Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

A pesquisa de Acanthamoeba aumentou dramaticamente nos últimos anos devido ao aumento da prevalência de ceratite por Acanthamoeba (AK), que é uma infecção parasitária após a fixação de Acanthamoeba à córnea¹. Embora os surtos de AK possam ser atribuídos a cuidados inadequados com lentes de contato ou soluções ineficazes para cuidados com lentes de contato 2,3,4,5, atualmente não há requisitos para demonstrar a eficácia da desinfecção de Acanthamoeba para qualquer produto no mercado. No entanto, há um esforço contínuo na comunidade científica e nas organizações de padrões para examinar os protocolos necessários para quantificar a eficácia da desinfecção de produtos para cuidados com lentes de contato ^6,7. Além disso, devido à sua semelhança em aspectos celulares e funcionais com macrófagos humanos, Acanthamoeba foi observado como tendo um papel significativo no hospedeiro e disseminação de outros patógenos humanos⁸, além da patogenicidade que a própria ameba traz.

Foram descritas técnicas recentes que foram capazes de quantificar a motilidade de Acanthamoeba - que geralmente não está altamente sujeita ao movimento browniano ^9,10 - em relação a efeitos citopáticos ou subexposição ao campo elétrico ^9,11, bem como avanços na análise de motilidade na pesquisa de vírus gigantes usando Acanthamoeba como vetor viral rastreável ^{12, 13}. Também houve melhorias constantes e significativas no rastreamento de células e partículas ocorrendo nos últimos 20 anos usando novos programas de software, como o software de imagem usado aqui, e novos algoritmos e tecnologias de aprendizado profundo¹⁴. No entanto, este é um campo relativamente novo e crescente da ciência em relação à pesquisa de bancada, aplicação clínica e padrões industriais, e tem havido uma escassez de dados publicados sobre métodos para visualizar e rastrear essa ameba, particularmente para quantificar mudanças comportamentais após a adesão às lentes de contato ou durante ou após a desinfecção das lentes de contato. Outros campos que se expandem para o monitoramento visual de longo prazo apoiaram esse esforço^{15 , 16 , 17} . Devido à natureza inerentemente desafiadora de Acanthamoeba - incluindo uma resistência geral a plasmídeos (que podem conferir fluorescência), a capacidade da ameba de consumir e destruir corantes celulares padrão e uma composição proteica externa única - dificultando a marcação de anticorpos - métodos disponíveis para outras células que os tornam visíveis em outros ambientes que não a imagem de campo claro têm sido inutilizáveis neste organismo. Assim, quantificar a motilidade dessa ameba demonstrou uma adição significativa ao campo. Usando o método descrito aqui, pudemos verificar que as amebas permanecem móveis por pelo menos 12 h sem nutrientes¹⁸ e que as amebas que são desafiadas com um processo de desinfecção e cessam a motilidade durante a desinfecção podem recuperar sua motilidade pós-desinfecção se não forem totalmente lisadas¹⁹.

Este protocolo detalha como rastrear e quantificar visualmente a motilidade da ameba microscopicamente. As etapas principais são registrar a ameba em campo claro usando o foco e o tempo apropriados entre as imagens, transformar as imagens em binárias usando o software de imagem e, em seguida, usar o plug-in de rastreamento de um software de imagem para definir os parâmetros experimentais e seguir cada ameba para determinar as medidas necessárias, como velocidade, distância e confinamento. Em seguida, é possível quantificar a quimiotaxia de uma ameba ou de uma população de amebas para definir a direcionalidade. A principal contribuição deste método é visualizar e quantificar o comportamento da ameba durante diferentes estados de suporte nutricional, adesão à superfície, desafio de desinfecção ou outras alterações ambientais, como coabitação com cultura de células de mamíferos.

1. Preparação de Acanthamoeba

NOTA:Este protocolo foi verificado para ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 e PRA-411. Este é um patógeno BSL2 e deve ser trabalhado dentro de um capô e laboratório BSL2.

