Artigo de método

Tecnologia 2D-HPLC-MS combinada com rede molecular para a identificação de componentes na medicina tibetana Aconitum pendulum

DOI:

10.3791/66239

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8 de dezembro de 2023

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1Ethnic Medicine Academic Heritage Innovation Research Center, Meishan Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, 4Key Laboratory of Phytochemical R&D of Hunan Province, Hunan Normal University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este estudo utiliza a tecnologia bidimensional de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa (2D-HPLC-MS) em conjunto com redes moleculares para desvendar a intrincada composição química da planta medicinal tibetana Aconitum pendulum Busch (APB). O artigo fornece um protocolo detalhado para a exploração sistemática e identificação de componentes químicos complexos de medicamentos fitoterápicos.

Resumo

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Neste estudo, uma abordagem abrangente foi empregada, utilizando a tecnologia 2D-HPLC-MS em conjunto com a rede molecular para desvendar a intrincada composição química da planta medicinal tibetana APB. Através da implementação de HPLC 2D, foi alcançada uma separação aprimorada de misturas complexas, permitindo o isolamento de compostos individuais para análise subsequente. A abordagem de rede molecular auxiliou ainda na elucidação das relações estruturais entre esses compostos, contribuindo para a determinação de potenciais moléculas bioativas. Essa estratégia integrada identificou com eficiência uma ampla gama de componentes químicos presentes na planta. Os resultados revelaram um espectro diversificado de constituintes químicos dentro do APB, incluindo alcalóides, entre outros. Esta pesquisa não apenas avança na compreensão do perfil fitoquímico desta medicina tradicional tibetana, mas também fornece informações valiosas sobre suas potenciais propriedades terapêuticas. A integração de 2D-HPLC-MS e rede molecular prova ser uma ferramenta poderosa para explorar e identificar sistematicamente composições químicas complexas em medicamentos fitoterápicos, abrindo caminho para mais pesquisas e desenvolvimento no campo da descoberta de produtos naturais.

Introdução

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A medicina tibetana é parte integrante da medicina tradicional chinesa, aderindo aos princípios das práticas médicas tibetanas, e é usada para prevenção e tratamento de doenças1. No entanto, a fitoterapia tibetana contém constituintes químicos vegetais complexos caracterizados por flutuações significativas no conteúdo. A compreensão limitada dos elementos bioativos fundamentais tornou-se um gargalo na modernização da medicina tibetana2. A aplicação da cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS), combinando o forte poder de separação da cromatografia com a alta sensibilidade da espectrometria de massas (MS), tem sido amplamente utilizada na análise da medicina natural3. No entanto, devido à limitação de um único mecanismo de separação, componentes com estruturas altamente semelhantes tendem a coeluir na separação unidimensional por cromatografia líquida. Na análise espectrométrica de massa subsequente, os componentes coeluídos de baixa abundância são difíceis de detectar devido à supressão de íons causada por componentes de alta abundância4.

2D-HPLC, que significa cromatografia líquida bidimensional de alta eficiência, representa um novo método cromatográfico que combina harmoniosamente diferentes mecanismos de separação usando um par de colunas. Isso inclui a fusão ou alternância de cromatografia de fase normal com cromatografia líquida de fase reversa e cromatografia líquida de interação hidrofílica com cromatografia líquida de fase reversa5. Ao mesclar essas propriedades cromatográficas complementares, a capacidade de separação aprimorada é alcançada, abordando efetivamente os desafios causados por matrizes de amostra complexas6. Além disso, ao acoplar cromatografia bidimensional com MS, a poderosa capacidade de separação de 2D-HPLC e a capacidade de detecção de alta sensibilidade de MS podem ser totalmente integradas, fornecendo suporte para o estudo de sistemas complexos de medicamentos e seus constituintes fundamentais 7,8,9.

A medicina tibetana geralmente apresenta uma gama multifacetada de componentes e funcionalidades, onde os ingredientes ativos normalmente existem em composições intrincadas e em concentrações mínimas. Ao integrar o 2D-LC como um sistema de separação robusto e o MS como um detector extremamente sensível, os desafios impostos por amostras complexas em termos de separação e identificação podem ser abordados de forma mais eficaz 10,11,12. Esse amálgama contribui substancialmente para o avanço da exploração da composição química da medicina tibetana.

