Method Article

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

DOI:

10.3791/66236

⸱

February 16th, 2024

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O transporte axonal é um pré-requisito para fornecer proteínas axonais de seu local de síntese no corpo celular neuronal até seu destino no axônio. Consequentemente, a perda do transporte axonal prejudica o crescimento e a função neuronal. Estudar o transporte axonal, portanto, melhora nossa compreensão da biologia celular neuronal. Com as recentes melhorias na edição do genoma CRISPR Cas9, a marcação endógena de cargas axonais tornou-se acessível, permitindo ir além da visualização do transporte baseada em expressão ectópica. No entanto, a marcação endógena geralmente tem o custo de baixa intensidade de sinal e requer estratégias de otimização para obter dados robustos. Aqui, descrevemos um protocolo para otimizar a visualização do transporte axonal, discutindo parâmetros de aquisição e uma abordagem de branqueamento para melhorar o sinal de carga marcada endógena sobre fundo citoplasmático difuso. Aplicamos nosso protocolo para otimizar a visualização de precursores de vesículas sinápticas (SVPs) marcados por RAB-3 marcado com proteína fluorescente verde (GFP) para destacar como o ajuste fino dos parâmetros de aquisição pode melhorar a análise da carga axonal marcada endogenamente em Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao longo da vida, os neurônios dependem do transporte axonal para entregar proteínas, lipídios e outras moléculas do corpo celular ao seu destino final no axônio. Consequentemente, o comprometimento do transporte axonal está associado a uma perda da função neuronal e está frequentemente envolvido na patologia de distúrbios neurodegenerativos 1,2. Portanto, entender os mecanismos subjacentes ao transporte axonal é de grande interesse.

Várias décadas de pesquisa sobre o transporte axonal revelaram muitos insights importantes sobre a maquinaria molecular que medeia esse transporte, sua composição e mecanismos regulatórios. O transporte axonal de longo alcance ocorre no citoesqueleto dos microtúbulos, que consiste em polímeros de microtúbulos parcialmente sobrepostos que são tipicamente orientados com sua extremidade positiva nos axônios3. Consequentemente, o transporte anterógrado é mediado por proteínas motoras que caminham até a extremidade positiva dos microtúbulos, as cinesinas, enquanto o transporte retrógrado depende do motor de dineína direcionado para a extremidade negativa. Embora muitos aspectos do transporte tenham sido revelados, para muitas proteínas axonais ainda não está claro como elas são carregadas no maquinário de transporte, como os pacotes de transporte individuais são organizados e como esse transporte é regulado3.

O transporte axonal foi inicialmente estudado em experimentos de radiomarcação, nos quais aminoácidos radiomarcados foram injetados no compartimento somático, onde foram incorporados em proteínas endógenas nascentes e puderam ser rastreados ao longo do tempo no compartimento axonal por autorradiografia4. Embora os experimentos de radiomarcação tenham permitido o estudo do transporte axonal de proteínas endógenas in vivo, eles não permitem o acompanhamento direto do comportamento da carga individual para obter insights mecanicistas4. Essa limitação foi superada com o uso da microscopia de fluorescência. No entanto, o transporte axonal geralmente não é visualizado em proteínas endógenas, mas sim pela expressão de uma cópia marcada com fluorescência. Especialmente para proteínas de baixa expressão, a superexpressão fornece intensidades de sinal mais altas que tornam possível a visualização, de preferência com resolução de um único neurônio. Além disso, a expressão ectópica da proteína marcada com fluorescência contorna a necessidade e os desafios da edição do genoma. Por outro lado, tem sido argumentado que o comportamento da carga expressa ectopicamente pode diferir do comportamento da carga endógena5.

Melhorias recentes na edição do genoma tornaram as estratégias de marcação endógena mais acessíveis. Assim, uma menor intensidade de sinal tornou-se a principal limitação para estudar o transporte axonal de uma carga por expressão ectópica em vez de marcação endógena. Considerações cuidadosas na estratégia de marcação endógena combinadas com uma otimização das condições de aquisição podem superar esse desafio.

