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Artigo de método

Modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão

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DOI:

10.3791/66232

⸱

12 de abril de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

Neste artigo

Aviso de errata

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Resumo

O protocolo descreve um método viável, confiável e reprodutível de pinçamento hilar pulmonar esquerdo que pode ser usado para estudar a lesão de isquemia-reperfusão pulmonar em modelos de camundongos.

Resumo

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) durante o transplante pulmonar é um importante fator de risco para complicações pós-transplante, incluindo disfunção primária do enxerto, rejeição aguda e crônica e mortalidade. Os esforços para estudar os fundamentos do IRI levaram ao desenvolvimento de um modelo de camundongo confiável e reprodutível de pinçamento hilar do pulmão esquerdo. Este modelo envolve um procedimento cirúrgico realizado em um camundongo anestesiado e intubado. Uma toracotomia esquerda é realizada, seguida por mobilização pulmonar cuidadosa e dissecção do hilo pulmonar esquerdo. O clamp hilar envolve a ligadura de sutura reversível do hilo pulmonar com um nó corrediço, que interrompe a entrada arterial, o fluxo venoso e o fluxo de ar através do brônquio principal esquerdo. A reperfusão é iniciada pela remoção cuidadosa da sutura. Nosso laboratório utiliza 30 min de isquemia e 1 h de reperfusão para o modelo experimental nas investigações atuais. No entanto, esses períodos de tempo podem ser modificados dependendo da questão experimental específica. Imediatamente antes do sacrifício, a gasometria arterial pode ser obtida do ventrículo esquerdo após um período de 4 minutos de pinçamento hilar direito para garantir que os valores de PaO2 obtidos sejam atribuídos apenas ao pulmão esquerdo lesado. Também descrevemos um método para medir o extravasamento celular com citometria de fluxo, que envolve injeção intravenosa de um anticorpo marcado com fluorocromo específico para a(s) célula(s) a ser(em) estudada(s) antes do sacrifício. O pulmão esquerdo pode então ser colhido para citometria de fluxo, congelado ou fixo, imuno-histoquímica embebida em parafina e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Esta técnica de pinça hilar permite um estudo detalhado dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à IRI. Resultados representativos revelam diminuição da oxigenação do pulmão esquerdo e evidência histológica de lesão pulmonar após pinçamento hilar. Essa técnica pode ser prontamente aprendida e reproduzida por funcionários com e sem experiência em microcirurgia, levando a resultados confiáveis e consistentes e servindo como um modelo amplamente adotável para o estudo da IRI pulmonar.

Introdução

A IRI durante o transplante de órgãos é um importante fator de risco para disfunção primária do enxerto e episódios posteriores de rejeição do enxerto 1,2. Durante o transplante, o tempo de isquemia quente é definido como o período de tempo desde o pinçamento cruzado aórtico do doador até o início da perfusão fria e desde a remoção do órgão do gelo até o implante do órgão. O tempo de armazenamento refrigerado é definido como o período de tempo desde o início da perfusão fria até a remoção do órgão do gelo3. A isquemia quente é mais deletéria para a função orgânica tardia do que a isquemia fria 4,5,6, e seus mecanismos subjacentes justificam um estudo mais aprofundado em modelos pré-clínicos. Além disso, o transplante de órgãos por doação após morte cardíaca (DCD) está associado a tempos isquêmicos quentes mais longos do que a doação tradicional após morte encefálica (DBD)7. Embora o uso de doadores DCD possa expandir o pool de doadores e aumentar a utilização pulmonar, são necessários mais estudos pré-clínicos para avaliar os efeitos da isquemia quente na função pulmonar pós-transplante. Abaixo, descrevemos um modelo de IRI quente em camundongos por meio do grampo hilar pulmonar esquerdo.

Vários modelos animais de pinçamento hilar pulmonar foram desenvolvidos e adaptados nos últimos anos e podem incluir o uso de um clamp microvascular atraumático 8,9,10,11,12,13, um torniquete Rumel 14,15 ou ligadura de sutura16 como o grampo hilar. O ponto crucial do grampo hilar é que ele deve ser reversível e causar danos mínimos ou nenhum dano às estruturas hilares para que a reperfusão possa ser alcançada. Aqui, descrevemos nossa técnica de pinça hilar em camundongos que envolve ligadura de sutura reversível do hilo pulmonar esquerdo com um nó corrediço. Este método oclui o fluxo arterial pulmonar, o fluxo venoso e o fluxo de ar para dentro e para fora do brônquio principal. O principal benefício de um nó corrediço sobre uma pinça vascular, clipe ou torniquete é que o tórax pode ser fechado durante períodos prolongados de isquemia, minimizando assim a perda insensível de fluido e calor no camundongo. Fornecemos um protocolo para obter medições confiáveis de gasometria arterial (ABG) e para medir o extravasamento celular após o pinçamento hilar.