1. Crie uma cultura mestre a partir de um frasco de amostra ou plugue preparado²⁰ enchendo um frasco T75 com 30 mL de meio AC6 e adicione assepticamente um plugue ou o conteúdo de um frasco de amostra a ele. Incubar o balão durante 3-5 dias a 26-30 °C até que o balão esteja 50% a 80% confluente.
2. Passe as células um dia antes de serem necessárias para criar uma população homogênea de trofozoítos.
   1. De acordo com as necessidades da cepa, agite e/ou golpeie rapidamente a cultura mestre 2x para desalojar os trofozoítos aderidos.
   2. Encher um balão T75 com 30 ml de meio AC6. Adicione 2 mL da cultura mestre à passagem. Incubar o balão durante 18-24 h a 26-30 °C.
3. Antes da colheita, inspecione visualmente a população de trofozoítos com ampliação de 4x no microscópio. Certifique-se de que os trofozoítos sejam aderentes e uniformes.
4. Bata rapidamente no frasco 2x para desalojar os trofozoítos aderidos. Despeje o conteúdo em um tubo cônico de 50 mL.
5. Gire o tubo a 500 x g por 5 min em uma centrífuga balanceada para pellet a ameba. Despeje ou pipete o meio sobrenadante e descarte. Dilua o pellet em 2-10 mL de solução de 1/4 de Ringer.
6. Vortex a amostra. Adicione 10 μL de amostra a um hemocitômetro descartável e conte o UFC/mL da Acanthamoeba.
7. Com base na contagem do hemocitômetro, diluir o pellet de ameba a uma concentração de 7,5 x 10³ células/mL em solução de Ringer a 1/4.
8. Semeie ameba em uma superfície, que pode ser de vidro, plástico ou ágar não nutriente, e uma variedade de formas de poços, dependendo das necessidades experimentais, conforme descrito abaixo.
   1. Placa de 96 poços: semeie cada poço com 200 μL de suspensão de Acanthamoeba e envolva a placa com a tampa.
   2. Placa de 48 poços: semeie cada poço com 1 mL de suspensão de Acanthamoeba e envolva a placa com a tampa.
   3. Célula de fluxo: Adicione lentamente 4 mL de suspensão de Acanthamoeba através das portas estéreis de uma célula de fluxo de alumínio estéril, evitando bolhas na câmara. Clamp as portas fechadas após a suspensão ter sido adicionada.
9. Antes da imagem, permita que a ameba adira pelo menos 30 minutos à superfície antes de iniciar o registro microscópico.

2. Visualizando e gravando Acanthamoeba

1. Visualize a ameba com ampliação de 4x em campo claro. O fundo deve aparecer cinza claro e a ameba deve ser preta. Ajuste a luz e o foco para que a ameba fique em olheiras sólidas em vez de translúcidas (ou seja, ligeiramente fora de foco, Figura 1).
   NOTA: A ampliação ideal é de 4x para rastreamento por vários motivos: As amebas que saem ou entram no campo de visão durante o rastreamento não devem ser incluídas na análise de dados, portanto, a ampliação mais baixa suporta melhor o número máximo de amebas incluídas na análise em um período de tempo. A ameba deve aparecer como círculos pretos sólidos em campo claro para convertê-los em binários para análise de rastreamento. Isso é mais fácil de conseguir com uma ampliação menor, pois ampliações mais altas revelam facilmente a natureza translúcida e as estruturas internas da ameba. Em geral, mais ameba pode ser capturada em um único campo de visão em uma ampliação menor, suportando uma análise de dados mais robusta.
2. Configure os programas de gravação no software de imagem para gravar uma imagem em intervalos regulares para rastrear a ameba. O tempo mais longo entre as imagens que permitirão um rastreamento preciso é de 30 s, o tempo ideal para o tamanho do arquivo e os detalhes de rastreamento é sugerido em 12 s ou 24 s.
3. As amebas podem ser rastreadas por vários dias de cada vez, mas esteja ciente do tamanho do arquivo que esse tipo de gravação criará e da dificuldade inerente de manipular arquivos extremamente grandes. Para evitar isso, registre amebas por seções de tempo em determinados intervalos. Por exemplo, registre por 1 h a cada 12 h por 5 dias.
4. Se o microscópio e o programa permitirem, registre vários poços em uma única sessão usando as coordenadas XY dos poços de placa ou vários locais de uma célula de fluxo. Se necessário, junte várias seções de um poço ou célula de fluxo para criar um campo de visão maior com ampliação de 4x.
   NOTA: A única restrição sobre quantos locais podem ser registrados é a rapidez com que a platina do microscópio pode se mover entre os locais dentro do tempo de intervalo da imagem (por exemplo, tirar uma imagem a cada 12 s, 24 s, etc.). No entanto, isso não é obrigatório, e o rastreamento de vídeos feitos de um único local ainda pode ter um número suficiente de faixas para uma análise estatística robusta. Um microscópio Nikon Eclipse Ti-U foi usado neste estudo, e o estágio móvel automatizado foi utilizado para registrar imagens em vários poços ao mesmo tempo. No entanto, qualquer microscópio com capacidade de gravação programável funcionará. O microscópio deve se conectar a um computador e ser capaz de gravar imagens em um programa ou disco rígido.

