Artigo de método

Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

DOI:

10.3791/66262

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19 de julho de 2024

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1Department of Anesthesiology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, 2Key Laboratory of Anesthesiology (Shanghai Jiaotong University), Ministry of Education, 3Department of Anesthesiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Resumo

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A injeção estereotáxica de uma região específica do cérebro constitui uma técnica experimental fundamental na neurociência básica. Os pesquisadores geralmente baseiam sua escolha de parâmetros de injeção estereotáxica em atlas cerebrais de camundongos ou materiais publicados que empregaram várias populações/idades de camundongos e diferentes equipamentos estereotáxicos, necessitando de validação adicional dos parâmetros de coordenadas estereotáxicas. A eficácia das manipulações de imagens de cálcio, quimiogenéticas e optogenéticas depende da expressão precisa de genes repórteres dentro da região de interesse, muitas vezes exigindo várias semanas de esforço. Assim, é uma tarefa demorada se as coordenadas da região alvo do cérebro não forem verificadas com antecedência. Usando um corante apropriado em vez de um vírus e implementando a criossecção, os pesquisadores podem observar o local da injeção imediatamente após a administração do corante. Isso facilita ajustes oportunos para coordenar os parâmetros nos casos em que existem discrepâncias entre o local real da injeção e a posição teórica. Tais ajustes aumentam significativamente a precisão da expressão viral dentro da região-alvo em experimentos subsequentes.

Introdução

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Quase todas as ferramentas modernas de neuromodulação, incluindo registro de cálcio in vivo, ferramentas optogenéticas e quimiogenéticas, requerem o uso de coordenadas estereotáxicas para atingir a área de interesse do cérebro 1,2,3, formando a base da manipulação neural. As coordenadas estereotáxicas para as regiões do cérebro de camundongos são definidas em relação ao bregma e lambda, os marcos ósseos no crânio, formando o chamado sistema de coordenadas estereotáxicas derivado do crânio. Bregma ou lambda podem servir como o ponto zero das coordenadas tridimensionais. Os três eixos são ântero-posterior (AP), mediolateral (ML) e dorsoventral (DV), representando os eixos y, x e z no display digital de instrumentos estereotáxicos. Para regiões cerebrais bem conhecidas, os parâmetros de coordenadas estereotáxicas de uma área específica podem ser obtidos a partir de atlas cerebrais de camundongos4 (por exemplo, cérebro de camundongo de Paxinos e Franklin em coordenadas estereotáxicas) e / ou da literatura publicada 5,6. No entanto, uma validação adicional é necessária devido a variações no equipamento estereotáxico e na idade/populações de camundongos usados por diferentes pesquisadores.

A estrutura é a base da função. Os circuitos neurais formam a base para muitas funções cerebrais, como atividades cognitivas, emoções, memória, funções sensoriais e motoras1. Rotular a estrutura e manipular a atividade dos circuitos neurais são vitais para entender a função de um circuito neural específico. Nas últimas décadas, os traçadores neurais evoluíram ao longo de muitas gerações; pesquisas iniciais adotaram aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e aglutinina phaseolus vulgaris (PHA) como traçadores anterógrados, e fluoroouro (FG), subunidade B da toxina da cólera (CTB), carbocianina como traçadores retrógrados. No entanto, ao contrário dos marcadores virais, esses traçadores neurais tradicionais não podem integrar genes exógenos ao hospedeiro, nem têm seletividade de tipo de célula. Atualmente, a estratégia viral tornou-se uma proposta importante durante a pesquisa básica em neurociência. Para diferentes fins de pesquisa, várias ferramentas virais podem ser selecionadas 7,8. Existem vírus não transsinápticos, vírus transmultissinápticos (retrógrados e anterógrados) e vírus transmonossinápticos (retrógrados e anterógrados). Cada categoria contém vários tipos com as respectivas características.

