Para estudar comportamentos de voo em um contexto de medo, introduzimos um protocolo modificado de condicionamento do medo. Esse protocolo garante que os camundongos exibam consistentemente comportamentos de voo durante a apresentação da pista no condicionamento do medo.
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Artigo de método
Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos
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Resumo
Resumo
A manifestação apropriada de comportamento defensivo em uma situação ameaçadora é fundamental para a sobrevivência. A teoria predominante sugere que um comportamento defensivo ativo, como saltar ou ousar rápido, é expresso sob alta ameaça iminente ou ameaça real, enquanto o comportamento defensivo passivo, como congelamento, é expresso quando a ameaça é prevista, mas a iminência da ameaça é relativamente baixa. No condicionamento clássico do medo, os indivíduos tipicamente exibem o congelamento como uma resposta defensiva condicionada, com pouca expressão de comportamento defensivo ativo na maioria dos casos. Aqui, apresentamos um procedimento modificado de condicionamento do medo para camundongos observarem a transição do congelamento para o voo e vice-versa, envolvendo cinco pares repetitivos de estímulos condicionados (CS; tônus contínuo, 8 kHz, 95 dB NPS (níveis de pressão sonora)) e estímulos não condicionados (US; choque podal, 0,9 mA, 1,0 s) durante dois dias. Este procedimento modificado de condicionamento do medo requer um número relativamente grande de sessões de condicionamento e dias de condicionamento, mas não requer um choque de pé de alta intensidade para expressão modesta do comportamento de voo. Usar o mesmo contexto para condicionantes e apresentações salientes de CS é essencial para eliciar comportamentos de voo. Este procedimento modificado de condicionamento do medo é um método confiável para observar comportamentos defensivos ativos em camundongos, fornecendo uma oportunidade para elucidar os mecanismos finos e características de tais comportamentos em um contexto de medo.
Introdução
A seleção adequada de comportamentos defensivos em circunstâncias ameaçadoras é crucial para a sobrevivência de todos os animais. Os comportamentos defensivos mudam gradualmente de um para outro com base na proximidade da ameaça, como a transição entre os comportamentos de congelamento e fuga 1,2,3. A desregulação desses comportamentos é frequentemente observada em vários transtornosmentais4. O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é um desses transtornos caracterizado por comportamentos defensivos exagerados, como respostas de pânico a estímulos não ameaçadores4.
O condicionamento clássico do medo em roedores é comumente usado como modelo para TEPT 5,6,7, mas os roedores não expressam comportamentos de voo (semelhantes ao pânico) nesse modelo8. Consequentemente, o modelo clássico de condicionamento do medo, muitas vezes referido como o "modelo de TEPT de roedores", carece de validade facial para TEPT em humanos, particularmente na captura de sintomas semelhantes ao pânico, que não foram bem estudados.
Recentemente, vários protocolos modificados de condicionamento do medo demonstraram com sucesso que os roedores exibem comportamento de voo durante esses procedimentos. Por exemplo, associações repetitivas de um estímulo condicionado (FC) e um estímulo incondicionado (US) sete vezes ao dia permitiram que ratas exibissem comportamentos de darting semelhantesaos comportamentos de voo9. Em dois dias de condicionamento de medo utilizando estímulos compostos seriados (ECE; composto de tom seguido de ruído), camundongos começaram a apresentar comportamentos de fuga durante a parte de ruído das apresentações de ECS 10,11,12. A descrição detalhada do método SCS é fornecida em um relatório de protocolo13. Um condicionamento de medo de três dias com SCS também funcionou para ratos induzirem comportamentos de voo14. No entanto, esses novos protocolos apresentam algumas limitações. Por exemplo, o uso da apresentação seriada de pistas não permite excluir a influência da estimativa de proximidade no comportamento defensivo. No caso de sete vezes a associação de US-SC em ratos, a maioria das respostas de voo foi observada em fêmeas e não em machos.
À luz dessas considerações, introduzimos um protocolo modificado de condicionamento do medo para camundongos para investigar comportamentos de voo em um contexto de medo. Camundongos machos exibem consistentemente comportamento de voo durante nosso condicionamento de medo modificado. Neste protocolo, o tom saliente é usado como o CS em vez de SCS. Além disso, é necessário um mínimo de cinco pares de CS-US em um dia por pelo menos dois dias, juntamente com a potencialização do medo pelo contexto condicionado. O protocolo fornece mais uma opção para investigar comportamentos de voo, complementando protocolos anteriores, dependendo do objetivo da pesquisa.
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Protocolo
Este protocolo foi conduzido de acordo com os princípios orientadores da Sociedade Fisiológica do Japão e recebeu aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Kanazawa Medical University (2021-32). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do ARRIVE. Camundongos adultos machos C57BL/6J (3-6 meses de idade) foram utilizados para o estudo, e foi previamente confirmado que esses camundongos exibiram os comportamentos de voo descritos neste manuscrito15.
