Artigo de método

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

DOI:

10.3791/66231

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26 de janeiro de 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O sequenciamento de célula única permitiu o mapeamento de populações de células heterogêneas no estroma de órgãos hematopoiéticos. Essas metodologias fornecem uma lente através da qual estudar a heterogeneidade anteriormente não resolvida no estado estacionário, bem como as mudanças na representação do tipo de célula induzidas por estresses extrínsecos ou durante o envelhecimento. Aqui, apresentamos protocolos passo a passo para o isolamento de populações de células estromais de alta qualidade do timo murino e humano, bem como do osso murino e da medula óssea. As células isoladas por meio desses protocolos são adequadas para gerar conjuntos de dados multiômicos de célula única de alta qualidade. Os impactos da digestão da amostra, depleção da linhagem hematopoiética, análise/classificação FACS e como esses fatores influenciam a compatibilidade com o sequenciamento de célula única são discutidos aqui. Com exemplos de perfis FACS indicando dissociação bem-sucedida e ineficiente e rendimentos de células estromais a jusante na análise pós-sequenciamento, são fornecidos indicadores reconhecíveis para os usuários. Considerar os requisitos específicos das células estromais é crucial para a aquisição de resultados reprodutíveis e de alta qualidade que possam avançar o conhecimento na área.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No adulto saudável, a produção de novo de células sanguíneas ocorre na medula óssea e no timo. As células estromais nesses locais são essenciais para a manutenção da hematopoiese, mas o estroma constitui menos de 1% do tecido 1,2,3,4. A obtenção de isolados puros de hematopoiese que suportam o estroma, portanto, constitui um desafio significativo, particularmente para multiômica de célula única que requer processamento rápido para obter amostras de alta qualidade. Componentes de diferentes coquetéis de digestão podem interferir em certas etapas da análise multiômica 5,6. Os protocolos aqui apresentados detalham o isolamento de uma ampla variedade de células estromais da medula óssea e tecidos tímicos.

Perturbações dos constituintes estromais na medula óssea e no timo resultam em profunda interrupção no desenvolvimento das células sanguíneas e podem resultar em malignidades 7,8,9. A hematopoiese que suporta o estroma é prejudicada após o condicionamento citotóxico e o transplante de medula óssea, resultando em redução da secreção de citocinas e fatores de crescimento que sustentam as células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs)2,10,11. Além disso, o envelhecimento afeta a medula óssea e as células estromais do timo, provavelmente contribuindo para o envelhecimento dos fenótipos hematopoiéticos. O timo é o primeiro órgão a sofrer extensa involução associada à idade. A gordura e o tecido fibrótico começam a substituir o estroma de suporte das células T já no início da puberdade12,13. Na medula óssea, o conteúdo de adipócitos aumenta com a idade e os nichos vascular e endosteal são significativamente remodelados 14,15,16.

Para permitir o estudo do estroma de suporte da hematopoiese em vários estados de estresse e no caso do timo de tecido humano e murino, otimizamos os protocolos de digestão publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Esses protocolos garantem o isolamento eficiente e reprodutível das células e são compatíveis com o sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e outros tipos de multiômica.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todo o trabalho com tecido humano foi conduzido após a aprovação do Conselho de Revisão Interna do Hospital Geral de Massachusetts (IRB). Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts (IACUC). Camundongos C57Bl/6, com 8 a 10 semanas de idade, machos e fêmeas, foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação de tecido tímico murino

