Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

O início da vida na Terra pode ter se originado em ambientes extremos, como fontes hidrotermais, que são caracterizadas por temperaturas e acidez extremamente altas¹. Os micróbios continuam a habitar ambientes extremos, incluindo fontes termais e solfatara vulcânica. Caracterizar a dinâmica evolutiva que ocorre sob essas condições extremas pode lançar luz sobre os processos fisiológicos especializados que permitem a sobrevivência nessas condições. Isso pode ter implicações abrangentes, desde nossa compreensão das origens da diversidade biológica até o desenvolvimento de novas enzimas de alta temperatura com aplicações biotecnológicas.

A compreensão da dinâmica evolutiva microbiana em ambientes extremos permanece limitada, apesar de sua importância crítica. Em contraste, um corpo significativo de conhecimento sobre a evolução em ambientes mesófilos foi adquirido através da aplicação de uma técnica conhecida como evolução experimental. A evolução experimental envolve a observação de mudanças evolutivas em condições de laboratório 2,3,4,5. Muitas vezes, isso envolve um ambiente de mudança definido (por exemplo, temperatura, salinidade, introdução de uma toxina ou de um organismo competidor)^7,8,9. Quando combinada com o sequenciamento do genoma completo, a evolução experimental nos permitiu testar aspectos-chave dos processos evolutivos, incluindo paralelismo, repetibilidade e a base genômica para adaptação. No entanto, até o momento, a maior parte da evolução experimental foi realizada com micróbios mesófilos (incluindo bactérias, fungos e vírus 2,3,4,5, mas excluindo em grande parte archaea). Um método de evolução experimental aplicável a micróbios termofílicos nos permitiria entender melhor como eles evoluem e contribuir para uma compreensão mais abrangente da evolução. Isso tem implicações potencialmente abrangentes, desde decifrar as origens da vida termofílica na Terra até aplicações biotecnológicas envolvendo 'extremozimas' usadas em bioprocessos de alta temperatura¹⁰ e pesquisa astrobiológica¹¹.

O archaeon Sulfolobus acidocaldarius é um candidato ideal como organismo modelo para o desenvolvimento de técnicas experimentais de evolução para termófilos. S. acidocaldarius reproduz-se aeróbico, com uma temperatura ótima de crescimento a 75 ° C (faixa de 55 ° C a 85 ° C) e alta acidez (pH 2-3) ^{4 , 6 , 12 , 13 , 14} . Notavelmente, apesar de suas condições extremas de crescimento, S. acidocaldarius mantém densidades populacionais e taxas de mutação comparáveis aos mesófilos 7,15,16,17,18. Além disso, possui um genoma relativamente pequeno e bem anotado (cepa DSM639: 2,2 Mb, 36,7% GC, 2.347 genes)¹²; S. acidocaldarius também se beneficia de ferramentas robustas de engenharia genômica, permitindo uma avaliação direta do processo evolutivo por meio de nocautes genéticos direcionados¹⁹. Um exemplo notável disso é a disponibilidade de cepas geneticamente modificadas de S. acidocaldarius, como as cepas auxotróficas de uracila de MW001¹⁹ e SK-1²⁰, que podem servir como marcadores selecionáveis.

Existem desafios significativos na condução da evolução experimental com termófilos como S. acidocaldarius. A incubação prolongada em altas temperaturas necessária para esses estudos impõe uma evaporação considerável para as técnicas de cultura líquida e sólida. A operação prolongada em altas temperaturas também pode danificar as tradicionais incubadoras de agitação que são comumente usadas na evolução experimental em meios líquidos. A exploração de várias temperaturas requer um investimento financeiro substancial para adquirir e manter várias incubadoras. Além disso, o elevado consumo de energia necessário levanta preocupações ambientais e financeiras significativas.

Este trabalho apresenta um método para enfrentar os desafios encontrados na realização de evolução experimental com termófilos como S. acidocaldarius. Com base em uma técnica desenvolvida por Baes et al. para investigar a resposta ao choque térmico^14,21, o método desenvolvido aqui utiliza termomisturadores de bancada para incubação consistente e confiável em alta temperatura. Sua escalabilidade permite a avaliação simultânea de múltiplos tratamentos de temperatura, com custos reduzidos na aquisição de equipamentos adicionais de incubação. Isso aumenta a eficiência experimental, permitindo uma análise estatística robusta e uma extensa investigação dos fatores que influenciam a dinâmica evolutiva em termófilos²². Além disso, essa abordagem reduz significativamente o investimento financeiro inicial e o consumo de energia em comparação com as incubadoras tradicionais, oferecendo uma alternativa mais sustentável e ecologicamente correta.

Nosso método estabelece as bases para investigar experimentalmente a dinâmica evolutiva em ambientes caracterizados por temperaturas extremas, que podem ter desempenhado um papel fundamental durante os estágios iniciais da diversificação da vida na Terra. Os organismos termofílicos têm propriedades únicas, mas suas condições extremas de crescimento e requisitos especializados muitas vezes limitam sua acessibilidade como sistema modelo. A superação dessas barreiras não apenas expande as oportunidades de pesquisa para investigar a dinâmica evolutiva, mas também aumenta a utilidade mais ampla dos termófilos como sistemas modelo na pesquisa científica.