Independentemente de ser LC-MS tradicional ou 2D-LC-MS, uma grande quantidade de informações pode ser obtida. No entanto, extrair informações estruturais de componentes complexos do sistema a partir dessa enorme quantidade de informações sempre foi um desafio significativo. Portanto, os pesquisadores desenvolveram vários métodos para triagem e mineração de dados de EM. A Rede Molecular Social de Produtos Naturais Globais (GNPS) é uma plataforma de organização e visualização de dados MS/MS onde os dados de espectrometria de massa 2D-LC-MS podem ser carregados13. Cada espectro é considerado um vetor e comparado a todos os outros espectros usando similaridade de cosseno. Quando a semelhança entre dois espectros excede um limite, eles são conectados em uma rede molecular (MN). Isso pode ser usado para a identificação rápida de compostos conhecidos e a determinação de vários produtos naturais desconhecidos14.

A medicina tibetana geralmente tem múltiplas funções, mas sua composição complexa e diferenças significativas de concentração dificultam a elucidação efetiva da relação entre função e base material15. Um estudo aprofundado da medicina tibetana requer a caracterização sistemática do maior número possível de componentes. No âmbito deste estudo, pretendemos usar o APB na medicina tibetana como objeto de pesquisa para demonstrar a estratégia e o processo de estudo sistemático dos componentes químicos complexos da medicina tibetana usando a tecnologia 2D-HPLC-MS e a tecnologia MN. Na construção do sistema cromatográfico 2D, combinamos cromatografia líquida de fase reversa e cromatografia líquida de interação hidrofílica com mecanismos de separação significativos para obter uma separação mais eficaz dos componentes complexos do APB16. Além disso, para superar a incompatibilidade de solventes entre as duas dimensões, foi adotado um modo de modulação de diluição na coluna. Ao combinar a poderosa capacidade de separação do 2D-LC com a capacidade de detecção de alta sensibilidade do MS, as informações espectrais dos componentes complexos no APB são obtidas de forma mais eficaz e abrangente. Além disso, por meio da rede e visualização de informações espectrais massivas pela tecnologia MN, os componentes do APB são sistematicamente analisados. Espera-se que a estratégia e o processo demonstrados neste estudo sejam aplicados ao estudo de outros medicamentos tibetanos, promovendo pesquisas sobre a base material da medicina tibetana, que é de grande importância para o avanço dos recursos da medicina tibetana e para a melhoria dos padrões de controle de qualidade das ervas tibetanas17. O processo experimental geral é mostrado na Figura 1.

No experimento aqui apresentado, um novo modulador de diluição na coluna foi introduzido no sistema de cromatografia líquida bidimensional (2D-LC) da Agilent18. Ao adicionar uma bomba de entrega independente, o caminho do fluxo da análise foi alterado, resultando em uma alta ortogonalidade da análise 2D-LC. O acoplamento e a comutação entre as duas dimensões são realizados por duas válvulas de seis portas, conforme mostrado na Figura 2. Quando um loop de amostra é preenchido na primeira dimensão, outro loop de amostra é analisado na segunda dimensão. Isso significa que o tempo de preenchimento do loop 1D e o tempo de execução do 2D são iguais. Isso requer o gradiente rápido gerado pela bomba binária na segunda dimensão. Nenhum pico é perdido quando todo o efluente é analisado. Isso é particularmente útil para a análise de amostras desconhecidas. Isso resulta em um grande número de cromatogramas 2D que precisam ser combinados para análise de dados.

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Protocolo

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1. Preparação

  1. Preparação da amostra
    1. Use uma balança de sensibilidade de 1/10.000 para pesar 0,25 g (peso seco) de APB em um tubo de microcentrífuga de 3 mL, adicione 2,5 mL de metanol e depois sonique por 30 min (potência 240 W, frequência 40 kHz).
    2. Efectuar centrifugação a 1,2 x g durante 5 min, recolher o sobrenadante e filtrar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro de 0,22 μm.
  2. Preparação de materiais experimentais
    1. Prepare a fase móvel bidimensional, use acetonitrila como fase orgânica da fase B e configure água ultrapura de ácido fórmico a 0,1% como fase aquosa A.
    2. Realize a filtração bifásica (0,22 μm) e sonice usando uma máquina de ultrassom (40 kHz) por 15 min. Purgue a fase móvel substituída para remover as bolhas. Neste experimento, a coluna C18 foi usada como a coluna 1D, a coluna hidrofílica como a coluna 2D e a coluna foi montada no instrumento.
  3. Ajuste da relação de derivação apropriada
    1. Conecte a linha de saída do instrumento 2D-LC através de um T à entrada de massa e a outra extremidade do T a uma linha desviada. Ajuste a taxa de fluxo para um valor adequado para garantir que a taxa de fluxo no espectro de massa seja de 0.3-0.5 mL / min.
      NOTA: Como a segunda dimensão do 2D-LC geralmente é definida acima de 2 mL/min, essa taxa de fluxo é muito grande para MS, por isso é necessário realizar uma divisão.