1. Preparo dos animais
- Camundongos grupo-casa (3-4 por gaiola; mantidos a 23-27 °C; sob um ciclo claro/escuro de 12 h; fornecido acesso ad libitum a comida e água) até o início dos experimentos.
- Alojar individualmente cada rato em uma gaiola de plexiglass (14 cm × 21 cm × 12 cm) por pelo menos 3 dias antes de se submeter a esse condicionamento de medo modificado.
2. Configuração das ferramentas/equipamentos
- Caixa de condicionamento do medo (Figura 1A)
- Utilizar uma câmara de condicionamento do medo (25 cm × 25 cm × 25 cm) fechada em uma caixa de atenuação de som (67 cm × 53 cm × 55 cm) (ver Tabela de Materiais).
- Dois contextos (A e B) são necessários. Para o contexto A, crie listras pretas e brancas nas paredes anexando papelão plástico branco com fitas pretas (3 cm de largura, 4 em um tabuleiro). Use uma placa de plástico lisa branca para o chão.
- Limpe as paredes e o chão com Heptanol (1%) antes de cada sessão.
NOTA: Nenhum sistema de ventilação ativa é usado. A limpeza com álcool no final da sessão diminui o odor de Heptanol. - Para o contexto B, faça a aparência das paredes inteiramente preta, removendo a placa usada no contexto A. O piso é de grade.
NOTA: Nenhum odor específico é apresentado além de um leve odor de álcool para limpeza. - Iluminar a caixa experimental utilizando um diodo emissor de luz branca (LED, 240 lux) (ver Tabela de Materiais).
- Choque
- Conecte um amortecedor de embaralhamento (consulte Tabela de Materiais) a um piso de grade composto por hastes de aço inoxidável. Isso é usado para fornecer choques nos pés. A intensidade de choque nos pés foi fixada em 0,9 mA, seguindo os métodos comuns de condicionamento do medo 10,11,12,13.
- Gerador de áudio
- Coloque um alto-falante (consulte Tabela de Materiais) no teto. Todos os estímulos acústicos são amplificados.
- Modificar e calibrar digitalmente as amplitudes totais de cada estímulo para produzir níveis de pressão sonora (NPS, re: 20 μ Pa) na frente de 5 cm do alto-falante com um microfone de 1/4 de polegada. Apresente uma explosão de tom contínuo através deste alto-falante.
NOTA: Calibrar o alto-falante sonoro é crucial para examinar o impacto fino do estímulo sonoro nos comportamentos defensivos durante esse condicionamento de medo modificado.
- Transdutor
- Colocar o piso da câmara de ensaio num transdutor (ver Tabela de Materiais) para a detecção de vibrações. O sinal do transdutor é transmitido para uma placa de som com uma frequência de amostragem de 8 kHz para registrar as vibrações comportamentais.
- Câmera de vídeo
- Posicione uma câmera CMOS (consulte Tabela de Materiais) no teto para acompanhar os movimentos do sujeito e gravar o som na caixa de condicionamento.
- Sistema de acionamento
- Use um software de som (consulte a Tabela de Materiais) para acionar tons ou choques nos pés em horários programados.
NOTA: Qualquer estimulador disponível comercialmente funcionará para isso.
- Use um software de som (consulte a Tabela de Materiais) para acionar tons ou choques nos pés em horários programados.
3. Experiência comportamental
- Planeje quatro dias de procedimentos de condicionamento do medo: habituação (1 dia, 5 tentativas), condicionamento (2 dias, 5 tentativas cada) e sessões de teste/extinção (1 dia, 5 ou 15 tentativas). Os intervalos interexperimentais variaram entre 60-75 s (Figura 1B).
OBS: Preferencialmente, incluir dez ou mais sujeitos em um grupo para obter tendências comportamentais confiáveis. Dois ou três grupos são necessários, dependendo do objetivo do estudo.- Durante a sessão de condicionamento, apresentar o estímulo incondicionado (US) (1 s, 0,9 mA) imediatamente após o término do estímulo condicionado (CS) (contínuo tone burst, 8 kHz, 20 s, 95 dB NPS) como mostra a Figura 1B. Entregue cinco pares CS-US em um dia de condicionamento.
- Após o término do 5º choque nos pés, deixe o sujeito no contexto por 1 min antes de devolvê-lo à gaiola de casa. Limpe a câmara com álcool 70% para limpeza após cada teste comportamental.
OBS: A intensidade da CE e da US pode ser modificada dependendo do objetivo do estudo. Relatos anteriores mostraram que a intensidade mais forte do SC desencadeia comportamentos defensivos mais ativos do que os mais suaves15. Os dias de condicionamento também podem ser estendidos.