3. Análise do tamanho da ameba

1. Abra o microscópio file no software de imagem. As opções de importação de bioformatos serão abertas. Na caixa de diálogo, verifique se o seguinte é verdadeiro: Exibição de pilha; Ver com: Selection-Hyperstack; Gerenciamento de memória: marque Usar pilha virtual; Modo de cor: padrão.
2. Certifique-se de que nenhum dos outros menus suspensos ou caixas de seleção esteja ativado. Clique em Ok.
3. Opções de séries de bioformatos abertos. Escolha qual série é necessária. Se apenas um local for registrado por vez, provavelmente haverá apenas uma opção aqui. Clique em Ok.
4. Escolha Image > Duplicate para duplicar o único poço com o qual está sendo trabalhado de cada vez, escolhendo apenas um canal C e apenas um canal Z.
5. A partir daqui, trabalhe apenas com a imagem duplicada para manipulação e análise, não com o original. Escolha Imagem > Tipo > 8 bits. Escolha Processar > Subtrair plano de fundo.
6. Defina a bola rolante para 10,0. Verifique o fundo claro. Verifique o parabolóide deslizante.
7. Escolha Processo > Melhorar o contraste. Defina pixels saturados como 0,1% para trofozoítos ou 0,3% para um grupo de células e agregados.
8. Escolha Imagem > Ajustar > Limite (padrão > P&B). O processo Make Binary será aberto. Selecione Padrão e marque Fundo preto (de máscaras binárias).
9. Selecione o limiar agressivamente para que a maioria dos pontos de fundo não sejam visíveis, mas alguma parte de cada ameba seja visível.
10. Se o software de imagem inverteu a imagem e o fundo é branco, e a ameba é preta, vá para Editar > Inverter para corrigi-lo em um fundo preto e ameba branca.
11. Escolha Processo> Binário > Fechar, caso as células tenham um pequeno espaço na membrana externa devido a estarem fora de foco ou motilidade da célula.
12. Escolha Processar > binário > preencher furos. Remova artefatos que não sejam ameba usando as ferramentas de desenho de forma e Editar > preenchimento. Se, nesse ponto, o plano de fundo estiver branco e a ameba estiver preta, escolha Editar > Inverter. Neste ponto, a imagem deve representar as imagens binárias na Figura 2.
13. Para registrar o tamanho de cada ameba, escolha Analyze > Analyze Particles. Tamanho do conjunto: 10-Infinitiy, Circularidade: 0-1, Mostrar: Nada. Marque Exibir apenas resultados e resumir.
14. Salve os arquivos CSV exibidos. Escolha Arquivo > Salvar como > Tiff e edite o nome de acordo com a especificação desejada.