Os nematóides fornecem um excelente modelo de pesquisa para estudar o transporte axonal in vivo devido à sua transparência e facilidade nas manipulações genéticas. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de pesquisa para visualizar o transporte axonal de proteínas endógenas com resolução de neurônio único em Caenorhabditis elegans vivos. Visualizamos o transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas usando uma cepa gerada pelo Jorgensen Lab6, na qual a RAB GTPase associada à vesícula, RAB3, é marcada endogenamente com GFP, no neurônio motor DA9. Ao perguntar como pequenas adaptações em diferentes parâmetros de aquisição e fotobranqueamento podem melhorar a visualização de eventos de transporte individuais, o protocolo fornece ideias sobre como otimizar as condições de imagem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para um protocolo detalhado sobre como manter e preparar nematóides para imagens de células vivas, consulte o trabalho de S.Niwa 7.

1. Geração de cepas de vermes

Além de gerar cepas de nematóides, o Caenorhabditis Genetics Center (CGC)8 contém uma coleção crescente de cepas de nematóides com proteínas marcadas com fluorescência endogena que podem ser obtidas diretamente de sua página da web.

  1. Escolha da estratégia de rotulagem de fluorescência
    1. Use a cepa nematóide MTS1161, que contém o alelo6 rab-3 (ox699), para visualizar a GFP endógena marcada com RAB-3 no neurônio motor DA9 (a cepa será depositada no CGC). Para visualizar outras proteínas axonais, gere uma cepa de nematóide com uma proteína marcada endógena usando o protocolo de edição CRISPR Cas9 do Mello Lab9.
      NOTA: MTS1161 utiliza uma abordagem de recombinação para a célula rotular especificamente o RAB-3 endogenamente com uma tag GFP6. Uma abordagem alternativa comum é baseada na reconstituição de uma proteína fluorescente dividida, que é recomendada para proteínas especialmente de baixa expressão, pois aumenta o número de cópias fluorescentes por proteína endógena usando múltiplas cópias fluorescentes divididas10. O número de cópias pode ser inicialmente estimado com base em conjuntos de dados de transcriptoma da página da CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) 11.
  2. Escolha do neurônio para visualizar o transporte axonal
    1. No MTS1161 de tensão, visualize RAB-3 no neurônio motor DA9 (ver Figura 1). Para outras cargas axonais, especialmente proteínas de baixa expressão, identifique um neurônio no qual os níveis de expressão da proteína analisada são mais altos usando a página da CenGen.
      NOTA: O projeto CenGen (cengen.org) fornece um ótimo recurso on-line para estimar os níveis de expressão de uma proteína de interesse em muitos neurônios do nematóide com base em um grande conjunto de dados transcriptômicos cobrindo todos os 302 neurônios do sistema nervoso de C. elegans 12,13.

2. Manuseio de vermes e preparação para imagens

  1. Mantenha os nematóides em um gramado de bactérias (cepa: OP50) semeadas em placas de meio de crescimento de nematóides a 20 ° C e cultivadas até a idade adulta de 1 dia para obter imagens.
    NOTA: Medir o transporte axonal em um estágio de idade definido é importante, pois as taxas de transporte diminuem com o envelhecimento de forma consistente em diferentes cargas axonais, classes de neurônios e organismos 14,15,16,17,18-Nematóides no estágio larval L4 ou 1 dia na idade adulta têm sido usados na maioria dos artigos e, portanto, oferecem os maiores conjuntos de dados para comparações.
  2. Prepare nematóides para imagens de células vivas: Execute todas as etapas subsequentes com um microscópio estéreo para visualizar e manusear os vermes.
    1. Transfira os nematóides para uma gota de 0,5 mM de Levamisol usando um palito de fio de platina e incube os nematóides por 20 min na gota.
    2. Monte cuidadosamente 10-20 nematóides da gota de Levamisol em uma gota de 12 μL de meio M9 em um adesivo de agarose a 10% (dissolvido em meio M9) em uma lâmina de vidro usando um palito de cabelo. Para um procedimento detalhado sobre como fazer um adesivo de agarose a 10%, consulte o protocolo de S.Niwa7.
      NOTA: A montagem de um número baixo de nematóides é suficiente, pois apenas alguns animais serão fotografados por lâmina antes que os animais comecem a sofrer de hipóxia.
    3. Coloque uma lamínula em cima da gota (22 mm x 22 mm ou 18 mm x 18 mm). Para o transporte de imagens no axônio DA9, posicione o axônio próximo à lamínula. Para isso, gire a lamínula em 45° depois de colocá-la em cima do remendo de ágar, para rolar os animais de costas.
    4. Sele o espaço entre a lamínula e a lâmina de vidro com um gel viscoso como petrolato. Isso evitará que a mancha de agarose seque, o que pode fazer com que os nematóides saiam do campo de imagem.
      NOTA: É crucial tratar os animais com a maior delicadeza possível. Concentrações muito altas de levamisol ou danos físicos ao verme podem prejudicar o transporte axonal. Contrações leves da cauda durante a sessão de imagem são um bom sinal de que o animal permanece em um estado saudável. Os animais permanecem saudáveis e podem até se recuperar da mancha de agarose após a sessão de imagem.