2. Operação 2D-LC

  1. Clique duas vezes no ícone Instrumento 1 Online e a estação de trabalho química se comunicará automaticamente com o 1260 LC e entrará na estação de trabalho.
  2. Para a configuração do parâmetro do método 2D-LC, selecione a tela Método e controle de execução no menu Exibir para chamar a interface desejada, que normalmente será inserida por padrão. Clique no módulo injetor, clique com o botão direito do mouse em Método, defina o volume de injeção, a vazão e o gradiente de tempo de fase móvel da bomba 1D.
  3. Insira o tempo de execução de amostra em Tempo de parada. Clique no menu principal Instrumento e clique em Método 2D-LC no menu suspenso. Selecione Abrangente no modo 2D-LC. Digite 2 min no tempo de modulação, 1.9 min no tempo de parada de gradiente 2D. Defina as configurações de fluxo para 2 mL. Edite o gradiente 2D e defina os comprimentos de onda. Depois de editar o método, selecione Salvar Método Como no menu Método para nomear o novo método e clique em OK.
    NOTA: A bomba de transferência externa requer ajuste manual da vazão.

3. Operação MS

  1. Ligue o interruptor da bomba de vácuo. Abra a válvula principal do cilindro de argônio e a válvula divisora de pressão e ajuste a pressão para cerca de 0,3 MPa. Abra a válvula de nitrogênio.
  2. Aguarde pelo menos 8 h para garantir um vácuo adequado para as condições experimentais. Verifique se a pressão do ar de argônio e nitrogênio é alta o suficiente antes da análise.
  3. Para iniciar o software de controle MS, clique na fonte Heating SEI no painel do software e insira os parâmetros MS, incluindo temperatura do aquecedor (350 °C), vazão da bainha (35 arb), vazão de ar auxiliar (15 arb), tensão de pulverização (3.8 KV no modo positivo, -2.5 KV no modo negativo) e temperatura capilar (275 °C). Clique no botão Aplicar para ativar a fonte de íons.
  4. Para configurar o método MS, insira valores para configurar o tempo de aquisição, polaridade, faixa de massa, número do valor de transferência, duração do valor de transferência e muito mais. Defina o tempo de execução do MS (min): 93,00. Configurar detalhes do ScanEvent: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c norm Dep MS/MS, íon mais intenso de (1): Tipo de ativação: CID, Min. Sinal necessário: 500, Largura de isolamento: 2,00, Normalized Coll. Energia: 35,0, Estado de carga padrão: 3, Ativação Q: 0,250, Tempo de ativação: 93,000. Para definir configurações dependentes de dados, use configurações de polaridade separadas como desabilitadas, Perda neutra na parte superior:3, Produto na parte superior: 3. Clique em Salvar para definir as configurações como o método do instrumento.
    NOTA: O tempo de fim de execução é consistente com o 2D-LC.
  5. Clique no botão Configuração de sequência para abrir a tabela de sequência. Insira o tipo de amostra, nome do arquivo, caminho, ID da amostra, método do instrumento, local, quantidade de injeção e outras informações no formulário.
  6. Clique no botão Salvar para registrar a listagem de sequências e, em seguida, clique no botão Iniciar Análise para configurar e iniciar a aquisição do MS. Clique em Run Control no instrumento 2D-LC e selecione Run Method. Ao mesmo tempo, o instrumento MS também clica no botão Executar .
    NOTA: Como o 2D-LC e o MS não são controlados pelo mesmo software neste experimento, eles precisam ser configurados em ambos os instrumentos separadamente.