O processo de administração e expressão viral é altamente demorado e intensivo em recursos, muitas vezes levando semanas ou até mais. Dentre os vários vetores virais, o vírus adeno-associado tem sido identificado como um meio promissor para a entrega de genes, proporcionando uma ampla janela que varia de 3 a 8 semanas pós-injeção para o procedimento experimental 7,8. À medida que a VAA evolui, a análise pode ser realizada 2-3 semanas após a administração 9,10. Outros traçadores de circuitos neurais, como o vírus da pseudo-raiva (PRV) e o vírus da raiva (RV), também requerem um período de rastreamento de pelo menos 2-7 dias 11,12,13,14,15. Assim, uma verificação preliminar do local da injeção antes de observar os sinais de fluorescência é eficaz em termos de tempo e custo.

Para facilitar uma verificação simples e rápida das injeções estereotáxicas, neste estudo, um corante é administrado antes dos vetores virais, e a criossecção permite que os pesquisadores observem o local da injeção e o rastreiem dentro de 30 minutos após a injeção.

Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) e o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai. Camundongos machos C57BL/6J com oito semanas de idade foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados em gaiolas padrão (22 °C ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, alimentação e água ad libitum).

1. Seleção de regiões-alvo do cérebro

NOTA: Este é um procedimento estéril. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos estejam esterilizados. Pulverize as luvas com álcool antes do contato com instrumentos cirúrgicos. Evite tocar na ponta dos instrumentos ou na área cirúrgica com luvas. Certifique-se de que o mouse esteja adequadamente anestesiado antes de iniciar o procedimento, verificando a perda dos reflexos de endireitamento e nenhuma resposta à estimulação cutânea. Antes da perfuração e injeção, monitore de perto a frequência respiratória (60-220 respirações por minuto, média de 100-150 respirações por minuto) e a amplitude respiratória (deve ser consistente e não excessivamente superficial ou profunda). Quaisquer alterações significativas na frequência ou amplitude respiratória devem ser observadas.

  1. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (250 mg / kg) usando uma agulha de 29 G. Raspe o cabelo do crânio assim que o reflexo de endireitamento desaparecer. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais) fixando os incisivos superiores com uma pinça nasal e estabilizando a cabeça usando duas barras auriculares.
  2. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos. Desinfete o couro cabeludo esfregando-o três vezes com Anerdian (solução desinfetante; consulte a Tabela de Materiais). Injete 0,2 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea usando uma agulha de insulina 29 G para fornecer analgesia local.
  3. Faça uma incisão de 0,5 cm usando uma tesoura de olho para expor o crânio. Utilize um cotonete embebido em 3% de H2O2 para esfregar o crânio exposto para remover o periósteo. Deixe o crânio secar.
  4. Fixe a broca no instrumento estereotáxico. Ajuste os botões dos braços estereotáxicos para posicionar a ponta da broca precisamente no bregma com a ajuda de uma lupa e registre o valor do eixo z usando o display digital LCD.
    1. Ajuste os botões e posicione a ponta da broca no lambda e registre o valor do eixo z. Ajuste o nariz clamp e as barras auriculares para aproximar dois valores z e repita as etapas acima até que a diferença entre os dois valores z seja inferior a 0.1 mm.
      NOTA: Os eixos x, y e z no display digital LCD correspondem a mediolateral (ML), anteroposterior (AP) e dorsoventral (DV), respectivamente. O bregma e o lambda podem ser considerados no mesmo plano horizontal, uma vez que a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,1 mm.
  5. Garanta o nivelamento esquerda-direita do cérebro. Ajuste as barras auriculares fixadas à armação estereotáxica com a mesma escala. Veja o núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral (LDTgV), por exemplo; suas coordenadas estereotáxicas são -5,2 para x, +0,8 para y, -4,0 para z, de acordo com o atlas do cérebro de camundongos de Paxinos e Franklin16.
    1. Ajuste a barra de orelha para fazer a broca em (-5,2, +0,8) para medir o valor z na direção dorsal-ventral e mova a broca para (-5,2, -0,8) para medir o valor z.
      NOTA: Considera-se que a esquerda-direita está no mesmo nível quando a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,2 mm. As barras auriculares precisam ser inseridas no lugar certo porque o conduto auditivo externo é simétrico. Se a diferença entre os dois valores z for superior a 0,5 mm, a barra auricular pode ser inserida no lugar errado.
  6. Posicione a broca no bregma novamente e defina três coordenadas no display digital LCD para zero. Posicione a broca acima da região de interesse usando coordenadas de referência. Comece a broca.
    1. Abaixe gradualmente a broca usando o braço vertical até que ela penetre no crânio. Limpe os detritos e o sangue usando cotonetes.
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral.