3. Microscopia de células vivas

NOTA: Os valores exatos dos parâmetros de aquisição podem diferir entre os microscópios. No entanto, as tendências para cada parâmetro de aquisição devem ser independentes do microscópio utilizado. Um microscópio confocal de disco giratório equipado com uma linha de laser separada para branqueamento foi usado neste protocolo (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o microscópio). A fluorescência verde foi excitada por um laser de 488 nm e a emissão foi filtrada por um filtro de emissão ET525/36. O clareamento foi realizado com uma linha de laser de 488 nm.

  1. Certifique-se de que a temperatura da sala, ou se um stage com temperatura controlada estiver disponível, esteja ajustado para uma temperatura constante. Para os nemátodos, regular a temperatura para 20 °C.
  2. Monte a lâmina e use a lente objetiva com ampliação de 4x-20x para localizar os nematóides na lâmina e memorizar as posições. Mude para lente de ampliação de 63x para aquisição de imagem.
  3. Tire uma única imagem para verificar os parâmetros de aquisição inicial. Acompanhe as intensidades do sinal no campo de visão com o histograma de intensidade do software de aquisição. Os valores de intensidade devem cobrir o terço mais baixo do sinal máximo que a câmera pode detectar. Evite a saturação de pixels. Aumente a intensidade do laser de excitação se a intensidade do sinal for muito baixa.
    NOTA: Não use intensidades de laser de excitação muito altas, pois ele branqueia a proteína fluorescente durante o lapso de tempo.
  4. Altere o parâmetro de aquisição e as etapas aqui para otimizar a detecção do sinal de fluorescência.
    1. Implementação de uma etapa de branqueamento: Branquear a região do axônio que será analisada usando uma linha de laser de 488 nm (potência: 15 mW) para a etapa de clareamento. Procure uma eficiência de branqueamento de pelo menos 90%. Determine a eficiência do branqueamento comparando a intensidade do sinal da região antes e depois da etapa de branqueamento.
      NOTA: O branqueamento aumenta o sinal de partículas em movimento, diminuindo o sinal que deriva de partículas estacionárias, bem como do sinal que deriva da fração citoplasmática da proteína em segundo plano. A carga membranosa, como o RAB-3 em precursores de vesículas sinápticas, tem uma fração citoplasmática baixa, de modo que a etapa de branqueamento melhora apenas levemente o sinal do pacote de transporte sobre o fundo citoplasmático ( Figura 2A , D ). No entanto, o branqueamento melhora o rastreamento de eventos de transporte individuais em distâncias maiores e permite quantificar os tempos de pausa (Figura 2A).
    2. Compartimentalização: Use a compartimentalização 2 x 2 para aumentar a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais. O compartimentalização combina matrizes de pixels em um pixel maior. Isso reduzirá a resolução espacial, mas aumentará a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais e é especialmente útil para partículas fracas (Figura 2B, D).
    3. Tempo de exposição: Aumente o tempo de exposição para aumentar a intensidade do sinal. Aumentar o tempo de exposição aumenta a intensidade do sinal da amostra ao custo de obter uma resolução temporal mais baixa para os eventos de transporte. Para o experimento aqui, use uma resolução temporal de 300 ms a 700 ms entre pontos de tempo consecutivos (tempo de exposição de 100-500 ms) para seguir eventos de transporte individuais de RAB-3. (Figura 2C, D)
  5. Gravação de lapso de tempo: Faça um lapso de tempo de pelo menos 1-3 minutos, dependendo da intensidade do sinal da proteína, bem como da frequência de eventos de transporte individuais. Uma vez que um lapso de tempo tenha sido registrado, passe para o próximo animal. Os animais em uma lâmina não devem ser fotografados por mais de 30 minutos para garantir que os animais registrados estejam em um estado saudável.
    NOTA: Contrações leves da cauda dos animais durante a gravação são um indicador de que o animal ainda está vivo.