4. Operação de rede molecular

  1. Preparação de dados: Exporte dados espectrais de massa brutos 2D-HPLC-MS e converta dados espectrais de massa secundários em dados mzXML ou mzML por meio do Msconvert do ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
  2. Para fazer upload de dados, baixe o software WinSCP no site oficial e faça upload dos dados mzML para a conta criada pelo GNPS via protocolo FTP. Quando a instalação estiver concluída, inicie o WinSCP.
  3. Conecte-se ao servidor FTP GNPS: Na interface WinSCP, na página Configuração da sessão , preencha as seguintes informações de conexão: Protocolo de arquivo: Selecione FTP. Para Nome do host: Insira massive.ucsd.edu., para número da porta: Mantenha o padrão 22.
  4. Digite o número da conta e a senha. Depois de preencher as informações acima, clique no botão Login para estabelecer uma conexão com o servidor FTP GNPS.
  5. Crie redes moleculares abrindo um navegador da Web e visitando o site do GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). Novos usuários precisam se inscrever em uma conta e fazer login.
  6. Na interface principal do site do GNPS, clique na guia Tarefas na barra de navegação superior e selecione Criar uma nova tarefa no menu suspenso. Na página de criação de tarefas, clique no botão Adicionar Arquivos e selecione e carregue o arquivo de dados. (por exemplo, formato mzML).
  7. Na guia Parâmetros da Tarefa, defina os vários parâmetros que geram o MN. Esses parâmetros incluem algoritmo de extração de pico, valor de sobrecurso de pico, método de cálculo de similaridade, etc. Faça as configurações de parâmetro apropriadas conforme necessário. Clique no botão Iniciar Análise na parte inferior da página para executar a tarefa.
  8. Depois que a tarefa for executada, localize a tarefa criada na lista de tarefas e clique no Nome do Serviço para exibir os resultados da análise. O site fornece diagramas MN, substitutos, redes simbióticas e outras informações relacionadas.

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Resultados

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O APB foi utilizado como organismo modelo para validar a viabilidade da tecnologia 2D-HPLC-MS em conjunto com o método MN. Ao importar os dados brutos do MS para o MN com os parâmetros definidos como padrão, um MN foi gerado. MN é uma estratégia computacional visual que visualiza todos os íons moleculares detectados em um experimento completo de LC-MS-MS e as relações químicas entre esses íons moleculares13.

MN é baseado nos fragmentos secundários do espectro de massa f...

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Discussão

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O foco principal deste experimento foi a otimização de um método parcial dentro da estrutura de separação bidimensional de fases líquidas. Para conseguir isso, um novo modulador de diluição na coluna foi perfeitamente integrado ao sistema de cromatografia líquida bidimensional (2D-LC). Esse ajuste técnico foi de suma importância, pois elevou significativamente a proficiência no perfil dos constituintes químicos presentes na medicina tibetana conhecida como APB. A incorporação da tecnologia 2D-HPLC-MS permitiu o exame abr...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130113), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82204765), Fundação de Ciências da Natureza de Sichuan (2022NSFSC1470), Projeto de Financiamento Especial de Pós-Doutorado da Província de Sichuan (TB2023020) e o Programa de Promoção de Pesquisa de Acadêmicos Xinglin da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (BSH2021030). Esses fundos fornecem suporte em termos de equipamentos experimentais, materiais experimentais e taxas de publicação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonitrilaFisher químicaF22M81203Fase móvel
Aconitum pendulum//Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC Agilent TechnologiesG2198-90001Cromatografia líquida
Seringas descartáveisChengdu Keen equipamento experimental/
tubo EPChengdu Keen equipamento experimental/3 ml
Frasco de injeção em fase líquidaChengdu Keen experimental equipment/1,5 ml
LTQ XL Espectrômetro de massaThermo FisherLTQ21991Espectrômetro de Massa
Membranas microporosas Chengdu Keen equipamento experimental/0.22μ m
Ultimate XB-C18,5 μ m,2.1 x 200 mmWelch00201-31015
Aspirador ultrassônicoGT SonicUGT20DEC048YLimpador ultrassônico 240W 40KHz
XAmide,3 μ m, 100ADalian Mondi TechnologyD2019110601coluna hidrofílica
de 1 ml de coluna de fase reversa

