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Artigo de método

Criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas

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DOI:

10.3791/66259

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22 de dezembro de 2023

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1Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), 2Agriculture and Rural Bureau of Changqing District

Neste artigo

Resumo

Um procedimento simples para a criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas é descrito. Apenas uma cepa de Wolbachia foi detectada em cada ínstar de D. antiqua axênica por PCR.

Resumo

Os insetos axênicos são obtidos a partir de sistemas de criação artificial estéreis usando meios estéreis. Esses insetos, caracterizados por seu pequeno tamanho, ciclo de crescimento curto e baixa exigência alimentar, são ideais para estudar a relação entre microrganismos e hospedeiros. A microbiota intestinal influencia significativamente as características fisiológicas dos insetos hospedeiros, e a introdução de cepas específicas em insetos axênicos fornece um método para verificar as funções microbianas intestinais. Delia antiqua, uma praga ameaçadora da ordem Diptera, família Anthomyiidae e gênero Delia, alimenta-se principalmente de cebola, alho, alho-poró e outros vegetais da família Liliaceae. Suas larvas se alimentam dos bulbos, causando apodrecimento, murcha e até morte de plantas inteiras. Através da criação de larvas axênicas, estudos de seguimento podem ser realizados para observar os efeitos da microflora intestinal sobre o crescimento e desenvolvimento de D. antiqua. Ao contrário do método que envolve a eliminação antibiótica de micróbios associados, este artigo apresenta uma abordagem de baixo custo e alta eficiência para a elevação de D. antiqua axênica. Após a esterilização superficial dos ovos de D. antiqua , dietas estéreis semifermentadas foram utilizadas para criar larvas, e o estado axênico de D. antiqua foi verificado através de ensaios dependentes e independentes de cultura. Conclui-se que a combinação da esterilização de ovos de insetos e o preparo de dietas estéreis para cultivo de larvas possibilitou o desenvolvimento de um método eficiente e simples para obtenção de D. antiqua axênica. Este método fornece uma abordagem poderosa para estudar interações inseto-microflora.

Introdução

Animais axênicos, definidos como animais nos quais não é possível detectar microrganismos ou parasitas viáveis, são modelos experimentais valiosos para o estudo das interações hospedeiro-microrganismo1,2. Os insetos, o maior grupo de invertebrados, podem formar relações simbióticas com microrganismos3. Insetos axênicos podem ser usados para estudar interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos4. Por exemplo, Nishide et al.5 estabeleceram um procedimento prático de criação estéril para o verme de mau odor Plautia stali, permitindo uma análise confiável e rigorosa das interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos modelo. Insetos axênicos podem ser produzidos esterilizando-se a fase de ovo e fornecendo alimento estéril às larvas e adultos 6,7. Insetos axênicos são de grande importância e são amplamente utilizados em pesquisas biológicas. Por exemplo, um estudo conduzido por Somerville et al.8 demonstrou que mariposas diamondback inoculadas com Enterobacter cloacae melhoraram a adaptabilidade de machos transgênicos.

Delia antiqua Meigen é uma praga economicamente importante da cebola e de outras culturas Liliaceae em todo o mundo, com suas larvas danificando os bulbos da cebola e de outras culturas de Liliaceae9. D. antiqua é encontrada principalmente em climas temperados e é amplamente difundida em áreas de cultivo de cebola das Américas, Europa e Ásia. Se não controlada adequadamente, pode causar perdas de cultura em cebola (Allium cepa L.), alho (Allium sativum L.), chalotas (Allium fistulosum L.) e alho-poró (Alliumchoenoprasum L.) variando de 50% a 100%10,11. As larvas se alimentam das partes abaixo do solo das plantas, e essa alimentação faz com que as mudas murchem e, eventualmente, morram. Além disso, plantas danificadas podem permitir a entrada de patógenos, levando ao apodrecimento do bulbo12. Mesmo que as plantas não sejam completamente consumidas pelas larvas, os danos que elas causam tornam as plantas de cebola incomercializáveis e resultam em perdas econômicas.