4. Análise de dados de transporte axonal

NOTA: Use ImageJ/Fiji19 para as etapas subsequentes de análise de imagem. Fiji é capaz de ler dados por todos os pacotes de software de microscopia comuns.

  1. Geração de Kymograph
    1. Importar dados: Importe o arquivo de dados de lapso de tempo para Fiji. Caso não seja possível importar os dados para Fiji, exporte a gravação de tempo como um arquivo tiff do pacote de software e carregue-o posteriormente em Fiji.
    2. Correção de desvio: Verifique se o segmento animal/axônio se moveu ou se desviou ligeiramente durante a aquisição da imagem. Corrija o movimento ou deriva do animal executando o plugin StackReg20. Ao executar o plug-in, escolha a transformação Corpo rígido .
    3. Geração manual de um quimógrafo: Um procedimento passo a passo detalhado é fornecido na Figura 3. Utilize o filme corrigido por desvio para gerar o quimógrafo. Use a ferramenta Linha segmentada e ajuste a largura da linha para corresponder ao diâmetro do axônio clicando duas vezes com o botão esquerdo do mouse no ícone da linha segmentada para desenhar uma linha ao longo do segmento do axônio que será analisado. Execute o plug-in ImageJ/Fiji Kymoreslicewide para gerar o quimógrafo e utilizar o valor de intensidade máxima em toda a largura da linha em suas configurações de parâmetro.
      NOTA: Manter a consistência na direção do desenho da linha (por exemplo, sempre proximal ao axônio distal ou reverso) simplifica o rastreamento da direção do movimento de volta nos quimógrafos.
  2. Análise do parâmetro de transporte
    1. Calcule o parâmetro de transporte: número do evento, velocidade, duração da corrida e duração da pausa do quimógrafo seguindo as etapas subsequentes.
      1. Rastrear eventos de transporte no quimógrafo: Use a ferramenta Linha reta para rastrear eventos de transporte individuais no quimógrafo. Salve cada linha no gerenciador de ROI e rastreie todos os eventos de transporte no kymograph. Escolha os seguintes parâmetros de medição no ImageJ/Fiji: Área, Retângulo delimitador, Valor médio de cinza, Diâmetro de Feret.
      2. Calcular parâmetro de transporte: cole a tabela de resultados em uma planilha e use as seguintes colunas das seções de resultados para calcular:
        Comprimento da corrida: Multiplique a largura (em pixels) pela resolução da câmera (por exemplo, x μm/pxl) para determinar o comprimento da corrida em μm.
        Velocidade: Duração da corrida/duração da execução. Para determinar a duração de um evento de movimento em segundos, multiplique a altura (em pixels) pelo tempo de aquisição entre pontos de tempo consecutivos (por exemplo, x s/pixel).
        Tempo de pausa: Duração da execução entre dois movimentos consecutivos em que a velocidade é 0.
        Número do evento: O total de eventos pode ser normalizado para o comprimento total do quimógrafo para determinar o número de eventos por minuto e o segmento de comprimento do axônio. Os eventos podem ainda ser categorizados em eventos de transporte anterógrados e retrógrados. Para determinar a direcionalidade de cada evento de movimento, utilize a ferramenta Ângulo de Feret. Nos quimógrafos que foram inicialmente gerados desenhando a linha segmentada de proximal para distal e os eventos de transporte anterógrado no quimógrafo estão apontando da direita para a esquerda, um ângulo de Feret < 90° indicará um evento anterógrado e >90° um evento retrógrado, caso contrário, será o inverso.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visão geral do sistema de modelo e procedimento de medição
Para visualizar o transporte axonal de precursores de vesículas sinápticas, rastreamos endogenamente GFP marcado com RAB-3. Aqui fazemos uso de uma cepa6 GFP::Flip-on::RAB-3 recentemente gerada, na qual a expressão da Flippase recombinase sob um promotor específico de célula (glr-4p) rotula RAB-3 endógena no neurônio motor DA9. DA9 é um neurônio motor bipolar, com seu corpo celular localizado na parte posterior do animal no lado ventral, próximo ao ânus (Figura 1A). Ele contém um dendrito curto que corre anteriormente ao longo do cordão nervoso ventral e um axônio longo que corre posterior, forma uma comissura e depois corre anterior ao longo do cordão nervoso dorsal, onde forma sinapses en passant que inervam o músculo dorsal e o neurônio VD22 , 23 , 24 . Visualizamos o transporte axonal na região assináptica; a maioria dos eventos de transporte pode ser capturada com um único plano focal (Figura 1A). Uma etapa inicial de fotobranqueamento é implementada para reduzir o fundo de vesículas estacionárias nessa área, que muitas vezes tendem a fazer uma pausa nessa região (Figura 1B). Vídeos de lapso de tempo são gravados em 3 minutos e o sinal RAB-3 ao longo da região assináptica é plotado em um quimógrafo para extrair eventos de transporte individuais (Figura 1C).