2. Preparação da solução de corante e microinjeção cerebral

  1. Pegue 25 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE contendo azul de bromofenol (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrífuga de 200 μL. Adicione 50 μL de ddH2O ao tubo para preparar a solução de corante.
  2. Cubra a janela craniana com um algodão umedecido com solução salina. Garanta a permeabilidade da microsseringa aspirando e expelindo solução salina repetidamente. Coloque 0,3 μL de corante na micro seringa. Conecte a seringa e o microinjetor estereotáxico motorizado ao braço estereotáxico.
  3. Posicione a ponta da seringa no bregma e defina as coordenadas para zero no display digital LCD. Ajuste a agulha na região de interesse de acordo com as coordenadas de referência. Defina a velocidade de injeção para 0,1 μL/min e inicie o microinjetor motorizado, fornecendo 0,3 μL de corante azul na região alvo. Deixe a seringa na posição por pelo menos 10 minutos antes de retirar lentamente o injetor.
    NOTA: Corantes de cores diferentes podem ser usados nos mesmos mouses para distinguir regiões próximas. Teste outros corantes para concentrações adequadas com base em suas propriedades físicas. Recomenda-se usar a fórmula azul de bromofenol e enxaguar bem a seringa antes e depois do uso para evitar bloqueios. Ajuste os volumes de injeção com base na difusão do corante.

3. Colheita de tecido cerebral e criossecção

  1. Solte o mouse do quadro estereotáxico. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg / kg de pentobarbital sódico usando uma agulha de 29 G. Prenda o mouse em uma placa de espuma com fita adesiva.
  2. Abra os dois lados do tórax para induzir asfixia rápida. Faça uma incisão de 1-2 mm no apêndice atrial direito. Insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Infundir 20 mL de solução salina pré-resfriada e 20 mL de solução gelada de paraformaldeído a 4%.
  3. Decapite o camundongo com uma tesoura de dissecação de tecidos (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Remova a pele fazendo uma incisão ao longo da linha média do pescoço ao nariz e, em seguida, exponha o crânio. Limpe o músculo residual do crânio com uma pinça ou tesoura.
  4. Posicione a ponta de uma lâmina da tesoura fina entre o forame magno e o cérebro, com a borda afiada voltada para o osso, na extremidade rostral da sutura sagital média. Prossiga para deslizar e cortar o crânio ao longo da sutura sagital média. Empregue fórceps para remover o crânio, revelando o cérebro exposto.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar causar danos ao cérebro durante a operação. Antes de remover as lascas ósseas, retire cuidadosamente quaisquer meninges que possam estar presas ao crânio. Essa precaução é crucial para evitar o corte inadvertido do tecido cerebral durante o processo.
  5. Ligue a alimentação do criostato de micrótomo rotativo (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste a temperatura da câmara para -20 °C. Despeje um pouco de composto OCT para cobrir a superfície do disco de amostra uniformemente. Coloque-o na câmara criogênica e deixe o OCT solidificar.
  6. Fixe o disco à cabeça da amostra. Aproxime a lâmina do bloco e apare o bloco OCT para fazer um plano plano paralelo ao disco.
  7. Corte o cérebro em uma direção coronal longe do local da injeção em um molde de fatia de cérebro por uma lâmina de barbear. Coloque o tecido cerebral que contém o local da injeção com o lado cortado voltado para baixo no plano plano da OCT.
    1. Despeje OCT no cérebro e coloque o disco na câmara criogênica, permitindo que o bloco de amostra se solidifique. Despeje OCT repetidamente no cérebro até que o cérebro esteja totalmente incorporado ao OCT.
      NOTA: Adicione o composto OCT camada por camada. Uma vez que a camada anterior de OCT esteja congelada, despeje a camada subsequente de composto de OCT no cérebro.
  8. Apare o bloco de amostra até que a região alvo se aproxime. Faça várias seções a partir do nível do local de injeção. Colete as fatias do cérebro coronal em uma placa de 6 poços contendo PBS em temperatura ambiente usando um pequeno pincel de escrita mantido a -20 ° C.
    NOTA: Defina a espessura de corte para uma maior para aparar o bloco e, em seguida, defina a espessura de corte para 40 μm à medida que a lâmina se aproxima do local de injeção. Se forem usados traçadores de circuitos neurais, os camundongos não serão sacrificados imediatamente. Coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação pós-operatória estéril sobre um cobertor de aquecimento para recuperação da anestesia. Retorne os ratos para a gaiola original ou para uma nova gaiola quando estiverem acordados.

