopoiético podem resultar em graves prejuízos na manutenção hematopoiética e na resposta ao estresse 9,23,24. O conhecimento das células estromais hematopoiéticas é essencial para a compreensão das doenças hematológicas 7,9,10,24
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Divulgações
D.T.S. é diretor e acionista da Agios Therapeutics e Editas Medicines; fundador, diretor, acionista e membro do conselho consultivo científico da Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, acionista e fundador da Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics, e diretor, fundador e acionista da Clear Creek Bio, consultor da FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio, e beneficiário de financiamento de pesquisa patrocinado pela Sumitomo Dianippon. DTS e K.G são inventores de patentes US20220143099A1.
Agradecimentos
Fomos apoiados com assistência técnica especializada pela instalação de citometria de fluxo HSCI-CRM no Massachusetts General Hospital e no Bauer Core Facility na Universidade de Harvard. T.K e K.G foram apoiados pelo Conselho de Pesquisa Sueco e C.M. pela Fundação Alemã de Pesquisa. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee pela assistência na análise dos dados de sequenciamento de RNA de célula única.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomicina D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Coquetel de Linhagem Anti-Humana 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Albumina de Soro Bovino | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 camundongos | Jackson | 664 | Machos ou fêmeas, 8-12 semanas de idade |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Filtros de Células Estéreis, Branco, Tamanho da Malha: 70 µ m | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | Kit |
| isolamento RapidSpheres de estreptavidina de camundongo Easysep | StemCell Technologies | 19860 | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco | A31605-01 | Qualificado One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Grau de Pesquisa |
| Médio 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-humano CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-humano CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-humano CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-humano CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-humano CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-humano CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-humano EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protetor Inibidor de RNase | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rato anti-rato CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rato anti-rato CD11b-Biotina | Biolegend | 101204 | |
| Rato anti-rato CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rato anti-rato CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rato anti-rato CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rato anti-rato CD3-Biotina | Biolegend | 100244 | |
| Rato anti-rato CD45.2-Biotina | Biolegend | 109804 | |
| Rato anti-rato CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rato anti-rato CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rato anti-rato CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rato anti-rato CD45R / B220-Biotina | Biolegend | 103204 | |
| Rato anti-rato CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rato anti-rato EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rato anti-rato Ly-6A / E (Sca-1) -AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rato anti-rato Ly-6G / Ly-6C (Gr1) -Biotina | Biolegend 108404 | ||
| Rato anti-rato Ter119-Biotina | Biolegend | 116204 | |
| Rato anti-rato Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rato anti-rato Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | LS004107 | Bioquímica Worthington |
Referências
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations rev....
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Reimpressões e permissões
