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Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

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DOI:

10.3791/66237

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30 de agosto de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Resumo

A principal célula de suporte da retina é a célula glial de Müller da retina. Eles cobrem toda a superfície da retina e estão próximos dos vasos sanguíneos da retina e dos neurônios da retina. Devido ao seu crescimento, as células de Müller realizam várias tarefas cruciais em uma retina saudável, incluindo a captação e reciclagem de neurotransmissores, compostos de ácido retinóico e íons (como potássio K + ). Além de regular o fluxo sanguíneo e manter a barreira hemato-retiniana, eles também regulam o metabolismo e o fornecimento de nutrientes para a retina. Um procedimento estabelecido para isolar células primárias de Müller de camundongo é apresentado neste manuscrito. Para entender melhor os processos moleculares subjacentes envolvidos nos vários modelos de camundongos de distúrbios oculares, o isolamento de células de Müller é uma excelente abordagem. Este manuscrito descreve um procedimento detalhado para o isolamento de células de Müller de camundongos. Da enucleação à semeadura, todo o processo dura cerca de algumas horas. Por 5-7 dias após a semeadura, o meio não deve ser alterado para permitir que as células isoladas cresçam sem impedimentos. A caracterização celular usando morfologia e marcadores imunofluorescentes distintos vem a seguir no processo. As passagens máximas para as células são de 3 a 4 vezes.

Introdução

As células de Müller (MCs) são as principais e mais abundantes células gliais encontradas no tecido retiniano. Eles são os principais atores no fornecimento de integridade estrutural e funções metabólicas dentro da retina1. A estrutura estratégica dos MCs está espalhada por toda a espessura da retina, fornecendo suporte à retina. Além de suas propriedades semelhantes a andaimes, eles têm funções metabólicas para os neurônios da retina, fornecendo-lhes substratos energéticos, incluindo glicose e lactato. Essas funções são cruciais para manter a função neuronal saudável. Foi relatado que MCs prejudicados contribuem para várias doenças da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética e glaucoma 2,3. Os MCs podem ser fontes celulares endógenas para terapia regenerativa na retina1. Eles também compreendem uma porção significativa da retina, e fortes evidências sugerem que, em várias espécies, essas células podem ser estimuladas a substituir os neurônios ausentes2. Eles colaboram beneficamente com os neurônios, e os pés finais das células de Müller com ramificações cônicas desembainham densamente os vasos sanguíneos e conectam os componentes neurais da retina. Para manter o desenvolvimento neuronal e a plasticidade neuronal, as células de Müller atuam como um substrato macio para os neurônios, protegendo-os de traumas mecânicos3. Além disso, em circunstâncias patológicas, as células de Müller podem se diferenciar em progenitores neurais ou células-tronco que replicam ou regeneram os fotorreceptores e neurônios perdidos 2,3,4. As células de Müller mantêm as características das células-tronco da retina, incluindo diferentes níveis de potencial de auto-renovação e diferenciação 5,6. A célula glial de Müller tem uma linhagem retiniana significativa que produz fatores neurotróficos, capta e recicla neurotransmissores, tampona espacialmente os íons e mantém a barreira hemato-retiniana para manter a retina em homeostase 7,8,9. Isso destaca o potencial das células de Müller como uma ferramenta promissora em terapias baseadas em células para o tratamento de doenças relacionadas à degeneração da retina. As células de Müller são a glia primária distribuída por toda a retina, conectando-se a neurônios e vasos sanguíneos. Eles desempenham um papel protetor crucial, fornecendo suporte estrutural e metabólico essencial para manter a viabilidade e estabilidade das células da retina. Infelizmente, muito poucos protocolos são encontrados na literatura para isolamento primário de células de Müller da retina10,11.

Apresentamos uma abordagem aprimorada para isolar e cultivar de forma confiável células primárias de Müller de camundongo. Este protocolo foi usado em nosso grupo para isolar células de Müller de camundongos C57BL/6 do tipo selvagem e camundongos transgênicos12,13. Camundongos com idade entre 5 e 11 dias, sem preferência sexual, são utilizados para este protocolo. As células foram passadas até 4 vezes; no entanto, em P4 eles param de aderir ao frasco e torna-se difícil cultivar uma cultura saudável. A cultura é frequentemente contaminada com células epiteliais pigmentadas da retina (RPE), portanto, as células devem ser passadas pelo menos uma vez antes de realizar qualquer experimento adicional na linha celular. A passagem permite um maior isolamento de contaminantes. Portanto, o protocolo apresentado oferece uma maneira rápida e eficaz de isolar células de Müller de camundongos, que podem ser usadas como uma plataforma confiável para pesquisar alvos terapêuticos e avaliar possíveis tratamentos para doenças da retina14.