  1. Prepare os seguintes tampões e soluções.
    1. Meio 199 (M199) com 2% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) (ver Tabela de Materiais).
    2. Coquetel de dissociação murina: 0,5 WU / mL Liberase TM e 6,3 U / mL DNase I em M199 + 2% FBS (ver Tabela de Materiais).
    3. M199 com albumina de soro bovino (BSA) a 2% (p/v).
      NOTA: O meio contendo FBS pode ser alterado para BSA para melhorar a qualidade do RNA.
  2. Realize a dissecção do timo murino
    1. Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) e colocá-lo de costas. Molhe o pelo no peito borrifando etanol a 70% e prossiga para abrir a cavidade torácica.
    2. Disseque cuidadosamente o timo fazendo primeiro uma incisão transversal logo abaixo da caixa torácica com uma tesoura cirúrgica. Corte as costelas de cada lado do rato até a clavícula. Em seguida, corte o diafragma para que a parede torácica possa ser liberada. Levante as costelas com um par de pinças para expor a cavidade torácica.
      1. O timo é um órgão branco e bilobular, situado no topo da cavidade, logo acima do coração. Segure o timo com a pinça e corte suavemente o tecido conjuntivo que mantém o timo no lugar. Coloque o tecido tímico dissecado no poço de uma placa de 6 poços com M199 + 2% FBS no gelo.
        NOTA: Ao trabalhar com camundongos idosos ou condicionados por radiação ou cepas mutantes com defeitos tímicos, o timo pode ser tão pequeno que um microscópio de dissecção é necessário para extirpar o órgão de forma confiável.
    3. Usando um microscópio de dissecação, remova qualquer tecido extratímico usando uma pinça de ponta romba e uma tesoura de micro-mola.
  3. Realizar dissociação enzimática do tecido tímico murino (30 min em incrementos de 10 min)
    1. Coloque o timo limpo na tampa de um tubo de 15 mL e pique finamente o tecido com uma tesoura cirúrgica estéril.
      NOTA: Picar o tecido na tampa do tubo que será usado para a digestão minimiza a perda de tecido devido à transferência de um recipiente para outro. Isso é muito importante ao trabalhar com camundongos envelhecidos ou condicionados por radiação ou cepas mutantes com defeitos tímicos. O pequeno tamanho do timo nesses ambientes exige a necessidade de reduzir a perda de material sempre que possível.
    2. Adicione 2 mL de coquetel de dissociação murina ao tubo de 15 mL, coloque a tampa contendo os pedaços de timo e inverta 5 vezes para garantir que o tecido seja ressuspenso no coquetel de dissociação.
    3. Para evitar vazamentos, enrole a tampa do tubo em filme de parafina. Em seguida, colocar o tubo horizontalmente num banho-maria a 37 °C com agitação de 250 rpm. Incubar por 10 min.
      NOTA: O sucesso do protocolo de digestão depende da incubação ser realizada a 37 °C e com agitação. O protocolo descrito foi otimizado usando um banho-maria agitado. Se isso não estiver disponível, outras abordagens que permitem a agitação em um ambiente aquecido podem funcionar, mas recomendamos que o protocolo seja otimizado para essas configurações primeiro.
    4. Coloque o tubo de 15 mL em uma prateleira e deixe os pedaços de tecido assentarem. Remova cuidadosamente o sobrenadante e passe-o sobre um filtro de células de 70 μm em um tubo gelado de 50 ml.
    5. Repita as etapas 2 a 4 duas vezes para um total de 3 rodadas de digestão. O tecido deve estar mais ou menos completamente dissociado até o final da última incubação.
    6. Adicione 20 mL de M199 + 2% de FBS à suspensão celular coletada. Gire para baixo a 500 x g por 5 min a 4 °C.
    7. Remover o sobrenadante e ressuspender num volume adequado de M199 + 2% FBS. Em seguida, prossiga para a contagem de células.
      NOTA: O volume de M199 + 2% de FBS para ressuspender dependerá do estado do timo. Para camundongos de 6 a 10 semanas de idade, recomendamos ressuspender o tecido em 3-4 mL de M199 + 2% FBS. No entanto, para experimentos usando tecidos envelhecidos ou condicionados por radiação ou cepas mutantes com defeitos tímicos, o tamanho pequeno do timo exigirá volumes menores, variando de 0,1 a 1 mL.
    8. Conte as células diluindo a suspensão celular 1:2 em solução de azul de tripano a 0,4% (p/v). Carregue as células em um hemocitômetro e conte em um microscópio de campo claro. Conte as células não coradas para determinar o número de células vivas por mililitro e o número de células coradas de azul para avaliar a viabilidade da amostra.
  4. Realizar a classificação celular ativada por fluorescência do estroma tímico murino
    1. Gire as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspenda as células a uma concentração de 5 x 107 células / mL em M199 + 2% FBS suplementado com 25 U / mL de inibidor de RNase protetora (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Adicione o bloco Fc murino (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração de 2 μg / mL e incube por 10 min a 4 ° C.
    3. Manchar as células com os seguintes anticorpos: CD45-PE/Cy7 (4 μg/ml), Ter119-PE (4 μg/ml), CD31-BUV737 (2 μg/ml) e EpCam-BV711 (2 μg/ml) (ver Tabela de Materiais) durante 30 min a 4 °C.
    4. Lave as amostras em M199 + 2% BSA e gire para baixo a 500 x g por 5 min a 4 °C.
    5. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em M199 + 2% BSA contendo um corante de viabilidade como DAPI (0,5 μg / mL) ou 7-AAD (1 μg / mL) (consulte a Tabela de Materiais). Proceder ao isolamento FACS de células estromais tímicas seguindo protocolos estabelecidos19.