Os insetos estão intimamente associados à microbiota intestinal, e a maioria dos intestinos de insetos contém uma variedade de bactérias simbióticas que prosperam com os nutrientes fornecidos pelo hospedeiro13,14. Jing et al.15 mostraram que a função primária da comunidade simbiótica intestinal é fornecer nutrientes essenciais, seguida de funções relacionadas à digestão e desintoxicação. Em certos casos, as bactérias intestinais podem servir como um recurso microbiano para fins de manejo de pragas. Consequentemente, estudar o desempenho das bactérias intestinais individuais e funções específicas dentro do corpo de D. antiqua é desejável. Portanto, o preparo de larvas axênicas é particularmente importante para o estudo das interações entre cepas bacterianas específicas e insetos16. Atualmente, um método comumente utilizado para eliminar bactérias intestinais de insetos é o uso de uma combinação de antibióticos para erradicar micróbios associados 17,18,19. Ao contrário do uso isolado de antibióticos, que só podem reduzir o número microbiano, a criação axênica de insetos permite o controle sobre a composição e a quantidade de microrganismos, permitindo uma validação mais precisa da funcionalidade da microbiota intestinal.

Assim, este artigo apresenta um protocolo para o preparo e criação de D. antiqua axênico. O alimento axênico para larvas é obtido utilizando a esterilização a alta temperatura de dietas naturais combinadas com alimentos semifermentados. Os ovos são esterilizados seguindo um protocolo experimental para obtenção de ovos axênicos e, finalmente, larvas axênicas são cultivadas a partir dos ovos axênicos. O sistema de criação axênico foi realizado por apenas uma geração para o experimento. Isso proporcionará conveniência para estudar a interação entre insetos e microbiota intestinal.