Protocolo

Todos os experimentos com animais estavam em conformidade com a declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e foram feitos seguindo nosso protocolo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pelas políticas da Universidade de Oakland (número de protocolo 2022-1160)

1. Preparação de meios e soluções

  1. Preparar a solução de olho de células de Müller suplementando o meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM, pormenores na tabela de materiais) com penicilina/estreptomicina na diluição de 1:1000. Por exemplo, para 10 mL de DMEM, adicione 10 μL de penicilina/estreptomicina.
    NOTA: Este é um meio simples e sem soro preparado. Além disso, aqueça o meio completo em banho-maria a 37 °C antes de usá-lo para o trabalho de cultura de células.
  2. Prepare o meio de crescimento primário completo de células de Müller suplementando o DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS, inativado pelo calor) e 1% de penicilina/estreptomicina. Por exemplo (500 mL de meio DMEM + 50 mL de FBS + 5 mL de penicilina/estreptomicina).
  3. Prepare uma solução de tripsina-EDTA a 0,05% com colagenase IV a uma concentração de 200 U / mL (a tripsina-EDTA é usada para dissolver a quantidade calculada de pó de colagenase IV para atingir a concentração necessária).

2. Enucleação

  1. Eutanasiar eticamente o camundongo usando a inalação de CO2 seguindo as diretrizes da IACUC.
    1. Resumidamente, coloque o(s) animal(is) na câmara de CO2 para introduzir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 30-70% da câmara vol/min com CO2 para atingir o objetivo de inconsciência rápida dentro de 2-3 min com o mínimo de sofrimento para os camundongos.
    2. Como os camundongos são jovens (~ 10 dias), realize a luxação cervical como método secundário para garantir a eutanásia adequada.
  2. Depois de esterilizar a área de trabalho com etanol a 70%, coloque o mouse em uma almofada estéril.
  3. Extraia os olhos colocando os braços da pinça na parte de trás do olho, puxando suavemente da área orbital e enucleando os olhos aplicando pressão com uma pinça estilo 5/45 na área orbital para causar proptose.
    NOTA: Esterilize as ferramentas de dissecção com etanol a 70% seguido de solução salina tampão fosfato antes da dissecção.
  4. Certifique-se de que o nervo óptico ainda esteja conectado ao olho, enucleando o olho lentamente. Certifique-se de puxar o nervo óptico (visualmente identificado como um cordão branco) atrás do olho.
    NOTA: Esta etapa não precisa ser realizada ao microscópio e pode ser realizada em uma bancada esterilizada.

3. Tratamento dos olhos enucleados

  1. Cubra um tubo de centrífuga de 15 mL com papel alumínio e encha o tubo com 10 mL da solução de olho de células de Müller.
  2. Coloque os olhos dissecados no tubo de 15 ml contendo a solução ocular de células de Müller e deixe-os repousar durante a noite, ou cerca de 18 h, à temperatura ambiente.
  3. Após 18 h, decantar a solução para os olhos e enxaguar brevemente os olhos com 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) aquecida (37 °C).
  4. Transvasar o PBS e deslocar os olhos para uma placa de Petri de 100 mm contendo 10 ml de solução de tripsina. (preparado na etapa 1.3).
    NOTA: A tripsina é usada em todo o olho enucleado, atuando como um agente dissociativo para facilitar a separação celular das camadas da retina durante a dissecção. A retina dissecada tem muitas células, incluindo células RPE, que são pegajosas e mais propensas a contaminar a cultura de células de Müller14. O exame microscópico demonstrou claramente que, após 5 dias de isolamento (durante a primeira troca de meio), as células do EPR se desprenderam da placa e morreram13. O meio utilizado para isolamento de EPR é o DMEM/F-12, com composição diferente do DMEM (utilizado no isolamento de células de Müller), contendo piruvato de sódio e baixo teor de glicose.
  5. Coloque o prato em uma incubadora e incube por 1,5 a 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.
  6. Após a incubação, transfira os olhos para uma placa de Petri de 60 mm contendo cerca de 5 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.

4. Dissecção

NOTA: Este procedimento deve ser realizado dentro do ambiente estéril da capela de cultura. Portanto, é essencial esterilizar completamente as superfícies do exaustor com álcool 70%, juntamente com todas as ferramentas e o microscópio de dissecação. Vale ressaltar que o vídeo foi gravado fora do capô para melhor visibilidade e demonstração mais clara.