Ajustando o parâmetro de aquisição para otimizar a visualização do transporte axonal
Para superar a baixa intensidade de sinal de muitas proteínas marcadas com fluorescência endogena, os parâmetros de aquisição do microscópio precisam ser otimizados. Para uma quantificação robusta dos eventos de transporte, a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais precisa ser o mais brilhante possível sobre o fundo citoplasmático ou a carga estacionária em pausa. Os precursores de vesículas sinápticas freqüentemente param na região assináptica em pools de vesículas distintos, o que interfere na detecção de novas vesículas recebidas e dificulta o acompanhamento de seus traços de transporte7.

Uma única etapa inicial de branqueamento de fluorescência pode reduzir fortemente o sinal de fluorescência derivado dos pools de vesículas para melhorar a detecção de movimento de novas vesículas recebidas (Figura 2A). A etapa de clareamento aumentou apenas levemente o sinal de movimento das vesículas RAB-3 sobre a intensidade de fundo citoplasmático, provavelmente porque a fração citoplasmática do RAB-3 é muito baixa (Figura 2D).

O uso de binning fornece uma camada adicional para melhorar o sinal em segundo plano de eventos de transporte individuais, combinando uma matriz de pixels em um único pixel. Um binning 2 x 2 reduzirá pela metade a resolução espacial (aqui de 108,33 nm / pixel para 216,7 nm / pixel), o que ainda é suficiente para rastrear partículas de transporte RAB-3 individuais (Figura 2B), mas melhora fortemente a intensidade do sinal de vesículas individuais (Figura 2D). A menos que seja necessária uma resolução espacial muito alta, o binning também pode ser aplicado para visualizar muitas outras cargas axonais.

Em seguida, perguntamos como as mudanças no tempo de exposição podem melhorar a intensidade do sinal de eventos de transporte único. Incluímos especialmente o tempo de exposição na análise para demonstrar também que o tempo de exposição de até 500 ms com 700 ms entre os pontos de tempo de imagem subsequentes ainda fornece uma resolução temporal na qual os precursores de vesículas sinápticas podem ser rastreados (Figura 2C, D).

Gerando e analisando quimógrafos com Fiji
Para gerar um quimógrafo e analisar eventos de transporte individuais, siga as etapas da Figura 3.