4. Preparação de arquivos de microscópio para rastreamento (análise de motilidade)

1. Abra o microscópio file no software de imagem. As opções de importação de bioformatos serão abertas.
2. Na caixa de diálogo, verifique se o seguinte é verdadeiro: Exibição de pilha; Ver com: Selection-Hyperstack. Para gerenciamento de memória, marque Usar pilha virtual. Clique em Ok.
3. As opções da série Bio-Formats serão abertas. Escolha qual série é necessária. Se apenas um local for registrado por vez, provavelmente haverá apenas uma opção aqui. Clique em Ok.
4. Escolha Imagem > Duplicar. A partir daqui, trabalhe apenas na seção duplicada do vídeo em vez de trabalhar no arquivo original.
   NOTA: Duplique a seção do vídeo que está sendo rastreada naquele momento. Para fazer isso, é preciso conhecer os quadros que correspondem aos minutos necessários para o experimento. Por exemplo, se alguém quiser rastrear a^1ª hora e tirar fotos a cada 24 s, deve haver 150 quadros na^1ª hora. Portanto, a^1ª hora será os quadros 1-150, a^2ª hora será 151-300 e assim por diante.
5. Escolha Imagem > Tipo > 8 bits. Escolha Processar > Subtrair plano de fundo. Defina a bola rolante para 10.0.
6. Verifique o fundo claro. Verifique o parabolóide deslizante. Escolha Processo > Melhorar contraste e defina-o em 0,1%.
7. Marque Todas as x# Fatias (por exemplo, todas as 150 fatias). Desmarque Normalizar. Escolha Imagem > Ajustar > Limite (padrão > P&B).
8. O processo Make Binary será aberto. Selecione Padrão. Verifique o fundo preto (das máscaras binárias).
9. Limiar agressivamente, de modo que a maioria das manchas de fundo não são visíveis, mas algumas partes da ameba são visíveis. Nesta etapa, se o plano de fundo for branco e a ameba for preta, escolha Editar > Inverter. O fundo deve ser preto e a ameba deve ser branca.
10. Escolha Processar > binário > Fechar. Escolha Processar > binário > preencher furos. Escolha Arquivo > Salvar como > Tiff e edite o nome para a especificação desejada. O arquivo agora está pronto para rastreamento.

5. Analisando a motilidade por meio de rastreamento

1. No software de imagem com o arquivo tiff necessário para rastrear, vá para Plug-ins > Rastreamento > Trackmate. A versão do Trackmate será aberta.
2. Escolha Next (Próximo). Selecione o detector LoG no menu suspenso do detector. Defina o diâmetro estimado da bolha: 35,0 mícrons, limite 1,0. Desmarque Usar filtro mediano e Fazer localização de subpixel.
3. Clique em Visualizar na primeira, no meio e nas fatias finais. Certifique-se de que todas as amebas sejam capturadas por um círculo roxo e que os defeitos ou artefatos de fundo não sejam incluídos.
4. Escolha Next (Próximo). Ele começará a ser processado e esta etapa pode levar alguns minutos para ser executada. Uma barra de detecção na parte superior da tela indicará quanto do processo está concluído.
5. Escolha Next (Próximo ) quando solicitado. No limite inicial, escolha Avançar novamente sem selecionar nada. Selecione Hyperstack Displayer ao selecionar uma exibição. Escolha Next (Próximo).
6. Defina o filtro nos pontos e escolha Avançar sem selecionar nada. Selecione um rastreador; para fazer isso, selecione Rastreador de LAP (em vez de Rastreador de LAP Simples). Escolha Next (Próximo).
7. Na vinculação quadro a quadro, defina a distância máxima para 40 μm. Na verificação de fechamento da lacuna do segmento da via Permitir fechamento da lacuna. Defina a distância máxima para isso em 100 μm e a folga máxima do quadro em 4. Não selecione nada para Divisão de segmentos de trilha ou Mesclagem de segmentos de trilha.
8. Escolha Next (Próximo). O rastreamento pode levar um tempo significativo para ser executado. Quando estiver concluído, a janela deve dizer: Rastreamento feito em x s na parte inferior. Escolha Next (Próximo).
9. Escolha Next (Avançar) novamente quando o rastreamento for concluído. Definir filtros nas faixas: selecione o sinal + no canto inferior esquerdo para adicionar um filtro para o número de pontos nas faixas. Defina o filtro como Acima para pelo menos 93% dos quadros (por exemplo, 150 quadros precisariam de um mínimo de 140 pontos).
   NOTA: Algumas versões deste software exigirão a seleção do equivalente oposto, como Abaixo pelo menos 7%, o que pode ser feito arrastando uma linha para a esquerda ou para a direita para atingir o número desejado.
10. Escolha Next (Próximo). Opções de exibição aparecerão. Certifique-se de que as faixas em cada quadro não estejam deformadas ou estranhas na maneira como a ameba está se movendo antes de salvar o arquivo XML do Trackmate ou o arquivo CSV das faixas.
11. Se uma faixa precisar ser excluída, clique em TrackScheme. O TrackScheme mostrará todas as trilhas e pontos de contato da ameba em todos os quadros.
    NOTA: Os possíveis motivos para excluir uma faixa são uma ameba entrou / saiu do campo de visão durante a gravação, uma trilha tem formato inadequado em comparação com o caminho real da ameba ou, por algum motivo, a trilha ou a ameba é um outlier nos dados de acordo com os parâmetros experimentais, etc.
12. Clique na ameba para destacar o ponto verde na tela e no Trackscheme o local terá um quadrado verde ao seu redor. Isso indicará qual trilha ou local precisa ser removido.
13. Clique com o botão direito do mouse na faixa que precisa ser removida e selecione Faixa inteira. Pressione o botão Excluir .
14. Depois de revisar todas as faixas, salve o arquivo de rastreamento clicando em Salvar no canto inferior esquerdo do pop-up do software de rastreamento. Salve o arquivo XML usando o nome do vídeo. Clique em Retomar para voltar ao pop-up do software de rastreamento.
15. Clique em Trilhas e selecione Trilhas à esquerda. Clique em Exportar para CSV e salve o arquivo CSV.
16. Se a planilha não reconhecer o CSV resultante, execute as etapas a seguir.
    1. Abra o arquivo CSV salvo no Bloco de Notas. Clique em Control + A e Control + C para copiar todo o conteúdo.
    2. Abra a planilha e clique em Control + V para colá-la na planilha. Todos os dados estarão em uma célula.
    3. Com as células com dados ainda selecionados, vá para Dados > Texto para Colunas. Escolha Delimitado > Próximo. Escolha Vírgula > Próximo > Concluir. Salve esse arquivo como o novo CSV.
17. O CSV de rastreamento terá muitos parâmetros disponíveis para análise (Figura 3). Copie e cole os parâmetros desejados em um novo arquivo CSV (Figura 4) para analisar. Os parâmetros usados aqui são descritos abaixo.
    1. Distância total percorrida: distância total percorrida por uma ameba em μm.
    2. Distância máxima percorrida: a distância máxima no caminho de uma ameba a partir de seu ponto inicial - isso pode não ser necessariamente o ponto final
       