  1. Coloque um pequeno pedaço de tecido esterilizado de laboratório no prato para ajudar a estabilizar os olhos durante a dissecção. Coloque os olhos sob um microscópio de dissecação para iniciar a dissecção.
    NOTA: O uso de tecido de laboratório facilita a manobra dos olhos em um prato cheio de líquido (meio completo), garantindo uma dissecção precisa.
  2. Use uma tesoura Vannas e uma pinça estilo M5S para remover o tecido conjuntivo, os músculos extraoculares e o nervo óptico.
    1. Segure o olho com uma pinça estilo M5S e faça uma incisão na seção ora serrata com uma tesoura Vannas ou uma agulha de seringa.
      NOTA: Existe uma linha circular azul clara entre a parte anterior e posterior do olho chamada ora serrata, que pode ser usada como um ponto de referência para uma direção precisa durante a dissecção.
    2. Segure a incisão com uma pinça estilo M5S e puxe ou rasgue a córnea da parte posterior do olho. Puxe em pequenos incrementos para garantir que a integridade da retina permaneça intacta.
      NOTA: Essas etapas são para remover a parte anterior do olho (córnea, íris e cristalino) da parte posterior da ocular (retinas neurais e pigmentadas).
    3. Para manter a integridade das camadas da retina, puxe suavemente e remova o epitélio pigmentado da retina da retina neural. A retina neural deve estar livre de manchas pretas para garantir a pureza do isolamento o máximo possível, pois a camada de EPR geralmente é pegajosa e presa à retina neuronal.
    4. Corte a retina neural dissecada em pequenos pedaços antes de coletá-la em uma placa para garantir uma distribuição homogênea das células na placa.
  3. Colocar as retinas neurais em um frasco T25 contendo 4 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller.
  4. Por fim, colocar o balão numa incubadora e incubar a 37 °C e 5% de CO2.

5. Cultura de células gliais primárias de Müller

  1. Não mova o frasco por 3-5 dias para promover o crescimento celular.
  2. Troque a mídia após o quinto dia e a cada dois dias até que as células estejam 90% confluentes.

6. Passagem de células gliais primárias de Müller

  1. Aspirar o meio de cultura de células de Müller, seguido de 2 ml de lavagem em PBS, e aspirar o PBS. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (1x), ou o suficiente para cobrir a placa.
  2. Incube por 5-10 min em temperatura ambiente.
  3. Certifique-se de que as células estejam separadas da placa sob o microscópio. Em seguida, recolha a suspensão celular e adicione 4 ml de meios de crescimento primários completos de células de Müller pré-aquecidos (37 °C) (preparados no passo 1.2) ao tubo de recolha.
  4. Centrifugue por 7 min a 300 x g. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento primário completo de células de Müller. Como o número de células pode variar de acordo com o número de olhos dissecados, é melhor contar as células antes da semeadura e incubação. A densidade de semeadura recomendada é de 3,0 x 106 células em um balão T75.
    NOTA: As células podem ser passadas até 4-5 vezes. No entanto, os resultados mais consistentes do experimento são encontrados após 1-2 passagens.

7. Imunofluorescência

NOTA: Use o protocolo de imunofluorescência para corar e validar a especificidade das células de Müller. Aqui está uma breve visão geral do protocolo de imunofluorescência. Esta etapa é realizada após a primeira passagem12.

  1. Semeie as células em uma lâmina de câmara de cultura celular (30.000 células por poço para uma lâmina de câmara de 8 poços).
  2. Cultivar as células isoladas durante 24-48 h num meio de cultura de células Müller completo (preparado no passo 1.2) a 37 °C e 5% de CO2.
  3. Aspire o meio e lave a lâmina da câmara com 250-300 μL de 1x PBS em cada poço quando as células estiverem 80-90% confluentes.
  4. Fixe a lâmina por 10 a 15 min em 250-300 μL de paraformaldeído a 4% em cada poço, seguido de lavagem com PBS / TX-100 (5 min cada / 3x).
  5. Adicionar tampão de bloqueio durante 1 h a 37 °C (ver Tabela de Materiais).
  6. Aspirar a solução de bloqueio e, em seguida, adicionar os anticorpos primários específicos para as células de Müller para confirmar a pureza das células isoladas utilizando glutamina sintetase e vimentina 5,12. Incubar durante 3 h a 37 °C (utilizando uma concentração de anticorpos de 1:100-1:200 em tampão de bloqueio num volume de 150-200 μL/lâmina). Lave a lâmina com PBS/TX-100 lavagens (5 e 10 min cada).
    NOTA: Esses anticorpos foram escolhidos por serem características para identificar células de Müller e garantir o sucesso e a pureza da cultura de células de Müller.
  7. Adicione o anticorpo secundário (com uma concentração de anticorpos variando de 1:1000 em tampão de bloqueio em 150-200 μL / lâmina) e incube por 1 h a 37 ° C. Em seguida, lave com PBS / Triton X-100, três vezes (5-10 min cada).
  8. Aplique uma gota de meio de montagem DAPI para rotular os núcleos antes de cobrir a lâmina com uma lamínula. Evite bolhas de ar ao colocar a lamínula.
  9. Use um microscópio fluorescente para verificar a lâmina e capturar imagens (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: As células estão localizadas com DAPI em ex/em 359/461 com ampliação de 10x para localizar células; maior ampliação pode capturar células. Outros comprimentos de onda dependeriam da cor escolhida. Cor verde (GFP) - ex/em 488/510. Cor vermelha (Cy3) - ex / em 555/569.