1. Preparação do meio de crescimento de S. acidocaldarius (BBM⁺)

NOTA: Para cultivar S. acidocaldarius, este protocolo usa meio basal de Brock (BBM⁺)²³. Isso é preparado combinando primeiro as soluções de estoque inorgânico descritas abaixo para criar BBM⁻, que pode ser preparado com antecedência. O BBM⁺ é então preparado conforme necessário, adicionando as soluções de estoque orgânico ao BBM⁻. As receitas da solução de estoque também são apresentadas na Tabela 1. Todos os meios e soluções de reserva devem ser preparados em H₂O (ddH₂O) biddestilado.

1. Preparação de soluções-mãe inorgânicas para meio de cultura
   1. Preparar a solução de estoque de oligoelementos.
      1. Prepare a solução estoque de oligoelementos adicionando 9 g / L de tetraborato de sódio decahidratado (Na₂B₄O₇ · 10H₂O) a ddH₂O, seguido pela adição de 1: 1 H₂SO₄ gota a gota até que se dissolva.
      2. Introduzir sequencialmente 0,44 g/L de sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO₄·7H₂O), 0,1 g/L de cloreto de cobre(II) di-hidratado (CuCl₂·2H₂O), 0,06 g/L de molibdato de sódio di-hidratado (Na₂MoO₄·2H₂O), 0,06 g/L de sulfato de vanádio (IV) di-hidratado (VOSO_{4,2H 2}O), 0,02 g/L de sulfato de cobalto (II) heptahidratado (CoSO₄·7H₂O), e 3,6 g/L de cloreto de manganês (II) tetrahidratado (MnCl₂·4H₂O). Autoclave a solução e conserve a 4 °C.
   2. Preparar a solução de estoque de Fe (1000x) dissolvendo 20 g/L de cloreto férrico hexa-hidratado (FeCl₃·6H₂O) em ddH₂O. Esterilizar a solução filtrando através de um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C.
   3. Prepare a Solução Brock I (1000x) dissolvendo 70 g / L de cloreto de cálcio (CaCl₂ · 2H₂O) em água bidestilada (ddH₂O). Autoclave e armazene a 4 °C.
      CUIDADO: A dissolução de CaCl₂·2H₂O em água é um processo exotérmico. Execute esta etapa com cuidado. Use luvas de risco térmico com classificação EN407 para se proteger contra ferimentos. Não feche bem o recipiente, pois a pressão pode aumentar.
   4. Prepare a solução de Brock II / III combinando 130 g / L de sulfato de amônio ((NH₄) ₂SO₄), 25 g / L de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO₄ · 7H₂O), 28 g / L de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄) e 50 mL da solução estoque de oligoelementos previamente preparada. Usando 1:1 H₂SO₄, ajuste o pH da solução de estoque para 2-3. Autoclave a solução e armazene-a em temperatura ambiente (RT).
2. Preparação de soluções de reserva orgânicas para meio de cultura
   1. Prepare a solução estoque de D-glicose (100x) dissolvendo 300 g / L (30% p / v) de D-glicose em ddH₂O e esterilize com filtro (através de um filtro de 0,22 μm). Conservar a 4 °C.
      NOTA: Outras fontes de carbono podem ser usadas no lugar da D-glicose de acordo com os requisitos experimentais (por exemplo, D-xilose).
   2. Prepare a peptona a partir da solução estoque de caseína (100x) dissolvendo a peptona da caseína a 100 g / L em ddH₂O. Autoclave para esterilizar e armazenar a solução estoque em RT.
   3. Preparar a solução estoque de uracilo (100x) dissolvendo 2 g/L de uracilo em ddH₂O e esterilizar por filtro (através de um filtro de 0,22 μm); armazenar a -20 °C.
3. Preparação do meio de crescimento BBM⁺ na concentração de trabalho de 1x
   1. Primeiro, prepare 988 mL de ddH₂O estéril em autoclavagem.
   2. Prepare 1 L BBM⁻ adicionando 1 mL de solução estoque de Brock I, 10 mL de solução estoque de Brock II / III e 1 mL de solução estoque de Fe aos 988 mL de ddH₂O estéril autoclavado anteriormente. Ajuste o pH médio para a faixa de 2-3 com 1:1 H₂SO₄.
      NOTA: BBM⁻ pode ser feito com antecedência e armazenado no RT por até 1 mês.
   3. Finalmente, para produzir 1 L de BBM⁺, combine 10 mL de solução estoque de D-glicose, peptona da solução estoque de caseína e solução estoque de uracila com 985 mL de BBM⁻. Misture bem e ajuste o pH médio para 2-3 com 1:1 H₂SO₄.
      NOTA: O BBM⁺ deve ser feito na hora, conforme necessário.
4. Preparação do meio sólido BBM⁺
   1. Preparar soluções de estoque 1 M de MgCl₂ e CaCl₂; estes ajudarão na solidificação do meio sólido BBM. Para 1 M MgCl₂, adicione 9,5 g a 100 mL de ddH₂O. Para 1 M CaCl₂, adicione 11 g a 100 mL de ddH₂O. Autoclave para esterilizar.
      CUIDADO: A dissolução de CaCl₂·2H₂O em água é um processo exotérmico. Execute esta etapa com cuidado. Use luvas de risco térmico com classificação EN407 para se proteger contra ferimentos. Não feche bem o recipiente, pois a pressão pode aumentar.
   2. Misture goma gelana a 3% (p/v) (por exemplo, 30 g/L) em ddH₂O e autoclave para esterilizar.
      NOTA: A goma gelana (por exemplo, gelita) é usada aqui como agente gelificante, pois o ágar bacteriológico padrão não pode solidificar a 75 ° C.
   3. Separadamente, prepare o BBM⁺ para o meio sólido, que deve ser misturado na proporção de 1:1 com a goma gelana estéril preparada na etapa 1.4.1.
      1. Primeiro, prepare 1 L BBM⁻ como na etapa 1.3.2. Combine 887 mL de BBM⁻ com 1 mL de solução estoque de Fe e 20 mL de solução estoque de D-glicose, peptona da solução estoque de caseína e solução estoque de uracila.
      2. Adicione 40 mL de 1 M MgCl₂ e 12 mL de 1 M CaCl₂. Misture bem e ajuste o pH médio para 2-3 com 1:1 H₂SO₄.
         NOTA: Os volumes de soluções de estoque adicionados aqui são intencionalmente maiores do que para a preparação de BBM⁺ líquido na etapa 1.3. Isso é para levar em conta a mistura na proporção de 1:1 com goma gelana derretida na etapa seguinte.
   4. Pré-aqueça o BBM⁺ para meio sólido a aproximadamente 75 °C e misture na proporção de 1:1 com goma gelana derretida em ddH₂O. Misture bem e despeje em plástico estável ao calor (por exemplo, polipropileno), placas de Petri de vidro ou placas de seis poços para o crescimentode S. acidocaldarius. Use o ágar-ágar imediatamente depois de misturado, pois ele endurecerá rapidamente.
      NOTA: Algumas placas de Petri de poliestireno de 90 mm comumente usadas para microbiologia se deformam se incubadas em altas temperaturas por longos períodos.
      CUIDADO: Tome as devidas precauções de segurança ao lidar com líquidos quentes; use luvas de risco térmico com classificação EN407 para se proteger contra ferimentos.