4. Exames por imagem

  1. Lave a OCT com PBS em temperatura ambiente. Use um pincel para pegar seções do cérebro e colocá-las em um slide. Deixe as seções secarem ao ar livre em temperatura ambiente.
  2. Observe a região injetada visualmente ou use um microscópio quando os núcleos alvo forem minúsculos. Compare a localização do corante injetado com a região correspondente no atlas cerebral.
    NOTA: Ajuste os valores dos eixos x, y e z de acordo com a direção e a distância do desvio do ponto de injeção. Pode ser necessário repetir todas as etapas deste protocolo várias vezes para determinar as coordenadas com precisão.

Resultados

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Este estudo identificou com sucesso o local da injeção em 30 minutos usando o método demonstrado. Inicialmente, uma solução de carregamento de amostra SDS-PAGE contendo azul de bromofenol foi injetada no LDTgV nos camundongos C57 / BL. A Figura 1A mostra uma representação esquemática da injeção da solução de corante. A distribuição do corante azul no LDTgV é ilustrada na Figura 1B.

O azul de bromofenol também foi injetado no córtex pré-límbico do CPFm, córtex infralímbico do CPFm e amígdala basomedial (BMA) para avaliar a universalidade desse protocolo. Conforme mostrado na Figura 1C-E e na Figura 2A, o corante azul foi distribuído no córtex pré-límbico do CPFm, córtex infralímbico do CPFm e BMA.

Além disso, um vírus adeno-associado carregando uma proteína mCherry fluorescente foi injetado no LDTgV (as coordenadas foram verificadas usando a solução de corante). A expressão do vírus levou quatro semanas. A distribuição de neurônios mCherry+ no LDTgV é representada na Figura 2B.

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Figura 1: Injeção de solução de corante. (A) Um diagrama esquemático da injeção da solução de corante. (B) Distribuição do corante azul no LDTgV. (C) Distribuição do corante azul no córtex pré-límbico do mPFC. (D) Distribuição do corante azul no córtex infralímbico do mPFC. (E) Distribuição de corante azul no BMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Distribuição do corante azul e distribuição do mCherry vistos ao microscópio. (A) Distribuição do corante azul no córtex pré-límbico do mPFC (ampliação de 10x, barra de escala = 500 μm). (B) Imagem representativa da distribuição de mCherry na região LDTgV adquirida por microscopia fluorescente (ampliação de 10x, barra de escala = 500 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Este artigo descreveu uma estratégia estável para verificar a precisão das injeções cerebrais estereotáxicas 5,6 mais rápida e simplesmente antes do rastreamento viral, mas o aspecto insubstituível da expressão do gene repórter na região do cérebro é crucial para a rotulagem da região cerebral. O corante azul que usamos permitiu a visualização imediata do local da injeção.

Várias etapas críticas neste protocolo contribuem para melhorar a precisão do local da injeção. Em primeiro lugar, garantir o nivelamento esquerda-direita do cérebro no instrumento estereotáxico a partir da etapa 1.5; Esta etapa exige que os operadores estejam familiarizados com a anatomia do crânio, garantindo que as barras auriculares sejam colocadas na posição correta. As escalas nas barras auriculares e a estrutura estereotáxica também servem como referências. Em segundo lugar, encontrar o ponto zero exato, o bregma, na etapa 1.6 e na etapa 2.3. Ocasionalmente, uma discrepância significativa nas coordenadas encontradas nas etapas 1.6 e 2.3 é devido a uma diferença considerável no posicionamento do ponto zero. Isso pode resultar na incapacidade da agulha do microinjetor de penetrar na janela craniana. Nesses casos, é necessário reposicionar o ponto zero e, se necessário, uma nova janela craniana precisa ser criada. Apesar disso, ainda é essencial restabelecer o ponto zero e encontrar as coordenadas novamente na etapa 2.3; Não se pode inserir diretamente a micro-seringa da janela craniana feita anteriormente.