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Protocolo

D. antiqua são obtidos do campo de Fanzhen, Taian.

1. Preparação de dietas estéreis

  1. Descasque as camadas externas das cebolinhas e descarte as folhas verdes. Manter a parte branca das cebolinhas (Figura 1A) e lavá-las com água estéril, repetindo o processo de enxágue três vezes. Cortar a parte branca das cebolinhas em pedaços cortados em cubos de 1-2 cm utilizando uma tesoura (ver Tabela de Materiais) esterilizada com solução de EtOH a 75 % (mencionada no passo 2.5) para utilização posterior.
  2. Pese 50 g das cebolinhas cortadas em cubos e coloque-as num processador de alimentos (ver Tabela de Materiais). Adicione 50 mL de água esterilizada e triture cinco vezes por 2 min cada. Todas as cebolinhas cortadas em cubos devem ser trituradas em uma consistência pastosa (Figura 2A).
  3. Use pinças para transferir 10 peças de larvas de3º ínstar de D. antiqua para um tubo centrífugo de 10 mL contendo 10 mL de 1x PBS, e triture-as com um pilão de moagem descartável (ver Tabela de Materiais) por cerca de 5 min para obter um líquido de moagem de larvas.
  4. Deite o líquido pastoso de cebolinha e o líquido de moagem de larvas num balão cónico limpo de 500 ml (ver Tabela de Materiais). Embrulhar a boca do balão cónico com duas camadas de película de vedação transparente e, em seguida, colocar o balão numa incubadora de agitação (ver Tabela de Materiais) para fermentação a 25 °C e 180 rpm durante 12 h (Figura 2B).
  5. Recorte sete camadas de gaze quadrada com laterais de 10 cm (sem necessidade de esterilidade) com tesouras e empilha-as juntas para formar um dispositivo de filtro simples. Despeje lentamente o líquido de cebolinha fermentado sobre a gaze e esprema o líquido filtrado em um novo balão cônico de 500 mL. Embrulhe o resíduo de cebolinha restante na gaze em papel alumínio para uso posterior.
  6. Filtrar o filtrado obtido na etapa anterior usando uma bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais) e um funil de Buchner. Coloque o papel de filtro molhado por água deionizada no funil de Buchner e, em seguida, despeje o filtrado e execute a filtração por sucção por três vezes com papel de filtro diferente. Recolher o filtrado final no balão cónico de 500 ml.
  7. Execute outra filtragem usando um frasco de filtro de 0,22 μM e uma bomba de vácuo. Rosqueie a tampa do frasco do filtro de sucção em uma bancada ultralimpa (consulte a Tabela de Materiais) para uso posterior. Nesse ponto, obtém-se o resíduo de cebolinha fermentada e o filtrado (Figura 2C).
    OBS: O líquido filtrado obtido nesta etapa será estéril. (O frasco de filtro de 0,22 μM é um sistema de filtração a vácuo estéril para esterilizar o filtrado).
  8. Repita os passos anteriores para obter resíduo de cebolinha não fermentado e filtrado. Aqui a diferença é que a fermentação não é necessária.
  9. Pesar 0,24 g de cloreto de colina e 0,56 g de ácido L-ascórbico (ver Tabela de Materiais) num tubo de centrífuga de 10 ml. Adicione 3 mL de água deionizada e agite vigorosamente até que estejam completamente dissolvidos. Na bancada ultralimpa, use uma nova seringa de 5 mL e conecte três filtros de seringa de 0,22 μM (ver Tabela de Materiais) para esterilizar a solução e coloque-a em um tubo centrífugo estéril de 10 mL para uso posterior.
    NOTA: O cloreto de colina é um neurotransmissor essencial para o crescimento de insetos, enquanto o ácido L-ascórbico atua como conservante.
  10. Pesar 2 g de ágar pó e 6 g de TSB (ver Tabela de Materiais) e deitá-los num balão cónico de 500 ml. Em seguida, adicione 100 mL de água deionizada para preparar o meio de cultura. Depois de enxaguar a haste de vidro com água deionizada, use-a para mexer a mistura até que esteja bem misturada. Em seguida, selar o frasco cônico com duas camadas de filme selante transparente.
  11. Embrulhar as cebolinhas fermentadas e as cebolinhas não fermentadas (mencionadas nas etapas 1.5 e 1.8) em papel alumínio e esterilizá-las, juntamente com o meio de cultura, em autoclave a 121 °C por 20 min.
  12. Na bancada ultralimpa, despeje o cloreto de colina esterilizado, o ácido L-ascórbico e o filtrado estéril no meio de cultura, girando suavemente para misturá-los completamente. Finalmente, adicione as cebolinhas fermentadas e não fermentadas e agite vigorosamente à mão para obter as dietas estéreis. Despeje as dietas nos tubos de centrífuga de 50 mL (estéril; tampa de ventilação com membrana hidrofóbica de PVDF de 0,22 μM) (ver Tabela de Materiais) em um ângulo (Figura 2D).
    NOTA: Após a esterilização, a temperatura do meio de cultura deve ser mantida entre 65-80 °C para evitar rápido resfriamento e solidificação ao adicionar cebolinha ou outros ingredientes. Além disso, em cada tubo, despeje aproximadamente 10-15 mL de dietas. Uma vez que as dietas tenham solidificado, guarde os tubos em uma geladeira a 4 °C, se não for usado imediatamente.