Essa técnica de pinça hilar ocupa um lugar importante no estudo mais amplo do transplante de pulmão. Em comparação com modelos de pequenos animais de transplante pulmonar ortotópico, a técnica de pinça hilar pode isolar os efeitos da IRI sem a adição de trauma anastomótico cirúrgico ou alogenicidade17. Além disso, a técnica do grampo hilar pode ser dominada com mais facilidade e rapidez do que o transplante de pulmão de camundongo. De fato, usando técnicas de clamp hilar, vários mecanismos importantes na patogênese da IRI foram identificados na última década, como TLR4, NADPH oxidase e receptor de adenosina A2A 14,18,19,20. No protocolo a seguir, apresentamos um método confiável, ensinável e reprodutível de pinçamento hilar como ferramenta para estudar a IRI pulmonar.

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Protocolo

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Os animais receberam cuidados humanos em conformidade com o Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório,8ª edição21 preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde, e os Princípios de cuidados com animais de laboratório formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica.

1. Anestesia e intubação

  1. Selecione um mouse que pese pelo menos 25 g. Isso facilitará a intubação devido ao orifício maior entre as cordas vocais.
  2. Injete no camundongo por via intraperitoneal uma mistura de cetamina (dose de 100 mg / kg de peso corporal) e xilazina (dose de 10 mg / kg de peso corporal). Esta mistura deve ser carregada em uma seringa de 1/2 cc com uma agulha 29G de 1/2 polegada. Aguarde cerca de 5 minutos para que a cetamina faça efeito - o camundongo não deve exibir movimento espontâneo e não responde a uma pitada do dedo do pé, o que confirma a anestesia adequada.
  3. Injete buprenorfina (dose de 0,05 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea antes da cirurgia para controle adicional da dor.
  4. Aplique pomada oftálmica não medicamentosa em ambos os olhos para evitar a dessecação da córnea durante a cirurgia.
  5. Raspe o mouse com um aparador sobre o tórax esquerdo e as costas (consulte a Figura 1A), estendendo-se até o abdômen se a laparotomia for planejada (consulte a etapa 5.3).
  6. Uma vez que o camundongo esteja anestesiado, execute a intubação usando uma configuração de intubação preferida e o restante do procedimento sob um microscópio sobre um tapete aquecido a ~ 37 ° C (para manter a normotermia no camundongo).
  7. Depois de obter uma visão adequada das cordas vocais, insira um introdutor caseiro (ver Figura 1 suplementar) com uma curva na extremidade em um angiocateter 20G de 1 polegada, que é usado como tubo endotraqueal (TET). Guie a ponta do introdutor e, em seguida, o TET entre e além das cordas vocais.
    NOTA: É importante visualizar o TET passando pelas cordas vocais para evitar falsa intubação no esôfago. Deve-se tomar cuidado para evitar lesões nas pregas vocais durante a intubação (ou seja, o número de tentativas de intubação deve ser limitado a 5 e o TET não deve ser avançado se a resistência for encontrada).
  8. Assim que o TET estiver inserido, remova o introdutor e conecte o TET a um ventilador para pequenos animais. Observe a elevação simétrica do tórax para confirmar a intubação endotraqueal correta. As configurações do ventilador devem ser de 100 a 105 respirações por minuto e fração inspirada de oxigênio de 100%. O volume corrente é de 0,35 mL e a pressão expiratória final positiva é de 1 cm H2O.
    NOTA: Certifique-se de que o tórax, e não o abdômen, esteja subindo, pois a intubação esofágica acidental levará à morte se não for corrigida imediatamente.
  9. Uma vez confirmado que está na posição, prenda o ETT com uma tira de 5 cm de fita de seda de 1 polegada ao redor do nariz do mouse, garantindo o contato adequado com o ETT e o nariz para que o ETT não deslize para fora da boca (consulte a Figura 1B-C).
  10. Para manter a anestesia adequada durante toda a cirurgia, administre isoflurano a 1% a 1,5% em linha com o fluxo de oxigênio.