2. Preparação de tecido tímico humano

  1. Prepare os seguintes tampões e soluções.
    1. Médio 199 (M199) com 2% (v/v) FBS.
    2. M199 com 1,5% (p / v) BSA.
    3. Coquetel de dissociação humana: 1 mg / ml de colagenase IV e 2 mg / mL de dispase e 6,3 U / mL de DNase I em M199 + 1,5% BSA (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: A última etapa da digestão na preparação do tecido tímico humano inclui tripsina. Portanto, é essencial que todas as etapas até esse ponto sejam realizadas em tampão contendo BSA, pois o FBS inibirá a atividade da tripsina.
  2. Realize o isolamento do tecido tímico humano
    1. Colocar o timo humano (colhido de acordo com o método19 publicado anteriormente) num volume adequado de M199 + 1,5% de BSA e guardá-lo em gelo até ao início do processamento.
    2. Ao trabalhar com tecido tímico humano, manuseie-o como se fosse potencialmente infeccioso, realizando o trabalho em uma capa de cultura de tecidos e usando precauções padrão de acordo com as diretrizes do CDC20.
    3. Coloque o tecido em uma placa de Petri de 10 cm com 10 mL de M199 gelado + 1,5% de BSA. Usando pinças e tesouras estéreis, limpe cuidadosamente a gordura extratímica ou o tecido que foi danificado durante a extração do órgão.
    4. Usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça, corte o timo em cubos de 1 cme 3 e use o êmbolo de uma seringa de 10 mL para empurrar suavemente as peças. Isso liberará alguns dos timócitos em desenvolvimento, reduzindo assim o volume de tecido a ser digerido.
      NOTA: Guarde a fração hematopoiética liberada se for necessária uma análise subsequente dos estágios de desenvolvimento dos timócitos. No entanto, não combine esta fração com a fração de células estromais gerada durante a digestão enzimática. Observou-se que agrupar as duas frações aumenta significativamente o risco de formação de obstruções na suspensão celular, reduzindo o rendimento de células estromais. Poucas células estromais são perdidas durante o esmagamento suave do tecido.
  3. Realizar dissociação enzimática do tecido tímico humano (90 min em incrementos de 30 min)
    1. Transfira aproximadamente 5 mg dos pedaços de tecido tímico levemente esmagados para a tampa de um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, corte o tecido finamente usando uma tesoura cirúrgica estéril.
    2. Pipete 8 mL de coquetel de dissociação humana no tubo de 50 mL, coloque a tampa contendo o tecido tímico humano picado e, em seguida, inverta suavemente o tubo 5 vezes para garantir que todo o tecido seja misturado com o coquetel de enzimas.
    3. Prenda a tampa do tubo com filme de parafina para evitar vazamentos. Incubar o tubo horizontalmente em banho-maria agitado (250 rpm) a 37 °C durante 30 min.
    4. Coloque o tubo de 50 ml numa grelha e deixe assentar os pedaços de tecido tímico humano antes de retirar o sobrenadante e passá-lo sobre um filtro de células de 70 μm para um novo tubo de 50 ml colocado sobre gelo.
    5. Repita as etapas 2.3.2-1.3.4 para um total de duas rodadas de digestão com o coquetel de dissociação humana.
    6. Após a segunda rodada de digestão, adicione mais 8 mL do coquetel de dissociação humana ao tecido restante. Em seguida, pipete também 2 mL de tripsina a 0,25% no tubo de dissociação tecidual. Incubar por mais 30 min a 37 °C, agitando a 250 rpm.
      NOTA: É absolutamente essencial que o tempo de digestão do tecido humano seja de pelo menos 90 minutos, pois tempos de incubação mais curtos levam a rendimentos de células estromais drasticamente reduzidos.
    7. Uma vez concluída a última etapa de incubação, agrupar a suspensão celular e os fragmentos de tecido restantes com o sobrenadante coletado nas etapas anteriores, passando por um filtro de células de 70 μm. Adicione 3 mL de FBS à amostra para quebrar a reação de tripsina e coloque no gelo.
    8. Prossiga para a contagem das células conforme descrito na etapa 1.3.
  4. Realizar a classificação celular ativada por fluorescência do estroma tímico humano
    1. Gire a suspensão celular do timo humano e ressuspenda a uma concentração de 5 x 107 células / mL em M199 + 2% FBS suplementado com 25 U / mL de inibidor de RNase protetora.
    2. Incubar com Fc Block humano (5 μg/mL) (ver Tabela de Materiais) durante 10 min a 4 °C.
    3. Pinte a amostra por 30 min a 4 ° C com CD45-BV711 (2,5 μg / mL), CD235a-BV711 (2,5 μg / mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg / mL), CD66b-FITC (amostra de 20 μL / 100 μL), CD8-APC / Cy7 (amostra de 5 μL / 100 μL), CD4-BV605 (amostra de 5 μL / 100 μL), CD31-PE / Dazzle594 (10 μg / mL) e EpCam-BV421 (2,5 μg / mL) (consulte a Tabela de Materiais).
    4. Lave as amostras em M199 + 1,5% BSA e gire a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
    5. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em M199 + 1,5% BSA contendo um corante de viabilidade como DAPI (0,5 μg / mL) ou 7-AAD (1 μg / mL). Proceder ao isolamento FACS de células estromais tímicas seguindo protocolos estabelecidos19.