Referências

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  1. Luo, H., et al. Correlation between Tibetan and traditional Chinese medicine body constitutions: A cross-sectional study of Tibetan college students in the Tibet Autonomous Region. J Tradl Chinese Med Sci. 5 (3), 215-221 (2018).
  2. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in Tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. J Vis Exp. (193), 65054(2023).
  3. Kumar, P. R., Dinesh, S. R., Rini, R. LCMS-a review and a recent update. J Pharm Pharm Sci. 5, 377-391 (2016).
  4. Yan, P., et al. Strategy for the identification and quantitative analysis of the phytochemicals of traditional Chinese medicine by LC-MS/MS. Acta Pharm Sinica. 55 (7), 1494-1503 (2020).
  5. Iguiniz, M., Heinisch, S. Two-dimensional liquid chromatography in pharmaceutical analysis. Instrumental aspects, trends and applications. J Pharma Biomed Anal. 145, 482-503 (2017).
  6. Ye, C. X., et al. Application progress of 2D-LC in analysis and quality control of traditional Chinese medicine. Chem Reag. 44 (8), 1103-1110 (2022).
  7. Cao, J. L., et al. Online comprehensive two-dimensional hydrophilic interaction chromatography x reversed-phase liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry for the analysis of phenolic acids in Salvia miltiorrhiza. J Chromatogr A. 1536, 216-227 (2018).
  8. Cao, J. L., et al. Qualitative and quantitative characterization of phenolic and diterpenoid constituents in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with hybrid linear ion trap Orbitrap mass. J Chromatogr. 1427, 79-89 (2016).
  9. Wang, J., Ren, X., Wen, C., Xu, Y., Chen, Y. Separation and characterization of unknown impurities in rutin tablets using trap-free two-dimensional liquid chromatography coupled with ion trap/time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (10), e8739(2020).
  10. Ma, L. J., Ma, N., Cao, J. L., Wan, J. B. Characterizing the influence of different drying methods on chemical components of Panax notoginseng leaves by heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled to orbitrap high-resolution mass spectrometry. Food Chem. 369, 130965(2022).
  11. Wong, Y. F., et al. Untargeted profiling of Glycyrrhiza glabra extract with comprehensive two-dimensional liquid chromatography-mass spectrometry using multi-segmented shift gradients in the second dimension: Expanding the metabolic coverage. Electrophoresis. 39 (15), 1993-2000 (2018).
  12. Cao, J. L., et al. Comprehensively qualitative and quantitative analysis of ginsenosides in Panax notoginseng leaves by online two-dimensional liquid chromatography coupled to hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry with deeply optimized dilution and modulation system. Anal Chim Acta. 1079, 237-251 (2019).
  13. Nothias, L. F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nat methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  14. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: an efficient approach for natural products Dereplication. Molecules. 28 (1), 157(2023).
  15. Qu, B., et al. Combining multidimensional chromatography-mass spectrometry and feature-based molecular networking methods for the systematic characterization of compounds in the supercritical fluid extract of Tripterygium wilfordii Hook F. Analyst. 148 (1), 61-73 (2023).
  16. Li, W., et al. An enhanced analytical strategy integrating offline two-dimensional liquid chromatography with high-resolution accurate mass spectrometry and molecular networking: Comprehensive characterization of HuangLian JieDu Decoction as a case study. J Sep Sci. 45 (14), 2734-2745 (2022).
  17. Dai, Y., et al. Comprehensive profiling of Sanguisorba officinalis using offline two-dimensional mixed-mode liquid chromatography × reversed-phase liquid chromatography, tandem high-resolution mass spectrometry, and molecular network. J Sep Sci. 45 (10), 1727-1736 (2022).
  18. Chen, Y., Montero, L., Luo, J., Li, J., Schmitz, O. J. Application of the new at-column dilution (ACD) modulator for the two-dimensional RP× HILIC analysis of Buddleja davidii. Anal Bioanal Chem. 412 (7), 1483-1495 (2020).
  19. Zhou, Y. P. Pharmacological action and toxicity of Aconite and its main components. Acta Pharm Sinica. (05), 394-400 (1983).
  20. Shao, X., Liu, F. Progress in the role of 14-Benzoylaconine in rheumatoid arthritis. Chinese J Pharmacol Toxicol. 33 (10), 917(2019).
  21. Hao, W. J. Study on the chemical constituents of the alkaloids from the root of Aconitum flavum HandMazz and its anti-tumor activities. , Ningxia Medical University. (2015).
  22. Han, X., Hou, Y. J. Research progress on the pharmacological effects and toxicity of Aconitine. J China Prescrip Drug. 12 (12), 149-150 (2014).

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