2. Toracotomia

  1. Posicione o mouse em decúbito lateral direito, com ambas as patas dianteiras coladas no canto superior esquerdo, a pata traseira direita colada no canto inferior esquerdo e a pata traseira esquerda colada no canto inferior direito (consulte a Figura 2G para gravação).
  2. Desinfete com a pele sobre o tórax esquerdo com pelo menos 3 rodadas alternadas de iodopovidona seguidas de aplicação de álcool a 70%.
  3. Faça uma incisão no4º espaço intercostal da linha axilar anterior até a linha axilar posterior, usando uma tesoura para abrir a pele sobrejacente (ver Figura 2A). O4º espaço intercostal está localizado aproximadamente 1 cm abaixo da axila na linha axilar média.
  4. Para minimizar a perda de sangue, coagule os vasos sanguíneos visíveis nas camadas subcutânea e muscular usando uma caneta de cautério portátil.
  5. Divida os músculos grande dorsal e serrátil anterior bruscamente usando uma tesoura ao longo do comprimento da incisão na pele (ver Figura 2B).
  6. Usando uma pinça curva fina, eleve cuidadosamente a4ª costela (tomando cuidado para não ferir o pulmão subjacente) e faça um corte pontual com uma tesoura fina logo acima da5ª costela para entrar no4º espaço intercostal (ver Figura 2C). Realize a toracotomia acima da5ª costela em vez de abaixo da4ª costela para evitar lesões no feixe neurovascular intercostal.
  7. Uma vez que a pressão negativa da cavidade pleural é perdida e o pulmão se retrai para longe da parede torácica, estenda a toracotomia anterior e posteriormente no4º espaço intercostal logo acima da5ª costela (ver Figura 2D-E). Todo o comprimento da incisão deve ser longo o suficiente para expor todo o pulmão, geralmente ~ 1 cm.
    NOTA: Pode ocorrer sangramento da artéria mamária interna se a toracotomia for estendida muito anteriormente - se encontrada, deve ser cauterizada para evitar perda excessiva de sangue.
  8. Aplique dois afastadores de costela para abrir o espaço da costela, permitindo uma janela de trabalho de pelo menos 1 cm2 para visualização adequada (ver Figura 2F-G).

3. Aplicação da braçadeira hilar

  1. Usando aplicadores de ponta de algodão de duas pontas, mobilize o pulmão esquerdo elevando-o cefálico e, em seguida, dividindo sem corte o ligamento pulmonar inferior translúcido (ver Figura 3A-B).
    NOTA: Se isso for difícil de realizar sem rasgar o pulmão, o ligamento pulmonar inferior também pode ser dividido bruscamente usando uma tesoura fina.
  2. Reflita o pulmão anteriormente para que o hilo pulmonar esquerdo posterior possa ser visualizado. Corte um pedaço de gravata de seda 6-0 em ~ 10 cm e coloque o ponto médio dessa gravata posteriormente ao hilo (veja a Figura 3C).
  3. Em seguida, vire o pulmão esquerdo posteriormente para colocar sobre a gravata e puxe as duas extremidades da gravata anteriormente (consulte a Figura 3D).
  4. Com as duas extremidades livres (A e B) da gravata, amarre um nó corrediço reversível com uma pinça e uma pinça de mosquito curva. Consulte a descrição detalhada nas etapas 3.4.1 e 3.4.2. O tempo isquêmico quente começa com a amarração do nó corrediço. O pulmão esquerdo não deve mais inflar a cada respiração do ventilador depois que o nó é amarrado. Deve tornar-se branco pálido, implicando cessação da perfusão.
    NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que o nó fique no meio do hilo, evitando prender inadvertidamente o átrio esquerdo centralmente e o parênquima pulmonar lateralmente (ver Figura 3F).
    1. Com o grampo na mão dominante e a pinça na mão não dominante, segure a extremidade de A com uma pinça e enrole o ponto médio de A ao redor do grampo fechado uma vez (veja a Figura 3E).
    2. Segure o ponto médio de B com o clamp e puxe com as duas mãos para apertar o nó corrediço. Não deixe a extremidade de B passar pelo nó, o que tornaria o nó irreversível. Depois de dar o nó, B deve ter um laço emanando do nó, enquanto A deve estar reto (veja a Figura 3F). O nó pode ser liberado puxando a extremidade de B.
  5. Confirme a oclusão adequada do brônquio ocluindo manualmente o tubo de saída do TET para o ventilador, o que deve fazer com que o pulmão esquerdo não infle (ver Figura 3G). A oclusão vascular é assumida com a oclusão brônquica, dada a maior colapsabilidade da artéria e veias pulmonares em comparação com o brônquio cartilaginoso.
  6. Após a aplicação da pinça hilar, feche a incisão na pele com um ponto simples interrompido com fio de náilon 6-0, para minimizar as perdas insensíveis de líquidos durante o período de isquemia quente.