3. Preparação de osso murino e tecido da medula óssea

NOTA: As frações ósseas e da medula óssea são preparadas em duas reações de digestão separadas para obter a máxima pureza das células estromais e a dissociação ideal dos tecidos. As amostras podem ser agrupadas após as etapas de digestão para serem classificadas como um compartimento estromal.

  1. Prepare os seguintes tampões e soluções.
    1. M199 com 2% (v/v) FBS.
    2. Coquetel de dissociação Murine B&M (osso e medula): Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL e 10 U/mL DNase I (ver Tabela de Materiais) em M199 +2% FBS.
      NOTA: Prepare a mistura de dissociação B&M fresca e mantenha a mistura no gelo até o uso.
    3. M199 com 0,5% (p / v) BSA.
    4. Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 0,5% (p/v) de BSA.
    5. M199 com 2% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA.
      NOTA: O FBS contendo meio pode ser alterado para BSA para melhorar a qualidade do RNA.
  2. Realize a separação da medula óssea murina
    1. Eutanasiar o camundongo por asfixia por CO2 (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Pulverize com etanol 70% para molhar o pelo.
    2. Remova cuidadosamente o fêmur, tíbia, pelve e úmero de cada lado e coloque-os em um poço contendo M199 + 2% FBS em gelo21,22.
    3. Remova todo o tecido muscular, ligamentar e cartilaginoso com lenços de tecido para minimizar os danos ao osso e preservar a camada periosteal. Coloque-os em um novo poço com M199 + 2% FBS no gelo.
    4. Use um bisturi e corte as placas de crescimento dos ossos longos para remover a epífise e coloque-o em um prato de 10 cm com M199 + 2% FBS no gelo.
    5. Retire a medula óssea dos ossos até ficar branca clara. Use uma agulha de 28 G e uma seringa de 10 mL cheia de 10 mL de M199 + 2% de FBS para lavar a medula em um tubo de 15 mL no gelo. Coloque o osso lavado no prato de 10 cm com a epífise.
      NOTA: A lavagem completa da medula óssea para a separação total dos tecidos resultará em uma melhor preparação da amostra.
  3. Realizar dissociação enzimática do tecido da medula óssea murina (total de 30 min em incrementos de 10 min)
    1. Deixe o tubo de 15 mL em pé no gelo até que a medula afunde no fundo do tubo. Remova lentamente os 10 mL de M199 + 2% de FBS pipetando.
    2. Adicione 4 mL de coquetel de dissociação B&M ao tubo de 15 mL e coloque-o em banho-maria a 37 °C (sem agitação) por 10 min.
    3. Após 5 min, inverta o tubo três vezes e coloque-o de volta no banho-maria.
    4. Após os primeiros 10 minutos, certifique-se de que o pellet esteja no fundo e colete o sobrenadante enquanto filtra através de um filtro de células de 70 μm em um tubo gelado de 50 mL. Adicione 2 mL de coquetel de dissociação B&M fresco ao pellet BM restante e coloque-o de volta no banho-maria.
    5. Dissocie quaisquer pedaços de medula óssea restantes pipetando vigorosamente usando uma pipeta de 1 mL. Colete toda a suspensão celular resultante no mesmo tubo das etapas anteriores. Adicione 20 mL de M199 + 0,5% BSA + 2 mM EDTA à suspensão celular coletada.
      NOTA: Na etapa 3.3.5, o tampão adicionado após a amostra final digerida contém EDTA para ajudar a inibir a atividade enzimática adicional.
  4. Realize a depleção de células hematopoiéticas do tecido da medula óssea murina.
    1. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda em 500 μL de PBS + 0,5% de BSA com anticorpos de biotina (5 mg / mL) direcionados a CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 e CD3 (ver Tabela de Materiais). Transfira para um tubo de fundo redondo com tampa.
    2. Incube em um agitador orbital por 10 min em temperatura ambiente no escuro.
    3. Vortex os grânulos magnéticos completamente e adicione 25 μL de grânulos magnéticos ao tubo.
    4. Incube em um agitador orbital por 5 min em temperatura ambiente no escuro.
    5. Coloque o tubo no ímã correspondente por 2-3 min e colete o sobrenadante em um tubo novo.
      NOTA: A medula óssea pode ser agrupada ou mantida separada da fração óssea após esta etapa. Se a depleção da linhagem for bem-sucedida, a suspensão celular resultante deve ser desprovida de glóbulos vermelhos.
  5. Realize a dissociação enzimática do tecido ósseo murino.
    1. Quebre os ossos em pedaços menores no prato de 10 cm com a extremidade plana de um tubo de 50 mL. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de células de 70 μm para isolar os fragmentos ósseos no interior do filtro.
      NOTA: Alternativamente, um almofariz e pilão podem ser usados para fragmentação óssea. Essa opção, no entanto, tende a gerar mais detritos e menor viabilidade das células estromais quando o osso é moído em vez de quebrado. As células do estroma ainda estão ligadas ao osso e no osso, e o sobrenadante contendo células hematopoiéticas deve ser descartado.
    2. Use uma tesoura para cortar os fragmentos ósseos no filtro de células. Isso aumentará a área de superfície para uma dissociação enzimática mais eficiente. Lave o osso com 5 mL de M199 + 2% de FBS.
    3. Coloque a fração óssea em 5 mL de dissociação murina B & M (ver Tabela de Materiais) misture em um novo tubo de 50 mL.
    4. Para evitar vazamentos, enrole a tampa do tubo em filme de parafina. Em seguida, coloque o tubo horizontalmente em banho-maria a 37 °C com agitação de 120 rpm por 30 min.
    5. Após a digestão, adicione 25 mL de M199 + 0,5% BSA + 2 mM de EDTA e filtre o sobrenadante contendo as células estromais através de um filtro de células de 70 μm em um tubo gelado de 50 ml.
      NOTA: Verifique se os fragmentos ósseos resultantes foram visivelmente diminuídos pela digestão. Na etapa 3.5.5, o tampão adicionado após a amostra final digerida contém EDTA para ajudar a inibir a atividade enzimática adicional.
  6. Realize a classificação de células ativadas por fluorescência do osso murino e do estroma da medula óssea.
    1. Gire as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
    2. Ressuspenda em bloco Fc murino a uma concentração de 10 μg / mL em PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e incube por 10 min a 4 ° C.
    3. Corar as células (até 10 milhões de células/100 μL de volume total de coloração) com os seguintes anticorpos: CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL), CD31-BV421 (0,66 μg/mL), CD140a-APC (2 μg/mL), Sca1-AF700 (0,66 μg/mL), CD51-PE (2 μg/mL), CD105-PE/encandeamento (2 μg/mL) (ver Tabela de Materiais).
    4. Deixe a calceína-AM equilibrar à temperatura ambiente e ressuspender em 50 μL de DMSO. Prepare-se fresco para cada uso. Manter à temperatura ambiente após a ressuspensão. Pré-diluir a calceína em PBS (0,1 mg/ml) antes de adicionar à amostra (20 μg/ml) já ressuspensa no cocktail de coloração de anticorpos e incubar durante 20-30 min a 4 °C no escuro.
    5. Lave as amostras em PBS + BSA 0,5% + EDTA 2 mM e centrifugue a 500 x g por 5 min a 4 °C.
    6. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em PBS + BSA 0,5% + EDTA 2 mM. Proceder ao isolamento FACS de células estromais ósseas e da medula óssea seguindo protocolos estabelecidos19.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esses protocolos produzem variedades de células estromais reprodutíveis do timo e da medula óssea adequadas para análise de citometria de fluxo, bem como multiômica de célula única, como sequenciamento de scRNA. O tecido tímico murino sofre remodelação significativa em resposta a estressores, como o condicionamento citotóxico que precede o transplante de medula óssea ou o processo natural de envelhecimento. Como consequência, a celularidade tímica é drasticamente reduzida em ambas as configurações (Figura 1A). Enquanto um timo de um camundongo selvagem de 8 semanas contém aproximadamente 100 milhões de células, pode-se esperar que a celularidade de um camundongo de 2 anos seja metade disso, e um timo 4 dias após a irradiação e o transplante de medula óssea pode ser tão baixo quanto 5,00,000 células (Figura 1A).