figure-results-1
Figura 1: Visão geral do sistema modelo para visualizar o transporte axonal do RAB-3 fluorescente endógeno. (A) Painel superior: Visão geral do nematóide com o eixo póstero-anterior e ventral-dorsal indicado. O neurônio motor DA9 é rotulado em azul. Painel médio: Aumente o zoom da região encaixotada mostrada no painel superior com a compartimentalização DA9 indicada. As sinapses en passant são ilustradas em verde, * indica o ânus. Observe que o axônio continua no cordão nervoso dorsal até passar pela vulva. A caixa vermelha indica a região da zona assináptica. Painel inferior: Imagem de microscopia confocal de GFP endógena marcada com RAB-3 no axônio proximal em um único plano focal. Observe que existem sumidouros de vesículas de pausa mais longa do RAB-3 na região assináptica, embora a maioria dos sinais do RAB-3 se agrupe na região sináptica. A região assináptica está encaixotada em vermelho. Escala: 20 μm. (B) Imagens representativas de uma gravação de lapso de tempo para visualizar o transporte axonal. Para melhorar a rastreabilidade de partículas de transporte individuais sobre partículas estacionárias, a região assináptica é inicialmente fotobranqueada. Os painéis inferiores na região da caixa roxa mostram um exemplo de um evento de movimento anterógrado (ponta de seta laranja) e retrógrado (ponta de seta azul). Os painéis de cima para baixo representam pontos de tempo consecutivos. (C) A gravação de lapso de tempo em (B) foi plotada como um quimógrafo (representação 2D do tempo sobre a posição). As linhas diagonais representam eventos de movimento nos quais a inclinação indica a velocidade. As linhas verticais mostram eventos estacionários. A caixa roxa é um zoom do quimógrafo para destacar os eventos de transporte que também são mostrados em (B) e os eventos de transporte anterógrados (laranja) e retrógrados (azul) são rastreados. Linhas verticais tracejadas indicam os eventos de pausa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Otimizando etapas e parâmetros de aquisição para melhorar a visualização da carga axonal endógena. GFP::RAB-3 endógeno foi visualizado na zona assináptica do axônio DA9 tirando imagens de um único plano focal em um microscópio confocal de disco giratório. Os quimógrafos foram adquiridos para visualizar eventos de transporte individuais na direção anterógrada (direita para esquerda) e retrógrada (esquerda para direita) (AC). (A) Os quimógrafos mostram eventos de transporte RAB3 sem (quimógrafos esquerdos) ou com uma etapa de branqueamento integrada. Observe que a etapa de branqueamento melhora a visualização de eventos de pausa (indicados por pontas de seta amarelas) entre eventos de transporte consecutivos (pontas de seta laranja). (B) A implementação do binning 2 x 2 ajuda a melhorar a intensidade do sinal de eventos de transporte RAB3 fracos. As imagens foram adquiridas no tempo de exposição de 300 ms e com (C) aumento incremental do tempo de exposição (de 100 ms na extrema esquerda para 500 ms na extrema direita) ajuda a melhorar a intensidade do sinal de eventos de transporte individuais. As imagens foram adquiridas em binning 2 x 2 e usando uma etapa inicial de fotobranqueamento. Todos os quimógrafos exibem uma duração total de 3 min e são desenhados na mesma escala para que os quimógrafos com menos pontos de tempo de aquisição devido a um lapso de tempo mais longo entre pontos de imagem consecutivos tenham um comprimento total menor do quimógrafo. (D) Quantificação da intensidade do sinal por evento de transporte após subtração da fluorescência de fundo dos quimógrafos em (A-C). Observe que o binning e a etapa de branqueamento fotográfico foram adquiridos no tempo de exposição de 300 ms. Comparação estatística utilizando n eventos para 100 ms (neventos= 27 em nanimais= 2), 200 ms (neventos= 30 em nanimais= 2), 300 ms (neventos= 88 em nanimais= 6), 500 ms (neventos= 12 em nanimais= 1), 300 ms sem binning (n)eventos= 31 em nanimais= 3), 300 ms com binning (w) binning (neventos= 88 em nanimais= 6) e 300 ms, binning 2 x 2 com branqueamento (neventos= 88 em nanimais= 6) e sem branqueamento. Cada ponto de dados representa a intensidade do sinal de um evento de transporte RAB-3 individual após a subtração do fundo (citoplasma do axônio) em um único ponto de tempo ao longo de seu traço que foi escolhido aleatoriamente. O tempo de exposição foi comparado usando um teste de Kruskal-Wallis seguido de comparação múltipla de Dunn, binning e fotobranqueamento foram comparados usando um teste de Mann-Whitney pareado. As barras de erro indicam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Procedimento passo a passo para gerar um quimógrafo e medir eventos de transporte individuais. (A) Depois de carregar a gravação de vídeo em Fiji, a ferramenta de linha segmentada é usada para traçar uma linha ao longo do comprimento do segmento axonal que será analisado. (B) Um quimógrafo (painel direito) é gerado usando o plug-in Kymoreslicewide com os parâmetros representados no painel esquerdo. (C) Os eventos de transporte individuais são rastreados com a ferramenta de linha linear e armazenados no gerenciador de ROI. O painel direito mostra as configurações de medição usadas para gerar a tabela de resultados. (D) Os resultados da tabela são usados para calcular o parâmetro de transporte. As caixas indicam parâmetros importantes que são descritos na seção de métodos do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limitações do método e métodos alternativos
Neste protocolo, otimizamos os parâmetros de aquisição para visualizar o transporte axonal do RAB-3 marcado endogenamente, que está associado a precursores de vesículas sinápticas. Para visualizar o RAB-3, usamos uma cepa6 FLIP-on::GFP::RAB-3 publicada recentemente e expressamos a Flippase recombinase sob um promotor específico de célula (glr-4p)25. Essa estratégia nos permite rotular o RAB-3 com um único fluoróforo GFP. O RAB-3 é relativamente fácil de visualizar porque é altamente expresso e fortemente enriquecido em precursores de vesículas sinápticas, de modo que os eventos de transporte individuais têm uma intensidade de sinal brilhante sobre um sinal baixo que deriva do fundo citoplasmático. Outras proteínas axonais podem exigir estratégias de otimização adicionais fora das configurações de microscopia para permitir a visualização de eventos de transporte. Especialmente para proteínas de baixa expressão, o sistema split-GFP oferece uma ótima alternativa. Nesse sistema, a GFP11 é inserida no locus endógeno da proteína de interesse e a GFP1-10 é expressa a partir de um promotor específico da célula. Uma grande vantagem desse sistema é o pequeno tamanho do molde de reparo de DNA (aproximadamente 70 nucleotídeos) que precisa ser inserido genomicamente, o que torna a recombinação homóloga mais eficiente em comparação com a inserção da ORF de toda a etiqueta fluorescente26,27. Devido ao seu pequeno tamanho, vários fragmentos de GFP11 podem ser inseridos na proteína endógena, o que amplifica o número de fluoróforos GFP reconstituídos por proteína e, assim, aumenta o sinal fluorescente da proteína endógena e, portanto, do pacote de transporte28.