4. Liberação do grampo hilar

  1. Após o período desejado de isquemia quente, solte o nó corrediço puxando suavemente a extremidade livre curta da gravata de seda (B da Figura 3F e passo 3.4). Iniciar o tempo de reperfusão após a liberação do nó corrediço.
    NOTA: Após a liberação do laço, a ventilação pulmonar pode ser confirmada novamente pela oclusão manual do fluxo de saída do TET, o que agora deve causar expansão do pulmão esquerdo. Novamente, a perfusão está implícita na insuflação do pulmão, no entanto, também pode ser confirmada pelo aumento do pulmão (ver Figura 4A).
  2. Durante o período de reperfusão, feche o tórax em três camadas para minimizar as perdas insensíveis. Primeiro, feche o espaço da4ª costela com um único ponto com sutura de náilon 6-0, com uma mordida logo acima da4ª costela e uma mordida logo acima da6ª costela (ver Figura 4B-C). Amarre isso na insuflação pulmonar máxima, para minimizar o risco de um pneumotórax iatrogênico (ver Figura 4D-E).
  3. Em seguida, feche a camada muscular usando um ponto simples com sutura de náilon 6-0.
  4. Por fim, feche a incisão na pele com um ponto simples interrompido com fio de náilon 6-0 (ver Figura 4F). Evite passar pontos na pele devido ao risco de animais acordados cutucarem sua incisão e levarem à deiscência completa da ferida.
  5. A partir deste ponto, o pulmão pode ser colhido diretamente no final do tempo de reperfusão desejado. Se a avaliação da gasometria arterial for desejada, consulte a etapa 5. Se for desejada uma injeção intravenosa adicional antes do sacrifício, consulte o passo 6. Esta é uma cirurgia terminal.
  6. Se o tempo de reperfusão for maior que algumas horas, desligue o isoflurano para permitir que o camundongo acorde da anestesia e extuba. Os critérios de extubação incluem espasmos com pinça da pata e respirações e movimentos espontâneos. Acordar um camundongo da anestesia com cetamina e isoflurano normalmente leva de 30 a 45 minutos. Esta é uma cirurgia de sobrevivência.
    1. Para cirurgia de sobrevivência, injete 1 mL de solução salina morna por via subcutânea para compensar as perdas de fluidos da cirurgia. Injete buprenorfina (dose 0,05 - 0,1 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea antes da cirurgia para controle da dor. Repita a anestesia a cada 4-6 h por pelo menos 3 dias após a cirurgia. Considere um bloqueio de bupivacaína ao longo da incisão para controle adicional da dor.

5. Avaliação ABG

NOTA: Se a medição da gasometria arterial for desejada, ela é melhor obtida por meio de aspiração de sangue arterial do ventrículo esquerdo. Para verificar se a gasometria arterial reflete apenas a função pulmonar esquerda, esse sangue arterial deve ser obtido após cerca de 4 min do pinçamento do hilo direito22,23, período durante o qual apenas o pulmão esquerdo está realizando oxigenação e ventilação.