O condicionamento citotóxico preferencialmente ablação das células hematopoiéticas, de modo que o compartimento estromal será proporcionalmente enriquecido (Figura 1B). No entanto, a baixa celularidade geral tornará desafiador o isolamento de um número suficiente de células estromais tímicas. Pode, portanto, ser necessário agrupar animais para obter números de células compatíveis com aplicações multiômicas a jusante e minimizar a perda de material sempre que possível. Para realizar multiômica em células estromais tímicas, a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de células CD45-Ter119- vivas e únicas (Figura 1C) garantirá que um número suficiente de células possa ser classificado na maioria das condições de estresse.

Para preservar a heterogeneidade do compartimento do estroma, normalmente não classificamos um único marcador de estroma positivo, mas bloqueamos as células hematopoiéticas. A inclusão de marcadores positivos de células estromais ainda é recomendada para análise para garantir que a dissociação tecidual adequada tenha sido alcançada. No entanto, o isolamento do FACS é imperfeito e, conforme determinado pelo scRNAseq, 30% -50% das células selecionadas serão de origem hematopoiética (Figura 1D, E). Isso pode ser melhorado com o esgotamento magnético das células CD45+ antes do FACS; no entanto, isso não é recomendado para condições de celularidade tímica reduzida (Figura 1A), pois a perda de material que vem com o processamento extra envolvido na depleção magnética resulta em rendimentos de estroma muito baixos para aplicações a jusante.