2. Aquisição de ovos axênicos

  1. Sistema de criação laboratorial para D. antiqua
    1. Coloque uma gaiola de criação em uma incubadora iluminada internamente por LED a 25 °C (24 h por ciclo, a proporção de claro para escuro é de 16:8) para criar adultos machos e fêmeas, permitindo que eles acasalem e coloquem ovos. Encha o bebedouro (Figura 1B) com água e sele com algodão umedecido para fornecer água para os adultos.
    2. Coloque quatro fundos de placa de Petri de 35 mm x 12 mm em uma tampa de placa de Petri de 94 mm x 16 mm. Molhe o algodão com água ionizada e, em seguida, coloque algodão úmido em dois dos fundos da placa de Petri e, em cima do algodão, adicione uma colher de sopa de sacarose.
    3. Encha os outros dois fundos de placa de Petri com duas colheres de sopa de sacarose e extrato de levedura (ver Tabela de Materiais), que servem de alimento para os insetos adultos (Figura 1C).
      NOTA: A sacarose e o extracto de levedura mencionados nos passos 2.1.2 e 2.1.3 não necessitam de ser esterilizados.
    4. Coloque um fundo de placa de Petri de 94 mm x 16 mm contendo areia umedecida e um pedaço de dente de alho descascado e sem raízes (Figura 1D) dentro da gaiola de mosca para coletar ovos. A fêmea será atraída pelo cheiro do alho e colocará ovos ao seu redor.
  2. Coleta de ovos
    1. Retire da gaiola o dispositivo de oviposição, que é uma placa de Petri de 94 mm x 16 mm contendo areia e alho acima mencionados (passo 2.14). Despeje a areia junto com o alho em um copo de 500 mL e use água da torneira para lavar os ovos restantes do alho no copo. Neste ponto, os ovos estão flutuando na água.
    2. Pegue uma peneira de 100 malhas (consulte Tabela de Materiais) e umedeça com água da torneira. Em seguida, despeje a água contendo os ovos flutuantes do copo na peneira. Os ovos permanecerão na peneira.
    3. Depois que os ovos secarem naturalmente na peneira, use um pincel para varrer suavemente os ovos em uma placa de Petri.
  3. No primeiro dia, lave o dispositivo de oviposição para coletar os ovos sem desinfecção ou esterilização. No segundo dia, às quatro horas da tarde, lave os ovos novamente e colete-os peneirando-os com água limpa.
    NOTA: A coleta dos ovos no segundo dia é para garantir uma taxa de crescimento consistente nas etapas subsequentes. Quatro horas da tarde é o pico de oviposição para D. antiqua. Assim, o ideal é coletar os ovos neste momento.
  4. Coloque os ovos coletados em uma peneira de células estéreis (ver Tabela de Materiais) na bancada ultralimpa (Figura 3A).
  5. Preparar a solução para esterilização de ovos
    1. Tomar 5 ml de NaClO a 5,2% (ver Tabela de Materiais) e transferi-lo para um balão cónico esterilizado de 250 ml. Adicionar 95 mL de água esterilizada para obter um volume total de 100 mL, resultando em uma solução de NaClO a 0,26%.
    2. Para preparar uma solução de EtOH a 75%, tomar 75 ml de EtOH a 99,7 % e transferi-lo para um balão cónico esterilizado de 250 ml. Adicionar 25 mL de água esterilizada para obter um volume total de 100 mL, resultando em uma solução de EtOH a 75%.
  6. Despeje 30 mL de NaClO em uma placa de Petri e despeje 30 mL de EtOH em outra placa de Petri. Introduzir a peneira celular que contém os ovos mencionados no passo 2.4 no prato que contém NaClO. Mergulhe na solução de NaClO a 0,26% por 0,5 min. Em seguida, transfira a peneira para a placa contendo EtOH, deixando de molho na solução de EtOH 75% por mais 0,5 min.
  7. Repetir esse processo três vezes, alternando entre NaClO 0,26% e EtOH 75% a cada 0,5 min. Em seguida, ovos axênicos serão obtidos. Neste ponto, a peneira contendo os ovos deve ser submersa em EtOH.
    NOTA: Para garantir a esterilização completa, use uma pipeta de 1 mL para aspirar NaClO e EtOH e dispersar os ovos. Repita o processo de enxágue várias vezes. Esta etapa irá limpar ainda mais a superfície dos ovos de bactérias residuais e impurezas, garantindo uma superfície limpa e estéril.