  1. Se o camundongo foi acordado da anestesia após o clamp hilar, reanestesiar e intubar o camundongo de acordo com a etapa 1.
  2. Cerca de 15-20 minutos antes do final do tempo de reperfusão desejado, posicione o camundongo em decúbito dorsal, prendendo todos os quatro membros com fita adesiva.
    NOTA: Deve-se alocar tempo suficiente para que as etapas a seguir sejam executadas antes do final da reperfusão. O tempo específico para abrir o abdômen e o tórax varia de acordo com o cirurgião e sua experiência.
  3. Realize laparotomia na linha média do osso púbico ao xifóide, incisando com tesoura a pele seguida pela parede abdominal ao longo da linha alba (ver Figura 5A-B).
  4. Na xifóide, estenda a laparotomia para a esquerda e para a direita até a linha axilar anterior, seguindo a curva da costela mais inferior (ver Figura 5C).
  5. A partir do abdômen, incisão do diafragma anterior na linha média para entrar no tórax, tomando cuidado para não ir muito fundo para evitar lesões no coração (ver Figura 5D-E). Em seguida, estenda a incisão anterior do diafragma para a esquerda e para a direita até a linha axilar anterior, ao longo da costela mais inferior (veja a linha pontilhada branca na Figura 5D).
  6. Divida as costelas bilaterais ao longo da linha axilar anterior, estendendo-se para cima em direção à axila, para criar uma toracotomia em concha. Em seguida, reflita a parede torácica anterior (esterno e costelas anteriores bilaterais) cefálica, o que permite a exposição total do coração e dos pulmões bilaterais (ver linhas pontilhadas brancas na Figura 5F).
  7. Aplique uma pinça na parede torácica anterior que é invertida cefálica para facilitar a retração. Retraia o diafragma para baixo com uma pinça de mosquito curva na linha média para melhorar a visualização do tórax (ver Figura 5F).
  8. Para mobilizar totalmente o pulmão direito (que tem 4 lobos), retorne o lobo acessório que se estende além da linha média para o tórax esquerdo de volta ao tórax direito (ver Figura 5G-H). Há um ligamento fino que liga esse lobo ao tórax esquerdo - divida-o sem rodeios com aplicadores com ponta de algodão ou bruscamente com uma tesoura.
    NOTA: Este lobo acessório cruza a linha média posterior à veia cava inferior (VCI), portanto, deve-se tomar cuidado para não ferir a VCI durante esta manobra.
  9. Assim que todos os lobos retornarem ao tórax direito, reflita todo o pulmão direito anteriormente e coloque outra gravata de seda 6-0 (cortada em ~ 10 cm) posterior ao hilo direito. Em seguida, recoloque o pulmão direito de volta no peito sobre a gravata.
  10. Amarre outro nó corrediço ao redor do hilo direito usando a mesma técnica descrita na etapa 3.4, tomando cuidado para circundar todos os quatro lobos do pulmão direito. Esta etapa de pinça hilar direita deve ser cronometrada para aproximadamente 4 minutos antes do final da reperfusão.
  11. Cubra uma agulha 31G de 1/2 polegada em uma seringa de tuberculina de 1 cc com cerca de 200 μL de heparina 1000 unidade/mL. Para fazer isso, retire o volume de heparina e puxe repetidamente o êmbolo para frente e para trás 3-4 vezes para permitir que a heparina cubra todo o interior da seringa. Isso é feito para minimizar o risco de coagulação do sangue aspirado durante o transporte da estação cirúrgica para a máquina de gasometria arterial.
  12. Após 4 min de pinçamento hilar direito, aspire sangue arterial do ventrículo esquerdo para a seringa revestida com heparina (ver Figura 5I). Tome cuidado para evitar perfurar o septo ventricular e aspirar inadvertidamente sangue venoso do ventrículo direito. Há uma clara diferença de cor entre o ventrículo direito mais escuro e o ventrículo esquerdo mais brilhante (ver inserção da Figura 5I). Incline a agulha em direção ao pescoço esquerdo. Várias punções podem ser necessárias para obter sangue suficiente para executar uma gasometria arterial (~ 150 μL).
    NOTA: Durante os 4 minutos de pinça hilar direita, o mouse pode começar a exibir respiração agonal que anuncia a morte iminente. Se isso ocorrer, o sangue arterial deve ser aspirado rapidamente antes da parada cardíaca. Não é possível aspirar sangue de um coração sem batimentos.
  13. Execute o sangue arterial em uma máquina de gasometria arterial para obter saturação de oxigênio, pressão parcial de oxigênio, pressão parcial de dióxido de carbono, entre outras medições. Eutanásia do camundongo após a coleta de gasometria arterial e/ou tratamento com anticorpos (consulte a etapa 6).