Além de rotular a proteína com uma abordagem de GFP ou GFP dividida, outros fluoróforos geneticamente codificados podem ser utilizados com vantagens e desvantagens únicas em relação às suas propriedades fotoquímicas, que foram recentemente comparadas29. Além disso, fluoróforos químicos com propriedades mais fotoestáveis podem ser usados marcando endogenamente a proteína de interesse com uma etiqueta HALO ou SNAP30.

Especialmente para proteínas citoplasmáticas que são abundantes em todo o axônio, uma abordagem de marcação condicional pode ser necessária. Recentemente, visualizamos essa carga, espectrina endógena, por microscopia de fluorescência usando marcação controlada temporalmente para visualizar apenas novas proteínas de espectrina sintetizadas. Para marcação condicional com resolução de neurônio único, combinamos a expressão impulsionada por choque térmico de uma recombinase com um sistema de GFP dividido31.

Se o objetivo da pesquisa visa entender o transporte de organelas, a expressão de um domínio proteico que se associa à organela pode fornecer uma alternativa à expressão ectópica da proteína de comprimento total.

Etapas críticas no protocolo
Uma preparação cuidadosa para otimizar a visualização da proteína com base nos níveis de expressão esperados, bem como para escolher a estratégia de marcação ideal, é especialmente crítica para a visualização bem-sucedida de proteínas marcadas endógenas. Os níveis de expressão para a maioria das proteínas em muitos neurônios podem ser estimados com base no conjunto de dados transcriptômicos do Cengen13. A baixa intensidade de sinal esperada de eventos de transporte para proteínas de baixa expressão ou citoplasmáticas pode ser melhorada anexando várias cópias do fluoróforo. Observe, no entanto, que em qualquer experimento de rotulagem, deve-se tomar cuidado para não interromper a função da proteína marcada. Caso exista um fenótipo conhecido para o mutante correspondente, é importante verificar se a marcação não gera esse fenótipo. Nos casos em que não há fenótipo conhecido, são necessárias abordagens alternativas que variam caso a caso.