2. Revivendo S. acidocaldarius de uma cultura de estoque congelador

1. Preparação de tubos de crescimento ventilados para garantir aeração suficiente e disponibilidade de oxigênio.
   1. Com antecedência, prepare tubos de microcentrífuga perfurados de 2 mL para o crescimento de Sulfolobus . Aqueça cuidadosamente o fio rombo (>0,7 mm, como um clipe de papel esticado) usando uma chama de bico de Bunsen e fure a tampa do tubo, criando um pequeno orifício de aproximadamente 1 mm.
   2. Coloque os tubos perfurados em um recipiente autoclavável (por exemplo, caixa de ponta de pipeta vazia) e autoclave para esterilizar.
      CUIDADO: Use luvas de risco térmico com classificação EN407 para proteger contra lesões térmicas nas mãos por metal aquecido. Aqueça o fio por apenas um curto período de tempo (1-2 s) para evitar superaquecimento. Somente metais com alta temperatura de fusão (aço) devem ser usados.
2. Inocular culturas iniciais de S. acidocaldarius.
   1. Encha os tubos perfurados autoclavados de 2 mL com 1,5 mL de BBM⁺ pré-aquecido (conforme preparado na seção 1, pré-incubado a 75 °C por pelo menos 15 min).
   2. Inocule os tubos cheios de BBM⁺ com uma raspagem (equivalente a 50 - 60 mg) de um estoque de glicerol (glicerol a 25% v/v, armazenado a -80 °C). Aqui, S. acidocaldarius cepa DSM639 é usada. Encha um tubo adicional com 1,5 mL de BBM+ como controle negativo.
3. Para evitar que quaisquer aerossóis escapem da tampa do tubo perfurado de 2 mL e contaminem o ambiente de crescimento (e quaisquer outras amostras) e para reduzir a variabilidade da evaporação da cultura dentro dos tubos, coloque uma membrana permeável a gás no topo da tampa que possa suportar temperaturas elevadas (65-85 °C) e bloquear o escape/infiltração microbiana.
   NOTA: A utilização de membranas permeáveis a gás para vedação de tubos reduz consideravelmente a evaporação. Durante um período de 48 h a 75 °C, os tubos selados apresentam uma perda média de volume de 8,63% (intervalo: 3,29-16,45%, n = 24 repetidos técnicos, repetidos duas vezes), em contraste com 25,05% (intervalo: 11,92-62,91%, n = 24 repetidos técnicos, repetidos duas vezes) para tubos não selados.
4. Incubar os tubos inoculados num termomisturador a 75 °C com agitação constante a 400 rotações por minuto (RPM) durante 48-72 h ou até atingir OD_600nm de 0,3 - 0,8 medido por espectrofotómetro.
   NOTA: A tampa perfurada dos tubos de 2 mL e a agitação permitem a aeração adequada para um crescimento ideal. A tampa do termomixer deve estar no lugar para garantir que uma temperatura consistente seja mantida e para reduzir a evaporação.
5. Após o período de incubação, dê às culturas revividas uma segunda fase de crescimento (pré-condicionamento).
   1. Pulverize as culturas girando os tubos a 5000 x g por 2 min em RT. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1,5 mL de BBM⁺ quente fresco.
      NOTA: Este experimento usa a cepa de tipo selvagem S. acidocaldarius DSM639, mas esses métodos de crescimento e evolução experimental podem ser aplicados a qualquer cepa de Sulfolobus e potencialmente a outros termófilos.