6. Injeção intravenosa de anticorpos para medição do extravasamento celular

NOTA: Esta técnica pode ser usada para determinar o extravasamento celular por meio da injeção de anticorpos marcados com fluorocromo por via intravenosa na VCI antes do sacrifício, seguida de análise por citometria de fluxo, conforme publicado anteriormente18. Em resumo, os neutrófilos intravasculares podem ser distinguidos dos neutrófilos intersticiais usando anticorpos anti-Ly6G específicos para neutrófilos. O anti-Ly6G marcado com isotiocianato de fluoresceína (marcado com FITC) (clone 1A8) é injetado por via intravenosa 5 minutos antes do sacrifício, que marca os neutrófilos intravasculares circulantes. A concentração do anticorpo FITC-Ly6G utilizada é de 100 ng diluída em 200 μL de solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, após a preparação da suspensão de célula única do pulmão esquerdo para citometria de fluxo, todos os neutrófilos são marcados com anti-Ly6G marcado com aloficocianina (marcado com APC) (clone 1A8). Assim, os neutrófilos APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ são intravasculares, enquanto os APC-Ly6G+FITC-Ly6G- são extravasculares ou intersticiais. Essa técnica pode ser adaptada para monócitos com anticorpos anti-Ly6C, células B com anticorpos anti-CD19, por exemplo.

  1. Carregue o anticorpo desejado em uma seringa de 3/10 cc com agulha 31G de 5/16 de polegada, tomando cuidado para minimizar as bolhas de ar dentro da seringa. Use-o para injeção intravenosa na VCI na etapa 6.5.
  2. Realize a laparotomia de acordo com as etapas 5.3-5.4.
  3. Após a laparotomia, execute a rotação visceral medial direita sem rodeios usando dois aplicadores pontiagudos com ponta de algodão. Em um camundongo, isso é feito eviscerando todo o intestino à esquerda do abdômen, o que permitirá uma visão clara da VCI (ver Figura 6A).
  4. Limpe a gordura que cobre o IVC sem rodeios com aplicadores com ponta de algodão.
  5. Injete a solução de anticorpos na VCI por punção venosa (ver Figura 6B). Após a extração da agulha, aplique imediatamente uma leve pressão com um cotonete no local da punção venosa até que esteja hemostático (geralmente cerca de 2-3 min).
  6. Retorne o intestino eviscerado para o abdômen sobre o cotonete para continuar a aplicar pressão sobre o VCI (ver Figura 6C).
  7. Realize a toracotomia em concha de acordo com as etapas 5.5-5.7 para colher o pulmão esquerdo. Permita que os anticorpos tenham pelo menos 5 minutos para circular sistemicamente antes do sacrifício e da colheita. Eutanasiar o camundongo após coleta de gasometria arterial e/ou tratamento com anticorpos.

7. Coloração histológica (H&E)

  1. Após a fixação em formalina e inclusão em parafina do pulmão esquerdo e seccionamento para uma espessura de 5 μm, desparafinizar a lâmina em xileno (duas lavagens de 10 minutos).
  2. Desidratar em lavagens sequenciais com etanol: 2 lavagens de 5 min com 100%, 1 lavagem de 2 min com 95% e 1 lavagem de 2 min com etanol a 70%. Em seguida, enxágue em água deionizada.
  3. Pinte a lâmina com hematoxilina por 2-4 min e depois lave com água deionizada por 5 min ou até que esteja limpa. A duração precisa da coloração da hematoxilina precisará ser otimizada para o tecido e a intensidade da coloração nuclear desejada.
  4. Lave em solução definidora por 30 s para diferenciar manchas e, em seguida, lave em água por 2 min. Lave em solução formadora de cor azul por 30 s e depois lave em água por 2 min.
  5. Desidrate ainda mais mergulhando em etanol 95% 15x. Manchar em eosina por 1 min.
  6. Desidratar com 2 min de lavagens com etanol (2x), seguidas de 2 min de lavagens com xileno (2x). Aplique a mídia de montagem e a lamínula.

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Resultados

Após o pinçamento hilar esquerdo, a pressão parcial de oxigenação no sangue arterial (PaO2) atribuída ao pulmão esquerdo é de ~100 mmHg, significativamente menor em comparação com os ~500 mmHg após toracotomia simulada (Figura 7A, n=6-7). É importante notar que toracotomias simuladas foram realizadas em camundongos B6 com medição de gasometria arterial feita após 4 min de pinçamento hilar direito, representando valores atribuídos apenas ao pulmão esquerdo. A coloração de H & E...