Para o isolamento do estroma tímico humano, a etapa mais crítica é a digestão enzimática. Se a etapa de dissociação for apressada, o rendimento geral das células estromais, bem como a representação do subtipo de células estromais, serão severamente diminuídos (Figura 2A). Também é recomendável sempre incluir os marcadores de endotélio tímico e epitélio para garantir que a digestão do tecido tenha sido ideal, pois simplesmente o bloqueio negativo para marcadores hematopoiéticos não será suficiente para avaliar a liberação real de células estromais. Isso é exemplificado na Figura 2A, onde a porcentagem de células negativas para marcadores hematopoiéticos é maior na amostra digerida por 30 min em comparação com a amostra incubada por 90 min. No entanto, como visto no portão consecutivo, o rendimento de células endoteliais e epiteliais é muito pobre no protocolo de digestão mais curto (Figura 2A).

Para o isolamento FACS de células estromais tímicas humanas para aplicações multiômicas, sugere-se a coloração com um coquetel de anticorpos de linhagem hematopoiética, bem como anticorpos CD4 e CD8, além do marcador pan-hematopoiético CD45 e do marcador eritróide CD235a (Figura 2B) para melhorar o enriquecimento das células estromais. Assim, para a análise multiômica humana do estroma tímico, as células vivas, únicas, CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- devem ser classificadas por FACS (Figura 2B). Como visto para scRNAseq de amostras murinas, isso ainda resulta na contaminação de 30% -50% das células hematopoiéticas, mas ainda fornece uma resolução aceitável do compartimento estromal do timo humano ( Figura 2C , D ).

Para o estroma ósseo e MO, foi utilizada a mesma estratégia para o tecido tímico; as células estromais são isoladas por gating em células negativas para marcadores hematopoiéticos, e outros marcadores de células estromais são incluídos como controles de digestão (Figura 3). A dissociação do tecido calcificado como o osso resulta em um acúmulo significativo de detritos. A adição de calceína como corante de viabilidade permitirá a exclusão da maioria desses detritos, o que, de outra forma, infla falsamente os números classificados e diminui as frequências da população fechada (Figura 3). Isso é exemplificado nos gráficos FACS comparando o gating em todas as células e apenas o gating no Calcein + (Figura 3). Como visto para células estromais tímicas humanas, a porcentagem de células negativas para marcadores hematopoiéticos não é uma leitura confiável para a eficiência de dissociação óssea e de tecido MO (Figura 3). Embora a porta CD45-Ter119- possa conter uma abundância de células em uma amostra em que a etapa de digestão falhou, uma análise mais aprofundada dos marcadores típicos de células estromais ósseas e BM CD31, CD140a e CD51 demonstra claramente baixa liberação de estroma (Figura 3 e Figura 4).

Para o isolamento FACS de osso murino e células estromais BM, sugere-se o uso da estratégia de gating como na Figura 3, onde classificamos apenas CD45-Ter119-Calceína +, mas monitoramos as propriedades de dispersão direta e lateral e a expressão do marcador de células estromais da população classificada para garantir a digestão ideal ( Figura 3A ). A combinação de depleção de células magnéticas positivas para linhagem hematopoiética da medula óssea antes do FACS e classificação nas portas mostradas resulta no sequenciamento de células unicelulares com estroma de >90%. Um exemplo de tal sequência de scRNA (Figura 5A, B) ilustra essa baixa contaminação hematopoiética após anotação baseada em transcriptoma das células analisadas (exemplos de genes marcadores hematopoiéticos Figura 5C). Isso contrasta fortemente com as preparações estromais tímicas, onde a depleção de células magnéticas não foi realizada antes da etapa de classificação devido ao material inicial limitado no tecido tímico pós-transplante (Figura 1F).