3. Determinação da densidade populacional, tempo de duplicação e fase de crescimento exponencial para S. acidocaldarius

1. Determine a densidade populacional e o tempo para a fase de crescimento exponencial para as condições de seleção escolhidas. Para cada condição ambiental a ser testada, prepare três culturas iniciais seguindo as etapas 2.1 a 2.5.
2. Diluir as três culturas em BBM⁺ até um diâmetro externo de_{600 nm} de 0,01. Faça pelo menos 20 mL de cada cultura. Essas três culturas representam réplicas técnicas.
3. Execute curvas de crescimento replicadas de OD_600nm ao longo do tempo usando amostragem destrutiva.
   1. Prepare 24 tubos perfurados de 2 mL da etapa 2.1, separe-os em três conjuntos de oito e rotule essas réplicas técnicas 1, 2 e 3 (por exemplo, oito tubos rotulados como réplica 1 etc.).
   2. De cada uma das três culturas diluídas da etapa 3.2, pipetar 1,5 mL em sete tubos preparados. Encha o tubo restante com 1,5 mL de BBM+ como controle negativo.
4. Incubar todos os 24 tubos em um termomisturador a 75 °C e 400 RPM. Sele com uma membrana permeável a gás. Em intervalos regulares (por exemplo, 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 h), remover um tubo de cada um dos três replicados e medir a diâmetro externo_{de 600 nm} com um espectrofotómetro e, em seguida, rejeitar o tubo. Substitua a membrana permeável ao gás após remover um tubo.
5. Em paralelo, determine a relação entre OD_600nm e densidade populacional. Realize diluições seriais (1 x ^10-1 a 1 x ^10-6) no meio BBM⁺ por pelo menos três pontos de tempo (idealmente, início, meio e fim). Inocular 100 μl de cada diluição em meio sólido BBM⁺ (preparado como no passo 1.4).
   NOTA: Para obter um crescimento consistente da colônia e contagens precisas, é melhor pipetar a cultura diluída em meio sólido em um local sem realizar espalhamento mecânico, como usar um espalhador em forma de L ou esferas de vidro. A propagação mecânica parece afetar adversamente a formação de colônias.
6. Incubar as placas em uma incubadora estática a 75 °C até que as colônias apareçam (5-7 dias).
   1. Durante esse período, mantenha a incubadora úmida para evitar o ressecamento excessivo das placas, ou não se formarão colônias.
   2. Consiga isso colocando as placas em uma caixa fechada de polipropileno forrada com um pano úmido. Fure a tampa da caixa pelo menos três vezes para permitir a aeração.
   3. Coloque baldes de água na incubadora para aumentar a umidade. Reabasteça os baldes diariamente.
7. Uma vez que todas as medições de OD_600nm tenham sido coletadas, determine o tempo de duplicação e o tempo para atingir a fase de crescimento exponencial ajustando uma curva logística à relação entre OD_600nm e tempo, por exemplo, usando SummarizeGrowth do pacote growthcurver em R.
8. Uma vez que as colônias visíveis tenham se formado em meio sólido, conte as unidades formadoras de colônias (UFCs), com o objetivo de contar a partir do fator de diluição, produzindo 50-100 colônias para a melhor precisão.
9. Calcular a densidade celular no meio de cultura utilizando a fórmula: UFC/ml = número de colónias/(volume plaqueado × factor de diluição).
10. Execute a regressão linear log-log para determinar a relação entre log10 (CFU) e log10 (OD_600nm). Assim, calcule a UFC/mL prevista para uma determinada DO a partir da inclinação e interceptação do modelo de regressão: UFC prevista = 10^{[inclinação × log10(OD600nm) + interceptação]}.
11. (Opcional) Além disso, execute as etapas 3.1-3.10 em uma incubadora agitada para determinar se um crescimento comparável está sendo alcançado em termomisturadores.

4. Iniciação de linhagens independentes para evolução experimental

1. Dia 1: Para gerar colônias únicas, primeiro execute todas as etapas da seção 2 acima para gerar uma cultura inicial.
2. Dia 3: Meça o diâmetro externo de_{600 nm} da cultura para garantir que atingiu densidade suficiente na fase exponencial (diâmetro externo_{de 600 nm} 0,3-0,8 por espectrofotômetro).
3. Crie diluições seriadas da cultura de S. acidocaldarius DSM639 de 1 x ^10-1-1 x ^10-6 e espalhe 100 μL de cada diluição de 1 x ^10-5 e 1 x ^10-6 em poços de uma placa de 6 poços contendo meio sólido BBM⁺ (Seção 1 e Tabela 1) em várias réplicas. Incubar as placas a 75 °C em uma incubadora estática como na etapa 3.5 por 5-7 dias para que surjam colônias individuais.
4. Dia 8-10 (5-7 dias após a incubação):
   1. Estabeleça o número de linhagens em evolução de colônias únicas. Para cada linhagem, escolha uma colônia aleatoriamente das placas usando um loop de inoculação. Ressuspenda a colônia em um tubo perfurado de 2 mL contendo 1,5 mL de meio BBM⁺ pré-aquecido. Rotule adequadamente o tubo.
   2. Repita para o número desejado de linhagens; aqui, sete linhagens foram estabelecidas e rotuladas como SA1-7. Encha um tubo adicional com 1,5 mL de BBM+ como controle negativo.
   3. Selar os topos dos tubos com uma membrana respirável e incubar num termomisturador a 75 °C, 400 rpm durante 48-72 h, até que as culturas se tornem turvas (equivalente a OD_600nm 0,3-0,8 por espectrofotómetro).
5. Dia 10-12 (7-9 dias após a inoculação):
   1. Em uma centrífuga de bancada, gire as culturas clonais a 5.000 x g por 1 min em RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 200 μL de BBM⁺ líquido.
   2. Misture as suspensões celulares de 200 μL com 200 μL de glicerol a 50% (glicerol a 25% v/v) para criar estoques de glicerol das sete linhagens independentes e armazene a -80 °C. Estas são as populações ancestrais para os experimentos de evolução.