- Induzir comportamentos de voo durante as apresentações de CS seguindo o cronograma mencionado abaixo.
NOTA: A CS (95 dB NPS) e a US (0,9 mA) são utilizadas neste experimento.- No dia 1, exponha os sujeitos a 5 ensaios clínicos isolados de CE no contexto A.
- Nos dias 2 e 3, condicionar os indivíduos com 5 ensaios de associação CS-US no contexto B.
- No dia 4, expor os sujeitos a 5 tentativas isoladas de EC para a sessão de recordação no contexto B. Em caso de teste de extinção de memória, exponha os sujeitos a 15 testes de CS sozinhos.
Observação : para testar a estabilidade da memória, estender sessões de extinção por 2-3 dias ajudará. Além disso, testar a memória uma semana depois, em vez de no dia 4, pode fornecer confirmação adicional da estabilidade da memória.
4. Análise de comportamentos defensivos
NOTA: O movimento, a porcentagem de congelamento e o número de saltos durante as apresentações de CS são analisados. Os detalhes estão descritos abaixo. Se possível, analisar de forma duplamente cega seria melhor.
- Sincronize os tempos dos eventos no vídeo e os tempos dos estímulos (CS e US) usando o início do tom gravado no vídeo.
- Utilize um código feito sob medida para calcular os movimentos médios e totais dos mouses com base na diferença no centro de massa da silhueta do sujeito entre os quadros.
NOTA: Uma unidade arbitrária é usada para essa medição, uma vez que a velocidade do movimento depende da taxa de amostragem do filme. - Para medir a porcentagem de congelamento, use o sinal do transdutor em tempo.
- Pré-processe os sinais do transdutor usando um filtro passa-banda de 20-500 Hz.
- Calcular a raiz quadrada da amplitude quadrada média do sinal do transdutor em tempo para cada bino de 50 ms.
- Defina um limite para a amplitude do sinal para detectar o período de imobilidade. A duração da imobilidade é o período de sinal inferior ao limiar para mais de 1 s.
- Meça manualmente a duração do congelamento assistindo ao vídeo.
- Ajuste o limiar de amplitude do sinal para congelamento comparando a porcentagem de congelamento medida manualmente e a porcentagem calculada a partir do sinal do transdutor.
- Conte o número de saltos manualmente de arquivos de vídeo.
NOTA: Contar o número de dardos também será útil para avaliar a resposta do voo.
5. Análise estatística
- Significância estatística estabelecida em p < 0,05.
- Para comparações entre múltiplos grupos e múltiplos fatores, realizar uma ANOVA multiway seguida de testes post-hoc. Se um dia específico do cronograma de condicionamento for testado, realize vários testes de comparação ou testes de permutação.
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Resultados
Os resultados obtidos com o condicionamento do medo modificado em camundongos machos (C57BL/6J; 3-6 meses de idade) são apresentados, seguindo o esquema mostrado na Figura 1C. O experimento foi projetado para investigar como o contexto condicionado influencia a expressão de comportamentos de voo. Foram constituídos dois grupos: Grupo 1 (n = 10) e Grupo 2 (n = 10). Um SC (95 dB NPS) e um US (0,9 mA) foram utilizados neste experimento.
No dia 1, todos os camundongos...
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Discussão
O protocolo modificado de condicionamento do medo introduzido neste artigo é um método estável para investigar comportamentos de voo em um contexto de medo. Ao empregar este protocolo, descobrimos que os comportamentos de fuga de camundongos no contexto de medo são desencadeados por estímulos salientes e dependem do contexto. As características do comportamento de voo não foram bem investigadas, pois não havia um protocolo adequado para observar os comportamentos de voo. Este protocolo será um dos métodos adequados para ...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado por KAKENHI Grants JP22K15795 (para T.F.), JP22K09734 (para N.K.), JP21K07489 (para R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, para R.Y.) e The Naito Foundation (para T.F.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alto-falante de áudio | Fostex | FT17H | |
| Amplificador | Sony | TA-F500 | |
| câmera CMOS | Sanwa Supply Inc. | CMS-V43BK | |
| Câmara de condicionamento do medo | Panlab S.L.U. | LE116 | |
| Pellets de alimentos | Nosan | Labo MR padrão | |
| LED | Yamazen | LT-B05N | |
| Microfone | ACO | tipo 4156N | |
| Scramble shocker | Panlab S.L.U. | LE 100-26 | |
| Placa de som | Behringer | UMC202 | |
| Software de som | Syntrillium Software | Cool Edit 2000 | |
| Transdutor | Panlab S.L.U. | LE 111 |
Referências
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66266