figure-results-1
Figura 1: Análise de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única do estroma tímico murino. (A) Quantificação do número de timócitos em camundongos de 8 semanas de idade (Controle), camundongos de 8 semanas letalmente irradiados e transplantados 4 dias antes (Transplante) e camundongos de 2 anos (Idoso). (B) Gráficos representativos de citometria de fluxo demonstrando o enriquecimento em subtipos de células estromais 4 dias após a irradiação letal e o transplante. (C) Estratégia de bloqueio por citometria de fluxo para classificar o estroma tímico murino para análise multiômica de célula única. (D) UMAP do timo murino indicando estroma (azul) e células hematopoiéticas (vermelho). (E) UMAPs mostrando genes marcadores hematopoiéticos murinos em amostras de timo. (F) Quantificação de células estromais murinas e hematopoiéticas em amostras de scRNAseq do timo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análise de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única do estroma tímico humano. (A) Gráficos FACS mostrando resultados representativos do impacto de diferentes tempos de digestão na liberação de populações de células estromais tímicas humanas. (B) Estratégia de bloqueio por citometria de fluxo para classificar o estroma tímico humano para análise multiômica de célula única. (C) UMAP do timo humano indicando estroma (azul) e células hematopoiéticas (vermelho). (D) UMAPs mostrando genes marcadores hematopoiéticos humanos em amostras de timo. (E) Quantificação de células estromais e hematopoiéticas humanas em amostras de scRNAseq do timo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Marcadores estromais da medula óssea murina e calceína são úteis para estimar a eficiência da dissociação. (A) Análise de citometria de fluxo representativa de células estromais da medula óssea murina CD45-Ter119- bloqueadas em todas as células e células Calceína +. Com a subsequente ativação de CD31- mostrando uma proporção maior de células CD140a + CD51 + ao selecionar células Calcein +. (B) Análise de citometria de fluxo representativa de uma falha na digestão óssea com células CD140a + CD51 + ausentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Estratégia de gating do estroma da medula óssea. (A) Estratégia de gating de citometria de fluxo para classificar o estroma da medula óssea murina para multiômica de célula única. (B) Análise de citometria de fluxo representativa de uma digestão de medula óssea com células CD140a + CD51 + ausentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Sequenciamento de RNA de célula única da medula óssea com composição de células estromais e hematopoiéticas. (A) UMAP de osso murino e medula óssea indicando estroma (azul) e células hematopoiéticas (vermelho). (B) Quantificação de células estromais e hematopoiéticas em amostras de osso murino e medula óssea. (C) UMAP de genes marcadores hematopoiéticos em amostras de medula óssea murina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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As células estromais em órgãos hematopoiéticos são críticas para a produção normal de sangue e as perturbações do estroma hematopoiético podem resultar em graves prejuízos na manutenção hematopoiética e na resposta ao estresse 9,23,24. O conhecimento das células estromais hematopoiéticas é essencial para a compreensão das doenças hematológicas 7,9,10,24 e para a capacidade de desenvolver terapêuticas para combatê-las25,26. A separação reprodutível do estroma hematopoiético do parênquima é, no entanto, um desafio, particularmente com o advento da multiômica de célula única, que requer preparações de amostras de alta qualidade, maximizando o rendimento e a variedade das células estromais. Os protocolos descritos aqui foram otimizados para serem compatíveis com a maioria das aplicações multiômicas a jusante, ao mesmo tempo em que atendem aos desafios de isolar células estromais hematopoiéticas 1,2,19.

A primeira questão a considerar para o isolamento de células estromais hematopoiéticas são as condições de dissociação. A dissociação ideal é fundamental para liberar as células do estroma do tecido para refletir a heterogeneidade total do compartimento do estroma 1,2. A escolha da mistura de dissociação correta depende do escopo experimental e dos protocolos a jusante. Recomendamos preparar as misturas de dissociação o mais fresco possível e mantê-las no gelo até o uso. Alguns componentes são difíceis de dissolver, como dispase, e podem exigir mais tempo para a mistura da pipeta. O vórtice não é recomendado, pois isso pode interromper a conformação nativa das enzimas de digestão, levando à sua inativação. É importante ressaltar que o EDTA inibe a atividade enzimática e deve ser evitado durante as etapas de digestão ativa, mas pode ser empregado para interromper a reação se a enzima contendo tampão não puder ser removida imediatamente. Além da própria mistura enzimática, dois pontos são críticos para a dissociação eficiente do tecido, (1) esmagamento e corte completos para aumentar a área de superfície e (2) tempo de incubação suficiente com as enzimas de digestão. O tecido tímico humano é, por exemplo, significativamente mais difícil de dissociar do que o tecido murino e, portanto, os tempos de digestão devem ser mais longos. Se o ajuste não for feito para o tecido humano, o rendimento estromal e a variedade celular serão reduzidos (Figura 2A). As enzimas de dissociação requerem uma temperatura ótima de 37 °C, o que inevitavelmente influencia a expressão gênica27. Embora a dissociação a frio ou a temperaturas mais baixas seja desejável para conservar os estados celulares, atualmente não existem combinações de enzimas de dissociação ativas a frio disponíveis comercialmente adequadas para ossos e medula óssea. Para qualquer tecido que necessite de digestão, a heterogeneidade e a contribuição percentual adquirida de diferentes tipos de células invariavelmente mudarão com o tempo de digestão, composição do coquetel enzimático e processamento. A jusante dessas etapas iniciais, a heterogeneidade e a representação serão ainda mais limitadas pelas etapas de filtração, como tamanhos de bicos durante a classificação e captura de tipos de células desafiadores (por exemplo, adipócitos do estroma) e diâmetros de canal do dispositivo fluídico. Assim, ao comparar conjuntos de dados, devemos estar cientes de que essas diferenças nos protocolos podem afetar a representação de subpopulações. Segue-se logicamente que devemos estar vigilantes para manter as etapas de processamento iguais ao medir o impacto de perturbações em sistemas estromais.