5. Realização do experimento de evolução de temperatura

NOTA: Um diagrama conceitual descrevendo os principais aspectos do protocolo do experimento é fornecido na Figura 1.

1. Use as sete populações ancestrais geradas na seção 4 para o experimento de evolução.
   1. Realizar todos os ensaios experimentais de evolução em tubos estéreis perfurados de 2 ml, selados com uma membrana permeável (descrito acima, secção 2).
   2. Juntamente com essas populações, mantenha tubos perfurados separados de 2 mL com 1,5 mL de BBM⁺ como controles negativos livres de cultura para monitorar a contaminação (cruzada) e definir um limite para OD indicando nenhum crescimento de cultura.
2. Estabeleça tratamentos de temperatura: O uso de termomisturadores permite que vários tratamentos de temperatura sejam estabelecidos. Aqui, use os seguintes tratamentos de temperatura: constante 75 °C, constante 65 °C e queda gradual de 75-65 °C diminuindo a temperatura em 1 °C a cada 4 dias ('tratamento de queda de temperatura').
   NOTA: Esses tratamentos podem ser adaptados a requisitos experimentais específicos. Um termomixer separado é necessário para cada tratamento de temperatura.
3. Dia 1: Reviver as populações ancestrais de seus estoques de glicerol (preparado na etapa 4.5) seguindo as etapas descritas na seção 2.
4. Dia 3:
   1. Diluir essas culturas a um OD_600nm de 0,01 (medido por espectrofotômetro) para um volume total de pelo menos 6 mL de BBM⁺ pré-aquecido. Alíquota de 1,5 mL de cada uma das sete culturas populacionais ancestrais diluídas em três tubos separados de 2 mL perfurados, um para cada tratamento de temperatura estabelecido na etapa 5.2.
      NOTA: Esta etapa de alíquota garante que qualquer variação genética presente em cada população ancestral esteja presente em todos os tratamentos de temperatura no início do experimento de evolução. Essas culturas atuarão como transferência 0 (Tx0) para iniciar o experimento de evolução de temperatura.
   2. Sele os tubos com a membrana respirável e coloque cada conjunto de sete populações ancestrais em termomisturadores separados. Defina cada termomixer para a temperatura necessária e 400 rpm para iniciar o experimento de evolução.
5. Dia 5:
   1. Após 48 h, realizar a transferência 1 (Tx1) inoculando 1,5 mL de meio BBM⁺ aquecido em um tubo perfurado de 2 mL com 15 μL de cultura de cada uma das culturas Tx0 (diluição 1:100). Para maior velocidade, execute esta etapa com uma pipeta multicanal de largura variável para concluir várias transferências de um único experimento em uníssono, reduzindo o tempo que as culturas ficam fora do termomisturador.
   2. Como antes, sele os tubos antes de colocá-los de volta em posições aleatórias em seus respectivos termomisturadores. Realize a randomização manualmente ou através dos randomizadores de poços iMetaLab 96.
6. Meça o OD_600nm de Tx0 em um espectrofotômetro baseado em placa (200 μL em placas de 96 poços; um mesmo volume de BBM⁺ é usado como um branco) para rastrear o crescimento das linhagens independentes.
   NOTA: O OD_600nm deve ser medido após a transferência para um meio fresco para evitar contaminação. A densidade óptica também pode ser medida por outros meios, como com um espectrofotômetro padrão. O uso de um espectrofotômetro baseado em placas permite a medição simultânea de várias culturas, agilizando o processo.
7. Repita as etapas 5.5 e 5.6 nos dias 7, 9, 11, etc., correspondentes a Tx2, Tx3, Tx4, etc. Manter a temperatura constante para os tratamentos de 75 °C e 65 °C. Para o tratamento de queda de temperatura, diminua a temperatura em 1 °C a cada segunda transferência (ou seja, em Tx2, Tx4, Tx6, etc.).
8. Prepare os estoques de glicerol (etapa 3.2.3) das populações após cada^10ª transferência (ou seja, Tx10, Tx20, etc.), rotulando o tubo com o identificador da população ancestral (por exemplo, SA1 para a^1ª população independente) e o número da transferência (por exemplo, Tx10 para a^10ª transferência). Use esses estoques de glicerol posteriormente para reviver populações para estudar como as populações mudaram ao longo do tempo ou para reiniciar o experimento, se necessário (por exemplo, devido a contaminação ou incidentes inesperados que resultaram em perda de culturas).
9. Deixe o experimento prosseguir para um número predeterminado de transferências ou até que um número predeterminado de gerações tenha decorrido. Na transferência final, prepare estoques de glicerol de todas as linhagens descendentes.
   NOTA: Aqui, o experimento prosseguiu até que o tratamento de queda de temperatura atingisse 65 °C, o que ocorreu em Tx22. Isso corresponde a aproximadamente 150 gerações (calculadas com base no fator de diluição de 100 em 4.6: log₂ (100) = 6.64 gerações por transferência). A duração dos experimentos de evolução pode ser ajustada de acordo com os requisitos experimentais.