Resultados

Validação da especificidade, pureza e função de barreira de células de Müller isoladas
Para confirmar a viabilidade, morfologia e qualidades distintivas das células de Müller isoladas, as células foram examinadas ao microscópio óptico. As imagens P0 e P1 foram registradas (Figura 1A). Para verificar a contaminação das células de Müller isoladas com células RPE e confirmar sua pureza, a coloração por imunofluorescência (IF) foi realizada usando anticorpos específicos para o marcador celular RPE, RPE65. Células pigmentadas da retina humana (ARPE-19) foram usadas como controle positivo. As células RPE coradas com RPE65 (vermelho e azul para coloração nuclear) são mostradas na Figura 1B (painel inferior). Os anticorpos específicos RPE65 não coraram as células de Müller isoladas (Figura 1B, painel superior). O fato de o RPE65 ter corado as células ARPE-19 (vermelho) e não ter corado as células isoladas, indica que as células isoladas não são células RPE. A presença de piruvato e baixa glicose no meio estabelece condições desfavoráveis para o crescimento de células RPE. Consequentemente, mesmo em caso de contaminação das células do EPR, elas acabarão se desprendendo do frasco.

Além disso, para confirmar a identidade das células isoladas, uma coloração de imunofluorescência de células de Müller para marcadores específicos de células de Müller foi usada para confirmar o isolamento bem-sucedido das células de Müller. Foi utilizada a proteína do filamento intermediário do citoesqueleto denominada vimentina12,13. Além disso, a glutamina sintetase (GS), que catalisa a reação de condensação de glutamato e amônia para formar glutamina, como uma função chave das células gliais de Müller da retina, também foi usada5.

Coletivamente, as células isoladas coraram negativo para RPE65 (vermelho, Figura 1B), positivo para vimentina (verde, Figura 1C) e GS (verde, Figura 1D). A coloração IF confirma o isolamento bem-sucedido (pureza e especificidade) das células de Müller isoladas. A Figura 1E é um controle negativo para vimentina (painel superior) e GS (painel inferior), confirmando a especificidade dos anticorpos.

figure-results-1
Figura 1: Validação do isolamento das células de Müller (pureza e especificidade). (A) Imagem de microscopia de luz para passagens: passagem zero (P0) e (P1) morfologia. (B) Imunomarcação RPE65 combinada com coloração nuclear DAPI. (C) Imunomarcação de vimentina com coloração nuclear DAPI em alta ampliação. (D) Imunocoloração GS com a mesma alta ampliação. (E) controles negativos para confirmar a especificidade da coloração de vimentina e anticorpos GS. barra de escala = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O isolamento do epitélio pigmentado primário da retina (EPR) de camundongos foi previamente documentado por nosso laboratório. Este manuscrito descreve um protocolo de demonstração detalhado para o isolamento primário de células de Müller. Este procedimento envolve enucleação, tratamento, dissecação, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células de Müller isoladas de olhos de camundongos. Baseia-se em um protocolo previamente bem-sucedido encontrado em publicações anteriores e em nosso protocolo modificado que usamos em uma publicação recente1 2,13. Embora as etapas sejam diretas, o isolamento bem-sucedido das células de Müller requer a adesão a restrições específicas e requisitos essenciais. Após inúmeras tentativas de tentativa e erro para otimizar este protocolo, vários fatores que influenciam seu sucesso foram identificados.