Embora o custo do sequenciamento tenha diminuído e esteja diminuindo, as tecnologias de célula única geralmente são limitadas pelo número de células que podem ser analisadas. Para otimizar a capacidade de cada kit de reagentes, a depleção magnética de células hematopoiéticas foi empregada sempre que possível. Isso permite evitar um grande número de células contaminantes que são muito mais numerosas do que o estroma na medula óssea e nas frações de amostras tímicas. No entanto, se o material de partida for limitado, como no caso do tecido tímico pós-transplante, o aumento da perda inespecífica de células que as estratégias de depleção magnética invariavelmente incorrem pode tornar isso desaconselhável. Além disso, durante o preparo e digestão dos tecidos, o esmagamento, o corte e a liberação enzimática dos componentes da matriz extracelular geram uma grande quantidade de detritos. Esse tipo de contaminante, se deixado na amostra para análise, pode causar problemas de entupimento no processamento a jusante, causar poços negativos para classificação de índice de célula única e inflar muito as porcentagens de porta pai na análise. A coloração com calceína foi usada para portar positivo para células/células vivas. A calceína vem em cores diferentes, o que a torna altamente adaptável à sua matriz de coloração. Ao trabalhar com calceína, tome cuidado para não submeter o corante a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento (ou seja, sempre prepare fresco e mantenha em temperatura ambiente após a dissolução).

A capacidade de multiplexar amostras com base em anticorpos com código de barras com DNA oligos28 permite maior utilidade de reações de sequenciamento de célula única em plataformas como 10x Genomics. Os anticorpos de hashtag projetados para multiplexação de amostras vêm com alvos diferentes para moléculas de superfície celular ou membrana nuclear e especificidade para camundongos e humanos. Embora o sistema de hashtagging celular tenha sido usado com sucesso para vários tecidos, experimentos que combinam misturas de enzimas de digestão com o uso subsequente de hashtags podem levar a uma recuperação drasticamente reduzida. Tentamos incluir etapas adicionais de lavagem pós-dissociação e adicionamos EDTA para inibir a atividade das enzimas de digestão. No entanto, mesmo com essas etapas, espere uma identificação de hashtag menor do que as células hematopoiéticas. Verificou-se que, com protocolos de digestão enzimática, as taxas de captura de hashtag estavam entre 30% e 70%. Isso ocorre apesar do fato de que o mesmo clone de anticorpo com um conjugado de fluorocromo marcou >90% das células estromais na mesma população. Qualquer projeto experimental que combine a digestão enzimática do tecido com hashtagging deve ser testado e cuidado para garantir a inibição enzimática.

Divulgações

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D.T.S. é diretor e acionista da Agios Therapeutics e Editas Medicines; fundador, diretor, acionista e membro do conselho consultivo científico da Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, acionista e fundador da Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics, e diretor, fundador e acionista da Clear Creek Bio, consultor da FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio, e beneficiário de financiamento de pesquisa patrocinado pela Sumitomo Dianippon. DTS e K.G são inventores de patentes US20220143099A1.

Agradecimentos

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Fomos apoiados com assistência técnica especializada pela instalação de citometria de fluxo HSCI-CRM no Massachusetts General Hospital e no Bauer Core Facility na Universidade de Harvard. T.K e K.G foram apoiados pelo Conselho de Pesquisa Sueco e C.M. pela Fundação Alemã de Pesquisa. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee pela assistência na análise dos dados de sequenciamento de RNA de célula única.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomicina D)BD Biosciences559925
Coquetel de Linhagem Anti-Humana 3-FITCBD Biosciences643510
Albumina de Soro BovinoMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 camundongosJackson664Machos ou fêmeas, 8-12 semanas de idade
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Filtros de Células Estéreis, Branco, Tamanho da Malha: 70 µ mFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083  Kit
isolamento RapidSpheres de estreptavidina de camundongo EasysepStemCell Technologies19860
Soro Fetal BovinoGibcoA31605-01Qualificado One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Grau de Pesquisa
Médio 199Gibco12350
Mouse anti-humano CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-humano CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-humano CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-humano CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-humano CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-humano CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-humano EpCam-BV421Biolegend324220
Protetor Inibidor de RNaseMillipore Sigma3335402001
Rato anti-rato CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rato anti-rato CD11b-BiotinaBiolegend101204
Rato anti-rato CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rato anti-rato CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rato anti-rato CD31-BV421Biolegend102424
Rato anti-rato CD3-BiotinaBiolegend100244
Rato anti-rato CD45.2-BiotinaBiolegend109804
Rato anti-rato CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rato anti-rato CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rato anti-rato CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rato anti-rato CD45R / B220-BiotinaBiolegend103204
Rato anti-rato CD51-PEBiolegend104106
Rato anti-rato EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rato anti-rato Ly-6A / E (Sca-1) -AF700Biolegend108142
Rato anti-rato Ly-6G / Ly-6C (Gr1) -BiotinaBiolegend 108404
Rato anti-rato Ter119-BiotinaBiolegend116204
Rato anti-rato Ter119-PEBiolegend116208
Rato anti-rato Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme LS004107Bioquímica Worthington
de 2500 U/mL

Referências

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