       Onde dij é a distância de qualquer ponto I para qualquer ponto j na pista.
    3. Taxa de confinamento: A taxa de confinamento indica a eficiência de uma ameba em se afastar de seu ponto inicial: ela viajou em linha reta para longe de seu ponto inicial (um valor próximo a 1) ou ficou relativamente perto de seu ponto inicial (um valor próximo a 0).
       
    4. Velocidade média da pista: Velocidade média da ameba ao longo da distância total percorrida em mícrons por segundo.
       
    5. Deslocamento da trilha: A distância entre o ponto inicial de uma ameba e o ponto final em mícrons.
       NOTA: Todos os parâmetros de análise do software de imagem e suas definições podem ser encontrados aqui: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Lembre-se de que cada arquivo salvo é um resumo das faixas analisadas naquele momento. Para produzir uma análise de dados robusta, será necessário combinar adequadamente os resultados de várias réplicas, horas, etc., conforme adequado para os dados (Figura 5 e Figura 6).

Para alcançar o sucesso usando esse método, há várias peças gerais cruciais a serem consideradas. A primeira é a configuração física da ameba e do microscópio, a segunda é a utilização adequada do software de imagem e a terceira é exportar e analisar os dados de imagem de maneira significativa.

Antes do início da gravação microscópica, é fundamental garantir que a ameba esteja devidamente focada no estágio do microscópio (Figura 1). Em vez de focar na ameba no plano Z ideal para detalhes individuais, aqui é ideal visualizá-los ligeiramente fora de foco para que se tornem pontos pretos sólidos em oposição ao seu estado translúcido quando vistos em detalhes. Visualizá-los dessa maneira permitirá que o software de imagem e o software de rastreamento encontrem cada ameba individual com muito mais facilidade quando o arquivo for convertido em binário (Figura 2). Saber qual é o objetivo do software de imagem - ou seja, que cada ameba apareça como um círculo branco bem definido, pode ajudar o leitor a encontrar o foco adequado ao tirar as imagens originais em campo claro. Então, com cada círculo claramente definido, o software de rastreamento será capaz de rastrear adequadamente a motilidade e reunir as métricas de motilidade individuais para cada ameba.