A idade ideal do camundongo, conforme observado em nossos experimentos, foi encontrada entre 5 e 11 dias para cultivar as células isoladas em até quatro passagens. A cultura também é influenciada por quantos olhos são isolados e cultos. Para isolamento único, são necessários pelo menos dois olhos para obter um número suficiente de células para poder crescer e se multiplicar. Outro aspecto importante é a duração entre a enucleação e o plaqueamento; portanto, esta etapa precisa ser executada com relativa rapidez. Observou-se que a manipulação prolongada do tecido ocular tem um efeito prejudicial na capacidade das células de aderir ao frasco e se multiplicar. Para garantir que a proximidade das células isoladas seja próxima o suficiente para estimular a proliferação, aconselhamos o uso de um frasco T25. Uma vez feita a primeira passagem, as células podem ser revestidas em um T75. Além disso, as células não devem ser perturbadas após o isolamento e a semeadura, removendo o frasco de cultura de tecidos da incubadora ou trocando o meio por pelo menos 5 dias. Finalmente, as células só podem ser passadas cerca de quatro vezes antes de pararem de aderir. Embora este procedimento seja simples e fácil de executar, ele tem algumas limitações, incluindo a idade dos camundongos, número limitado de passagens celulares, etc.

Não existem muitos protocolos para isolamento de células de Müller, mas existem algumas diferenças notáveis deste protocolo para os protocolos disponíveis 5,14. Primeiro, o tempo entre a enucleação e o isolamento é significativamente diferente. Outros protocolos sugerem dissecção logo após a enucleação, geralmente em 10 minutos. Considerando que o protocolo atual sugere um período de repouso de pelo menos 18 h, pois isso proporcionou os melhores resultados para isolamento neste protocolo. Outra diferença significativa entre este protocolo e outros protocolos é o ponto em que os olhos são tratados com enzimas. Nesse protocolo, os olhos são tratados antes de qualquer dissecção ter sido realizada, antes mesmo da remoção do tecido conjuntivo e dos músculos extraoculares. Enquanto outros protocolos isolam as retinas do olho antes do tratamento com enzimas. Além disso, a receita da enzima também é diferente. Neste protocolo, a solução enzimática consiste em tripsina e colagenase tipo IV. Em protocolos semelhantes, a papaína e a DNase são usadas para a digestão tecidual. Além disso, o vaso de cultura é diferente, este protocolo sugere a cultura em um T25 e depois em um T75 após a primeira passagem. Enquanto outros protocolos usam placas de Petri ou placas de vários poços. Finalmente, este protocolo sugere que o frasco não deve ser perturbado (por 5-7 dias) para promover o crescimento celular. Enquanto em outros protocolos a mudança de mídia é realizada após um dia.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse relevantes para o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute (NEI), The National Eye Institute (NEI) fundo R01 EY029751-04. Gostaríamos de agradecer à Dra. Sylvia B. Smith, pois este protocolo foi modificado com base em seu protocolo de isolamento de células de Müller.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Copo : 100mLKIMAX14000
Colagenase IV Worthington 
Pipetas de Transferência Graduada Descartáveis :3.2mL Estéril13-711-20
DMEM (1X) Thermo Scientific11885084Media para desenvolver Mü células de Ller
Soro Fetal Bovino (FBS)gibco26140079Para meio de cultura celular completo
Muller Glutamina sintaseSinalização celular80636
Heracell VISO 160i Incubadora de CO2Thermo Scientific50144906
Kimwipes34155Kimberly-Clark
com agulha anexada 21 G x 1 1/2 pol., estéril, uso único, 3 mLB-D
Tubo de Micro Centrífuga: 2 mLCaneta Grainger11L819
Strepgibco15140-122Para Mü completo; meio de cultura de células
Phosphate Buffer salino (PBS)Thermo ScientificJ62851.
Pinças de Ação Positiva AP, Estilo 5/45Dumont72703-DZ
Tesoura Iris Standard Reta 11.5cmGARANA INDUSTRIES2595
Centrífuga Sorvall St8MicroscópioThermoScientific 75007200
Stemi 305Zeissn/a
, #11, Aço InoxidávelBard-Parker371211
Prato de Cultura de Suspensão 60mm x 15mm EstiloCorning430589
Prato de Cultura de Tecidos: 100x20mm estiloCorning353003
Tubos de Tornado: 15mLMidsciC15B
Tubos de Tornado: 50mLPinças MidsciC50R
5MS, 8.2cm, Retas, 0.09x0.05mm PontasDumont501764
Pinças Positive Action Style 5, Biológicas, Dumostar, Acabamento Polido, 110 mm OALMicroscopia Eletrônica Ciências Dumont50-241-57
Underpads, Moderado: 23" X 36"McKesson4033
Tesoura de Mola Vannas - 2.5mm Cutting EdgeFST15000-08
Vimentin invitrogenMA5-11883
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissn/a
LS004188 Seringa Luer-Lok da 309577 Lâmina Cirúrgica

Referências

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