3. Criação de larvas axênicas

  1. Para transferir os ovos esterilizados, use uma tesoura que foi esterilizada com uma lâmpada de álcool para cortar a ponta final de uma pipeta de 1 mL (Figura 3B). Certifique-se de que a abertura final da pipeta cortada é maior do que o diâmetro dos ovos (cerca de 2 mm). Em seguida, utilizar a pipeta para transferir os ovos da solução de EtOH (ovos juntamente com a solução) (Figura 3C) para um tubo centrífugo contendo as dietas estéreis, e cada tubo deve conter aproximadamente 20-50 ovos (Figura 3D). Repita este processo até que todos os ovos tenham sido transferidos.
    NOTA: O diâmetro da ponta da pipeta deve ser o maior possível para evitar a quebra dos ovos durante a transferência, o que pode levar à sua morte.
  2. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de etanol do tubo. Coloque o tubo da centrífuga fechado com tampas dentro de um saco auto-selante e coloque um pedaço de algodão na abertura do saco para permitir a circulação de ar. Finalmente, coloque o saco dentro de uma incubadora a 25 °C (umidade relativa: 50%-70%; fotoperíodo: 16 h claro: 8 h escuro) para observação e cultivo.
  3. Cerca de três dias depois, os ovos axênicos das dietas começam a eclodir (Figura 4A). As larvas eclodidas estarão ativas e a superfície das dietas estéreis não será mais lisa. As larvas começarão a se alimentar com as dietas.
  4. Continue a observar as larvas até que atinjam o estágio de larvas de2º ínstar. Continue acompanhando seu crescimento e desenvolvimento durante esse período.
  5. Após 9-12 dias, mais de 80% dos ovos evoluíram para larvas de3º ínstar (Figura 4B). Isso indica sucesso no crescimento e desenvolvimento das larvas.

4. Validação de larvas axênicas com ensaios cultura-dependente

  1. Selecionar aleatoriamente três larvas axênicas de3º ínstar do tubo da centrífuga.
  2. Coloque as larvas em uma placa de Petri de 94 mm x 16 mm contendo álcool 75% para limpeza. Depois disso, transfira-os para um recipiente com água estéril para posterior enxágue.
  3. Use uma pinça dissecante desinfetada que tenha sido esterilizada com solução de EtOH a 75% para agarrar as larvas (a cabeça e a cauda são mostradas na Figura 5A). Utilizar tesoura dissecante para remover as extremidades da cabeça e cauda (Figura 5B). Segure a cauda das larvas com a pinça e use outra pinça para apertar suavemente da cauda até a cabeça e extrair os órgãos internos (resultado mostrado na Figura 5C). Coloque os órgãos internos em água deionizada e puxe suavemente o intestino pressionando o tecido adiposo com pinças, e coloque o interno extraído (Figura 5D) em água estéril para uso posterior.
  4. Coloque o intestino em um tubo centrífugo estéril de 1,5 mL, adicione 500 μL de tampão 1x PBS esterilizado e use um pilão descartável para triturar o tecido intestinal em um homogeneizado.
  5. Tome 100 μL do homogeneizado e adicione-o a um meio de ágar nutriente. Use um espalhador em forma de L (consulte a Tabela de Materiais) para esticar a placa de ágar.
  6. Colocar a placa de Petri em incubadora bioquímica a 28 °C e incubar por 72 h para observar o crescimento das colônias.