Depois de seguir as instruções passo a passo no protocolo listado acima para o software de imagem e o software de rastreamento e consultar o vídeo associado para auxiliar nas primeiras etapas cruciais do uso do software de imagem, é hora de exportar os dados do software de imagem para quantificação e análise de dados. A saída bruta do software de rastreamento será semelhante ao que é visto na Figura 3. Aqui, é importante verificar se o número de pontos nas faixas exportadas está correto para o que é esperado (por exemplo, se alguém pediu que 93% dos quadros estivessem presentes em todas as faixas e um tivesse 100 quadros totais no vídeo, cada faixa exportada deve ter maior ou igual a 93 pontos). Se os pontos não corresponderem aos requisitos, pode ser necessário voltar às etapas do software de rastreamento para garantir que os parâmetros necessários foram definidos corretamente.

A partir da exportação bruta, comece a criar a planilha de análise de dados (Figura 4). É importante lembrar que cada faixa representa uma ameba singular dentro de uma réplica singular. Portanto, como visto na Figura 4, Figura 5 e Figura 6, todas as faixas de um conjunto de quadros ou ponto de tempo devem ser calculadas (Figura 4), e esse processo deve ser feito para cada conjunto de quadros ou ponto de tempo em uma série inteira (ou seja, se um total de 3 h de vídeo for tirado e os pontos de dados forem divididos por hora, então haverá três conjuntos de quadros/horas para analisar por replicação, Figura 5). Finalmente, a partir dessa combinação de médias em cada conjunto de quadros em cada replicação, os dados médios devem ser combinados de cada réplica em um espaço para que os dados em várias réplicas possam ser analisados para determinar a média verdadeira e o desvio padrão por ponto de tempo (Figura 6).

As médias de cada réplica serão usadas para análise de dados, e a média combinada e o desvio padrão ou erro padrão de todas as réplicas serão usados para representação gráfica (como visto em um exemplo na Figura 7). Se analisar dados como fizemos aqui, que são várias amostras sendo acompanhadas em vários pontos de tempo, é mais apropriado analisá-los usando uma ANOVA de medida de repetição de 2 vias com um teste de Tukey post hoc. Isso nos permite determinar as diferenças entre as amostras em cada ponto de tempo e também determinar as diferenças dentro de cada amostra ao longo do tempo.