6. Ensaios de crescimento de experimentos pós-evolução: linhagens ancestrais vs. evoluídas

NOTA: Um diagrama conceitual descrevendo o protocolo de ensaio de crescimento / aptidão é fornecido na Figura 2.

1. Prepare tubos perfurados de 2 mL com 1,5 mL BBM⁺. Prepare tubos suficientes para cultivar todas as linhagens descendentes mais cada uma das linhagens ancestrais.
2. Reviver populações ancestrais e cada população descendente armazenada na etapa 5.9 após a transferência final do experimento de evolução usando o método descrito nas etapas 2.2-2.5, mas com incubação na temperatura que cada população experimentou para as duas transferências finais do experimento de evolução, ou seja, 75 ° C para o tratamento constante de 75 ° C e 65 ° C para os experimentos de constante de 65 ° C e queda de temperatura. Para atingir densidades populacionais comparáveis, realizar a incubação de 75 °C por 72 h e a incubação de 65 °C por 120 h.
3. Meça OD_600nm das culturas cultivadas por meio de um espectrofotômetro baseado em placa.
4. Realizar ensaios de crescimento de cada população descendente e de cada estirpe ancestral a ambas as temperaturas (ou seja, 75 °C e 65 °C) em três repetições. Prepare tubos de centrífuga perfurados de 2 mL com 1,5 mL de BBM⁺. Prepare seis tubos para cada linhagem evoluída e cada cepa ancestral. Rotule os tubos com o nome da linhagem (SA1-7 ou ancestral), a temperatura de crescimento (75 °C ou 65 °C) e o ID da réplica (1, 2 ou 3).
   NOTA: Se menos de seis termomisturadores estiverem disponíveis, o ensaio de crescimento pode ser replicado ao longo de vários dias em vários blocos experimentais. Nesse caso, é importante medir cada linhagem e ancestral em cada bloco experimental para que os efeitos de bloqueio possam ser estimados e contabilizados estatisticamente.
5. Inocular o meio fresco nos seis tubos preparados com 15 μL de cultura de cada linhagem descendente e cepa ancestral.
6. Defina três termomisturadores para 75 °C e três termomisturadores para 65 °C, designando cada termomisturador para uma réplica de ID. Coloque os tubos no termomixer correspondente à temperatura e replicar o ID. Dentro de cada termomixer, certifique-se de que as linhagens e ancestrais sejam colocados aleatoriamente para controlar a heterogeneidade.
7. Sele cada conjunto de 24 tubos com uma membrana permeável. Incubar durante 48 h.
8. Transfira 200 μL de cada cultura para uma placa de 96 poços. Meça OD_600nm usando um espectrofotômetro.
   NOTA: Uma pipeta multicanal de largura variável pode ser usada para facilitar a transferência entre tubos de microcentrífuga e placas de 96 poços.
9. Plote e analise dados usando software estatístico (por exemplo, R).

7. Sequenciamento do genoma completo de linhagens evoluídas e identificação de mutações

1. Reviva as linhagens descendentes armazenadas na etapa 5.9 em BBM⁺ pré-aquecido a 75 °C de 48-72 h, inoculando uma raspagem de gelo de cada população congelada em BBM⁺ como na seção 2, etapas 2.2-2.5. Prepare entre 1-10 mL de volume de cultura para obter uma quantidade suficiente de DNA genômico. O volume exato necessário depende da opção escolhida para sequenciamento nas etapas 7.2 ou 7.3 (abaixo).
   NOTA: É uma boa prática sequenciar também a cepa usada para iniciar as populações ancestrais. Isso é para determinar corretamente se alguma mutação detectada nas linhagens descendentes surgiu durante o experimento de evolução e não antes.
2. (Opção 1) Extraia DNA genômico e prepare bibliotecas de sequenciamento Illumina para sequenciamento Illumina.
   1. Extraia e purifique o DNA genômico usando um kit comercial de extração de DNA genômico para bactérias.
   2. Certifique-se de que o DNA genômico extraído atenda aos requisitos de quantidade e qualidade do provedor de sequenciamento usando kits comerciais recomendados pelo provedor.
   3. Realize a preparação da biblioteca de DNA genômico usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Recomenda-se um protocolo de extremidade emparelhada de 250 pb. Armazene o DNA genômico extraído a -20 °C até que esteja pronto para enviar amostras ao provedor de sequenciamento.
3. (Opção 2) Como alternativa, envie as amostras para um provedor comercial que realiza extração de DNA, verificações de qualidade de DNA genômico, preparação da biblioteca Illumina e sequenciamento Illumina como um serviço combinado.
4. Analise genomas sequenciados para identificar mutações.
   1. Receba arquivos FASTQ e, se ainda não tiver sido executado pelo provedor de sequenciamento, execute o corte do adaptador usando o Trimmomatic com um corte de qualidade de janela deslizante de Q15.
   2. Usando os arquivos FASTQ cortados, execute o pipeline breseq (versão 0.38.1) para detectar mutações, comparando as leituras de DNA genômico com a sequência de referência para a cepa escolhida. Para S. acidocaldarius DSM639, este é o RefSeq ID NC_007181.