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Discussão

Descrevemos uma técnica de pinça hilar que envolve a aplicação de um nó corrediço no hilo esquerdo que oclui a artéria pulmonar e veias e brônquios para induzir isquemia quente seguida de reperfusão. Após o pinçamento hilar, o pulmão esquerdo pode ser colhido para uma variedade de técnicas experimentais, como histologia, citometria de fluxo, sequenciamento em massa ou de célula única e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Além disso, o sangue e o baço podem ser usados para estudar os efeitos sistêmicos, enquanto ...

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Divulgações

Os autores não relatam divulgações relevantes.

Agradecimentos

Este trabalho não recebeu nenhuma doação específica de qualquer agência de financiamento nos setores público, comercial ou sem fins lucrativos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Medicamentossolução de
iodopovidona a 10%AplicareNDC 52380-0126-2Para desinfetante
Buprenorfina 1,3 mg/mLFidelis Saúde AnimalNDC 86084-100-30Para controle da dor
CarprofenoCronus PharmaNDC 69043-027-18Para controle da dor
Heparina 1000 unidades/mLSagentNDC 25021-404-01Para obter sangue arterial
Isoflurano 1%-1,5%Sigma Aldrich26675-46-7Para anestesia
Cloridrato de cetamina 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Para anestesia
Pomada para os olhos Puralube VetMedi-Vet.com11897Para prevenir a dessecação ocular
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Para controle da dor
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231Para coagular vasos sanguíneos
Curved mosquito clampFine ScienceTools 13009-12Para procedimento cirúrgico
Pinça curva finaFine Science Tools11274-20Para cirúrgico procedimento
Tesoura finaFine Science Tools15040-11Para procedimento cirúrgico
Configuração de braçadeira de intubaçãoFine Science Tools18374-44, 18144-30Para segurar o mouse verticalmente pela língua durante a intubação. Veja a Figura Suplementar 1A. 
Retractores magnéticos de costelasFine Science Tools18200-01, 18200-10Para retração de toracotomia. O fixador magnético e o afastador devem ser conectados por um tubo de micro látex abaixo.
Fibra Óptica de Plástico de Grau Óptico Não Revestida, 500μ mEdmund Optics02-532Para fazer o introdutor para o tubo endotraqueal. Veja a Figura Suplementar 1B. Um comprimento de 1,5 polegada desta fibra óptica deve ter um pedaço de fita de seda preso a uma extremidade. Pode então ser usado como um introdutor para o tubo endotraqueal. A extremidade do introdutor deve ser ligeiramente curvada.
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001Para cortar o cabelo
TesouraFine Science Tools14370-22Para procedimento cirúrgico
Almofada de aquecimento para pequenos animaisK & H Pet ProductsThermo-Peep Almofada AquecidaPara manter a normotermia
Ventilador para pequenos animaisHarvard Apparatus55-0000Para ventilação (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Tubo de Borracha de Látex (1/8 pol de diâmetro externo, 1/16 pol de diâmetro interno)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Para retração de toracotomia
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas AnalyzerNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		Para retração da toracotomia
Grampo retoFine Science Tools13008-12Para procedimento cirúrgico
Pinça retaFine Science Tools91113-10Para procedimento cirúrgico
Microscópio cirúrgicoWild Heerbruggnão é mais produzidoPara intubação e procedimento cirúrgico; recomenda-se a substituição por microscópios cirúrgicos Leica
Supplies
½ cc com ½ polegada 29GMcKesson942665Para injetar cetamina/xilazina intraperitonealmente
½ polegada 31G agulha em uma seringa de tuberculina de 1 ccMcKesson16-SNT1C2705Para aspiração de sangue arterial do ventrículo esquerdo
1 polegada 20G IV cateterTerumoSROX2025CAPara tubo endotraqueal (ETT)
1 polegada seda fitaDurapore3M ID 7100057168Para prender o ETT no nariz e prender os membros
Seringa de 3/10 cc com agulha 31G de 5/16 polegadasMcKesson102-SN310C31516PPara injeção de anticorpos na veia cava inferior
6-0 sutura monofilamentar em uma agulha P-10McKessonS697GXPara fechamento de toracotomia, camada muscular e
pele 6-0 gravata de sedaSurgical SpecialtiesLook SP102Para fazer nó corrediço para grampo hilar
Aplicadores pontiagudos com ponta de algodãoSolon56225Para manipular o pulmão e para dissecção romba
agulha

Referências

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

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