Figura 1: A ameba aparece como formas escuras opacas na microscopia de campo claro. Ampliado na imagem representativa da ameba com ampliação de 4x, ligeiramente fora de foco para aparecer como olheiras sólidas. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Ameba fotografada em microscopia de campo claro convertida em binária e rastreada. A ameba com ampliação de 4x, em campo claro (esquerda), foi convertida em binária com artefatos removidos (meio) e, após o rastreamento, com faixas selecionadas exibidas (direita). Linha superior: um poço inteiro fotografado costurando 4 imagens, barra de escala = 1000 μm. Linha inferior: o tamanho de uma única imagem antes da costura, barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A saída imediata da análise de dados do software de imagem e rastreamento contém uma ampla variedade de tipos de dados. A saída representativa do rastreamento é mostrada na Figura 2, que é um vídeo singular. Observe que os números das faixas (seta vermelha) pulam os números, indicando que o software de rastreamento removeu corretamente as faixas que não estavam alinhadas com os parâmetros. Neste exemplo, apenas 71 de 5385 faixas identificadas estavam alinhadas com os parâmetros. Essa proporção é normal, dadas diretrizes tão rígidas. Este número de rastros também está de acordo com o número de amebas usadas neste protocolo (por exemplo, se uma placa de 96 poços é semeada com 200 μL de 7,5 x 103 UFC / mL por poço, então deve-se esperar cerca de 1.500 amebas no poço e aproximadamente esse número visível em um campo de visão de 4 pontos. Provavelmente haverá muito mais rastros do que ameba à medida que a ameba entra e sai do campo de visão, gerando novos rastros). Este número de rastro é novamente aparente na Figura 2, onde apenas alguns rastros são visíveis em comparação com um grande número de pontos. Sempre verifique o número de pontos na pista (caixa vermelha) para garantir que apenas os comprimentos corretos da pista sejam incluídos. Por exemplo, aqui, incluímos mais de 93% dos quadros, e havia 127 quadros nesta seção, então todos os números de pontos devem estar acima de 118. Destacadas em amarelo estão as medidas que foram mencionadas no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dados reorganizados conforme necessário após a saída inicial de dados. Organização dos dados desejados após a exportação. (A) As medidas pertinentes escolhidas para quantificar foram copiadas da exportação do software de rastreamento (Figura 3) e coladas em uma nova planilha. (B) Depois que as medições desejadas forem organizadas na nova planilha, a média de cada trilha deve ser calculada. Assim, neste exemplo representativo, a Distância Total, a Distância Máxima, o Confinamento, a Velocidade Média e o Deslocamento de cada trilha utilizável neste vídeo singular foram calculados em média para um número singular para cada medição. Observe novamente aqui que um total de 71 faixas atendeu aos parâmetros para os quadros 1-127. Provavelmente haverá um número diferente de faixas adequadas de cada vídeo ou conjunto de quadros analisado, como fica evidente na Figura 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Quadros sequenciais definidos para análise de uma série inteira de imagens ou vídeo. Esta é uma imagem representativa da adição de vídeos sequenciais à análise de dados. Supondo que os quadros 1-127 constituam a Hora 1 do vídeo (aqui, 1 h é composto de tirar uma imagem uma vez a cada 28 s). Os quadros 128 a 254 serão a 2ª hora de vídeo e os quadros 255 a 381 serão a 3ª hora de vídeo. Combine os dados exportados (como foi exportado na Figura 3) de todas as horas em uma planilha para trabalhar com todos de uma vez. Como foi feito na Figura 4, os dados de todas as trilhas utilizáveis para cada conjunto de quadros/h serão calculados em média. Tudo na Figura 5 são os dados de uma réplica ou amostra. Se houver 3 réplicas, haverá 3 guias de planilha separadas dispostas de forma idêntica e os dados delas serão alimentados em uma nova guia, conforme demonstrado na Figura 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Dados compostos de todas as amebas em cada conjunto de quadros usados para representar uma única replicação. (A) Todas as médias de cada quadro definido na Figura 5 precisam ser reunidas em um local central para que a análise final dos dados possa ser concluída. Nesta imagem representativa, as médias de Distância Total dos três primeiros conjuntos de quadros (ou horas) são mostradas. Isso deve ser repetido para cada amostra/condição/réplica que está sendo executada. Em seguida, as médias de cada amostra de cada conjunto de quadros devem ser calculadas (caixa amarela). Este é o ponto de dados final a partir do qual o desvio padrão e o erro padrão podem ser calculados. As médias individuais de cada Amostra (aqui, os números em B3, B4 e B5 para a Amostra de Distância Total 1; C3, C4 e C5 para Amostra de Distância Total 2, etc.) será usado para executar a análise estatística. Este processo será repetido para todas as medições necessárias (Distância Máxima, Confinamento, Velocidade Média, Deslocamento, etc.) (B) Para fazer uma representação gráfica da quantificação, use os números na caixa amarela como pontos de dados a serem usados para o gráfico final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Dados brutos de motilidade para ATCC 30461 e ATCC 50370. Os dados brutos (aqui representados como média ± AE para cada hora) foram coletados previamente e não publicados para estudos anteriores 18,19. Essa quantificação de motilidade demonstra que essas duas amebas são semelhantes em suas primeiras 6 h de motilidade (medida pela distância total em mícrons percorrida naquela hora) em solução de 1/4 de Ringer em uma superfície de vidro. Cada ponto de tempo representa três réplicas separadas, cada uma composta de 20 a 200 faixas de ameba. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os autores são funcionários da Alcon Research, LLC.