8. (Opcional) Avaliação do consumo de energia do termomixer vs. incubadora

1. Para comparar o consumo de energia do uso de uma incubadora versus um termomixer para crescimento, meça o consumo de energia de cada dispositivo ao longo de 24 h usando um plugue de monitoramento de energia.
2. Use dois plugues para medir o consumo de energia de ambos os dispositivos ao mesmo tempo. Como alternativa, meça o consumo de energia em dias sucessivos.
3. Desconecte a incubadora ou termomixer da tomada elétrica. Conecte o plugue de monitoramento de energia no soquete e inicialize-o de acordo com as instruções do fabricante, incluindo a instalação do software de monitoramento e controle.
4. Conecte a incubadora ou termomisturador no plugue de monitoramento de energia e deixe-o funcionar por no mínimo 2 h (mas idealmente por 24 h ou mais) para obter uma boa estimativa do consumo típico de energia. Registre o consumo de energia de cada dispositivo.

Medições da curva de crescimento
As curvas de crescimento para S. acidocaldarius DSM639 são mostradas na Figura 3A. O crescimento foi semelhante quando se comparou a incubação usando termomisturadores com a de incubadoras convencionais. Os parâmetros da taxa média de crescimento foram estimados ajustando-se uma curva logística a cada curva de crescimento replicada e calculando-se a média e o erro padrão. Os tempos até a fase exponencial média no termomixer e na incubadora foram de 27,2 h ± 1,1 h e 31,1 h ± 1,9 h, respectivamente. Os tempos de duplicação iniciais estimados para o termomixer e a incubadora a 75 °C foram de 4,29 h ± 0,28 h e 4,19 h ± 0,44 h, respectivamente, o que é consistente com os valores publicados anteriormente24. A relação entre log10 (OD600nm) e log10 (CFU) foi bem caracterizada por um modelo linear (R2 ajustado = 0,82, F (1,22) = 104, p < 0,00001, inclinação = 1,73 ± 0,17, intercepto = 9,73 ± 0,14). A relação entre OD600nm e UFC é, portanto, dada pela fórmula UFC = 10 (1,73 × log10 (OD600nm) + 9,73). Um OD600nm de 0,3 corresponde, portanto, a aproximadamente 6,7 × 108 UFC/mL (Figura 3B).

Experiência de evolução de temperatura
Três condições de temperatura, constante de 75 °C, constante de 65 °C e queda de temperatura (75-65 °C, diminuindo 1 °C a cada duas transferências), foram iniciadas usando sete linhagens independentes derivadas de S. acidocaldarius DSM639. As medições de OD600nm foram feitas após cada transferência durante os 45 dias do experimento (aproximadamente 150 gerações a 75 ° C) e são mostradas na Figura 4. As medições de OD600nm feitas ao longo dos dias são inerentemente barulhentas, pois podem estar sujeitas a diferenças sutis, por exemplo, no período de crescimento, temperatura, etc. No entanto, as medições feitas ao longo dos dias ainda podem ser úteis para avaliar a viabilidade da população, bem como dar uma indicação sobre se o condicionamento físico está melhorando ao longo do tempo. As linhagens da condição constante de 75 ° C aumentaram em OD600nm de uma faixa inicial de 0,125-0,3 para uma faixa de 0,248-0,471 até o final do experimento. Isso sugere que o condicionamento físico melhorou com este tratamento. Em contraste, as linhagens do tratamento constante de 65 ° C exibiram uma queda no OD600nm, de uma faixa inicial de 0,018-0,087 para 0,008-0,04 no ponto de tempo final. Isso sugere que as populações não foram capazes de se adaptar à temperatura constante de 65 ° C, embora o fato de organismos viáveis poderem ser recuperados mostre que as populações não foram eliminadas por diluições sucessivas, sugerindo algum grau de adaptação. Finalmente, as populações no tratamento de queda de temperatura aumentaram da faixa inicial de600 nm de diâmetro externo de 0,099-0,279 para 0,3-0,39 em Tx6 (correspondendo a 288 h e 73 ° C neste tratamento), seguido por uma diminuição constante para uma faixa de 0,003-0,024 no ponto de tempo final.

Ensaios de crescimento/aptidão
Ensaios de aptidão foram realizados para cada população descendente após os experimentos de evolução. O OD600nm foi testado após 48 h de crescimento para todas as sete linhagens independentes, seguido pelo ajuste de modelos lineares em R para cada temperatura de ensaio, com 'ambiente de seleção' como efeito principal e 'replicar/termomisturador' como efeito de bloco. O crescimento da cepa ancestral foi usado como nível de referência para contrastes de tratamento. Os dados são mostrados na Figura 5.

Quando testado a 75 ° C, houve em média aumentos significativos na aptidão em relação à cepa ancestral para linhagens dos tratamentos constantes de 75 ° C (teste t: t210 = 3,64, p = 0,0003) e constantes de 65 ° C (teste t: t210 = 2,8, p = 0,005), mas não do tratamento de queda de temperatura (teste t: t210 = −0,87, p=0,38). Quando testadas a 65 °C, em média, as linhagens de todos os tratamentos apresentaram um aumento na aptidão (linhagens constantes de 75 °C; teste t: t210 = 4,68, p < 0,0001, linhagens constantes de 65 ° C; teste t: t210,=4,24, p<0,0001, linhagens de queda de temperatura; teste t: t210 = 3,15, p = 0,002). No entanto, para ambas as temperaturas do ensaio, houve diferenças consideráveis entre as linhagens em sua aptidão (Figura 5). Algumas linhagens não diferiam consideravelmente da linhagem ancestral ou diminuíram em aptidão; Isso foi particularmente evidente para linhagens do tratamento de queda de temperatura.