Em comparação com o corte de um cérebro não congelado em um molde de fatia de cérebro de camundongo, essa estratégia fornece um resultado mais preciso porque o bloco de amostra sólida evita que a lâmina aperte o cérebro e faça com que o corante seja deslocado dos pontos de injeção. Além disso, as seções cerebrais cortadas por um molde de fatia cerebral são relativamente mais espessas e não são viáveis para localizar pequenos núcleos cerebrais. No entanto, em comparação com o processo padrão de criossecção do tecido cerebral 11,12,13,14,15, encurtamos a duração do processamento em pelo menos 72 h, pulando as etapas de desidratação, o que resultou em seções cerebrais mais frágeis e mais difíceis de captar em uma lâmina de vidro, representando uma grande fraqueza deste protocolo.

Ao fazer as janelas cranianas para injeção de corante, prender a broca odontológica firmemente ao braço estereotáxico, em vez de segurá-la com a mão, facilita o controle da profundidade de perfuração usando o botão de ajuste fino, reduzindo assim a possibilidade de danificar o tecido cerebral.

Em conclusão, este estudo forneceu um método promissor para verificar preliminarmente as coordenadas estereotáxicas exatas antes do rastreamento viral, tornando o processo subsequente de marcação e rastreamento de neurônios mais confiável.

Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 82101249 para XY Sun), Fundação de Pesquisa de Pós-Doutorado da China (concessão nº 2022M722125 para XY Sun). Programa de Vela de Xangai (concessão NO. 21YF1425100 para SH Chen). Projeto Especial de Pesquisa Clínica da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (concessão Nº 202340088 a J Zhou). Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão Nº 82101262 a X Zhang, concessão Nº 82101287 a SH Chen).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1.0 µ L, Seringa Neuros, Modelo 7001 KH, 32 G, Estilo Ponto 3Hamilton65458-01
200 μ L pontas de pipetabiosharpBS-200-T
Seringa de 20 mLPor favor, grupo
3% H2O2 soluçãoLircon Company
Placa de 6 poçosShengyou Biotech20006
AnerdianLikang 31001002
Placa anti-roloLeica14047742497
BD insulina seringaBecton, Dickinson and Company328421
Curvatura pinça de dissecação dentadaJinzhongJD1050
Cellsens dimensão softwareOlympus
Cotonetede algodão Fisher Scientific23-400-122
Dapi-Fluoromount-GSouthernbiotech0100-20
BrocaLongxiang
Escovas finasHWAHONG
Tesoura finaJinzhongy00030
Microscopia fluorescenteOlympusBX63
micrótomo de congelamentoLeicaCM1950
Pinça hemostática reta com denteJinzhongJ31010
Agulha de infusão 0,7 mmGentilmente grupo
Injeção de cloridrato de lidocaínaHarvest Pharmaceutical Company71230803
LupaM & Camundongos
O Instituto de Pesquisa de Planejamento Familiar de Xangai– BK Laboratório
Ratos coronal fatia de cérebro moldeRWD Life Science68713
Tubo de microcentrífugabiosharpBS-02-P
Lâminas de micrótomoLeica819
Pomada oftálmicaCisen Pharmaceutical CompanyG23HDM9M4S5
paraformaldeídoBiosharpBL539A
Bombas peristálticasHarvard Apparatus70-4507
Solução salina tamponada com fosfatoServicebioG4202
Piette 2-200 μ Lthermofisher4642080
SDS-PAGE carregamento de amostra contendo azul de bromofenolBeyotimeP0015A
Lâminas de barbearBFYING91560618
SlidesCitotest Scientific188105
Aparelho estereotáxicoRWD Life Science68807
Pinça de dissecação com dentes retosJinzhongJD1060
Suporte de SeringaRWD Life Science68206
Tesoura de tecidoJinzhongJ21040
Tissue-Tek O.C.T compostoSakura4583
TribromoetanolAibei BiotechnologyM2910
de alta tecnologia C57/BL machos G Chenguang Stationery

Referências

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