Uma etapa crítica na imagem de eventos de transporte axonal é o estado de saúde do animal. Os animais devem ser tratados o mais suavemente possível para a preparação da imagem, bem como durante a imagem (por exemplo, uso de um palito de cabelo em vez de um fio de metal para transferir animais paralisados, minimizando o tempo de incubação no agente paralisante, minimizando o tempo de imagem para evitar fototoxicidade).

Modificações e solução de problemas
Embora pretendamos otimizar a visualização do transporte axonal de proteínas endógenas, as estratégias de otimização para parâmetros de aquisição também são aplicáveis a proteínas expressas ectópicas. Especialmente se os níveis de expressão endógena forem muito baixos para visualizar eventos de transporte, a expressão ectópica da proteína pode fornecer uma alternativa.

Caso nenhum evento de transporte possa ser registrado apesar de uma forte intensidade de sinal da proteína marcada endógena, os animais podem estar em um estado insalubre. Isso pode ser resolvido preparando os animais para microscopia sob procedimentos de preparação mais suaves (por exemplo, diminuir o tempo de incubação no agente paralisante). Alternativamente, os eventos de transporte podem ser raros e uma gravação de vídeo de 3 minutos pode não ser suficiente para capturar eventos. A captura de eventos raros de transporte pode ser otimizada aumentando a duração da gravação de vídeo, aumentando o número de animais fotografados ou imaginando os animais em um estágio de desenvolvimento diferente no qual os eventos de transporte podem ser mais frequentes.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses concorrentes ou financeiros que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer aos laboratórios Yogev e Hammarlund pela assistência técnica, feedback e discussões. Gostaríamos de agradecer especialmente a Grace Swaim pela orientação em imagens de células vivas e a Grace e Brian Swaim por estabelecerem inicialmente a análise manual do quimógrafo no laboratório. OG é apoiado por uma bolsa de estudos Walter-Benjamin financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) -Projeto # 465611822. O SY é financiado pela bolsa do NIH R35-GM131744.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA9539
Lamínulas (22 mm x 22 mm, No1); Vidro de cobertura de vedação douradaThomas Scientific6672A14
LevamisolChemCruzsc-205730
Microscópio: microscópio invertido Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, câmera Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, objetiva de imersão em óleo Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, scanner de fotoestimulação Nikon a 488 nm com filtro de emissão ET525/36Microscópio
  NIS-elements ARNikonSoftware para Nikon Ti2 
Lâminas de microscopia simples pré-limpasThermo Scientific420-004T
Cepa de nematóidesFonte do identificador
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161 Será depositado no CGC (https://cgc.umn.edu/)
confocal de disco giratório Nikon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).">Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).">Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  3. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).">Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).
  4. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).">Roy, S. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).
  5. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).">Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).
  6. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).">Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  7. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).">Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).
  8. https://cgc.umn.edu/ (2023).">Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: https://cgc.umn.edu/ (2023).
  9. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).">Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).
  10. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).">He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  11. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).">Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  12. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).">Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  13. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).">Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  14. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).">Takihara, Y. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  15. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).">Li, L. B. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).
  16. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).">Viancour, T. A., Kreiter, N. A. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).
  17. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).">Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).
  18. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).">Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).
  19. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).">Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  21. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).">Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  22. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).">Hall, D. H., Russell, R. L. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).
  23. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).">White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).
  24. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).">White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).
  25. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).">Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).
  26. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).">Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).
  27. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).">Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).">Goudeau, J., et al. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).
  29. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).">Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  30. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).">Fan, X., et al. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).
  31. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).">Glomb, O., et al. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal TransportFluorescence MicroscopyCaenorhabditis ElegansEndogenous CargoSynaptic Vesicle PrecursorsGFP RAB 3Kymograph AnalysisTime Lapse ImagingCRISPR Cas9 LabelingAxon Imaging

Related Articles