5. Validação de larvas axênicas com ensaios independentes de cultura

  1. Extrair ADN total do tecido intestinal de larvas axénicas utilizando um kit de extracção de ADN (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
  2. Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro UV.
  3. Realizar reação de PCR usando primers bacterianos universais 16S rRNA (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). O volume total da reação é de 25 μL, e consiste em 1 μL de molde de DNA, 0,5 μL de primer para frente, 0,5 μL de primer reverso, 10,5 μL ddH2O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (ver Tabela de Materiais). Definir as condições da reação de PCR da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 °C por 3 min; 35 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 90 s; extensão final a 72 °C por 10 min. Conservar os produtos de PCR a 4 °C para análise posterior.
  4. Realizar reação de PCR utilizando iniciadores universais de ITS fúngicos (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). O volume total da reação é de 25 μL, e consiste de 1 μL de molde de DNA, 0,5 μL de primer para frente, 0,5 μL de primer reverso, 10,5 μL ddH2O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Definir as condições de PCR em 95 °C por 5 min; 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 1 min e 72 °C por 90 s; seguido de 72 °C por 10 min. Conservar os produtos de PCR a 4 °C para análise posterior.
  5. Use o corante de ácido nucleico Super Green (consulte a Tabela de Materiais) para misturar com cada um dos dois tipos de produtos de PCR uniformemente e analisá-los por eletroforese em um gel de agarose a 1% em tampão TAE 1x (diluído a partir de 50x TAE, consulte Tabela de Materiais). Use 3 μL de marcador de DNA (ver Tabela de Materiais) como referência.
  6. Use um transiluminador UV para observar o gel e localizar o fragmento alvo.

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Resultados

Os estágios de vida de D. antiqua estão representados na Figura 4. O ciclo de vida completo compreende ovos, larvas, pupas (Figura 4C) e adultos (Figura 4D). São cultivados em tubos centrífugos estéreis, e sua aparência e taxa de sobrevivência são indistinguíveis de D. antiqua criadas sob condições não-axênicas. Os tempos de crescimento e desenvolvimento para cada estágio de D. antiqua podem ser encontrado...

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Discussão

Os insetos possuem uma microbiota intestinal altamente complexa20,21, sendo necessário o uso de insetos axênicos inoculados com cepas microbianas intestinais específicas para o estudo das interações inseto-microrganismo. A preparação de insetos axênicos é crucial para tais esforços de pesquisa. O tratamento com antibióticos é um método usado para eliminar a microbiota intestinal. Por exemplo, Jung e Kim22 alimentaram Spodoptera exigua<...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32272530), pelo Projeto Novas Vinte Políticas para a Universidade em Jinan (2021GXRC040), Grandes Projetos de Inovação Científica e Tecnológica na Província de Shandong (2021TZXD002) e pelo Projeto de Integração de Ciência e Educação da Universidade de Tecnologia Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 μ Garrafa de filtroM Thermo Scientific450-0045
0.22 μ Filtro de seringa MBiosharpBS-QT-011
Peneira de 100 meshZhejiang Shangyu Jinding Peneira padrãoFábrica Não Números
de catálogo 1x solução PBSSolarbioP1020
2x Taq PCR Master MixGENVIEWGR1113-1ML
5,2% NaClO soluçãoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
Frasco cônico de 500 mLThermo Scientific4103-0500
Tubo de centrífuga ventilado de 50 mLJET BIOFILBRT-011-050
Tampão TAE 50xGENVIEWGT1307
Pó de ágarDing GuoDH010-1.1
Incubadora bioquímicaSTIK21040121500010
Peneira de célulasSAINING5022200
Cloreto de colinaSangon BiotechA600299-0100
ddH2ODing GuoPER018-2
Pilão de moagem descartávelJET BIOFILCSP-003-002
Kit de extração de DNASangon BiotechB518221-0050
Marcador de DNASangon BiotechB600335-0250
Reagente químico absoluto Co. de Sinopharmálcool etílico
Papel de filtroNEWSTAR1087309025
Processador de alimentosGuangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.
Incubadora iluminadaShanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.
Ácido L-AscórbicoSangon BiotechA610021-0100
SAINING6040000
Meio de ágar nutrienteTesoura Hope BioHB0109
Bing Yu  BY-103Compra na
incubadora de choqueJingdong Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.
SacaroseGENVIEWCS326-500G
Super Verde corante de ácido nucleicoBiosharpBS355A
Mesa super-limpaHeal ForceAC130052
TSBHope BioHB4114
Bomba de vácuoZhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.
Extrato de leveduraThermo ScientificLP0021B
80010428 do, Ltd.10009218WBL25B26A16110768 Espalhador em forma de L 202000001422051031

Referências

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