Vale a pena notar que a relação entre OD600nm e UFC/mL pode ter mudado durante o experimento de evolução. Isso pode ser avaliado determinando parâmetros de crescimento para linhagens evoluídas (seguindo as etapas 3.1-3.10).

Resultados do sequenciamento do genoma completo
A análise do genoma completo foi realizada usando breseq (versão 0.38.1)25 nas sete linhagens da condição constante de 75 ° C usando o genoma de referência de S. acidocaldarius DSM639 (acesso RefSeq NC_007181.1). Uma variedade de mutações foi revelada envolvendo inserções, deleções e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) nos genomas de todas as linhagens descendentes (Tabela 2). Múltiplas inserções e mutações não sinônimas ocorreram em genes codificadores de proteínas, bem como regiões intergênicas que podem influenciar a expressão gênica devido a mudanças de quadro nas regiões promotoras dos genes. Algumas das mutações foram consistentes em várias linhagens descendentes em genes envolvidos em várias funções, como biossíntese da parede celular, transcrição, metabolismo, transporte celular e atividade catalítica (Tabela 2). Entre essas mutações estava uma grande deleção de 54.667 pares de bases em cinco das sete linhagens; Isso foi confirmado por um gráfico de evidência de cobertura ausente para cada população (frequência variando de 93,2% a 100%). A região excluída equivale a uma perda de 53 genes; Os papéis desses genes na adaptação serão investigados em estudos futuros. Algumas diferenças foram observadas entre o isolado usado de DSM639 e a sequência de referência publicada (mostrada na Tabela Suplementar 1).

Consumo de energia da incubadora agitada versus termomixer
O consumo de energia de uma incubadora agitada foi comparado a um termomixer usando um plugue inteligente de monitoramento de energia disponível comercialmente em uma faixa de temperaturas de incubação comuns e a temperatura de 75 °C usada aqui. A 75 °C, o termomisturador consumiu aproximadamente 1/40da energia de uma incubadora de agitação tradicional (Figura 6), sugerindo os termomisturadores como um meio potencial de reduzir a pegada de carbono associada à evolução experimental.

Figura 1: Fluxograma ilustrando o protocolo do experimento de evolução em três tratamentos de temperatura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxograma ilustrando as etapas do protocolo de ensaio de crescimento/aptidão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Determinação dos principais parâmetros de crescimento e comparação de dispositivos de incubação para S. acidocaldarius DSM639. Três culturas replicadas foram cultivadas a 75 °C em 7 tubos separados. A amostragem destrutiva foi usada para medir (A) OD600nm (média ± erro padrão de n = 3 réplicas técnicas; algumas barras de erro são menores do que os símbolos de plotagem); as curvas representam modelos de crescimento logístico ajustados e (B) unidades formadoras de colônias (UFCs); linhas representam modelos de regressão linear log-log ajustados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos para densidades ópticas (OD600nm) obtidas durante experimentos de evolução. Densidades ópticas de linhagens independentes medidas durante os experimentos de evolução sob três tratamentos de temperatura (constante 65 ° C, constante 75 ° C, queda 75 ° C-65 ° C) conduzidos ao longo de aproximadamente 150 gerações. As curvas retratam as suavizações de Loess ao longo do tempo para cada linhagem independente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados representativos para ensaios de crescimento. Ensaios de crescimento para linhagens independentes derivadas de S. acidocaldarius DSM639 após experimentos de evolução de temperatura (constante 65 ° C, constante 75 ° C, queda 75 ° C-65 ° C) em comparação com a cepa ancestral. Para todas as linhagens, o crescimento foi testado a 65 °C e 75 °C. Os pontos coloridos mostram a média ± o erro padrão das réplicas técnicas (mostrado em cinza, n = 12 para o ancestral e n = 3 para cada linhagem evoluída). A barra cinza denota a média ± erro padrão da aptidão ancestral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Consumo de energia de incubadoras tradicionais versus dispositivos termomisturadores. O consumo de energia foi registrado usando um plugue inteligente de monitoramento de energia disponível comercialmente durante 2 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Receitas de mídia e soluções de estoque necessárias para cultivar S. acidocaldarius. Todos os meios e soluções de estoque devem ser feitos com H2O (ddH2O) e depois esterilizados por autoclavagem ou esterilização por filtro através de um filtro de 0,22 μm, conforme indicado. Consulte a seção 1 do protocolo para obter uma descrição detalhada de como preparar todas as soluções de mídia e estoque. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Resultados representativos para o sequenciamento do genoma completo de linhagens descendentes. Mutações encontradas em linhagens descendentes descendentes de S. acidocaldarius DSM639 de tratamento constante a 75 °C. As mutações indicam mudanças em relação ao ancestral direto da linhagem, que possui várias mudanças em relação à sequência de referência para S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181; mutações no ancestral são mostradas na Tabela Suplementar 1). n indica o número de linhagens nas quais uma mutação foi encontrada. → gene no 'quadro de leitura direta'; ← gene no 'quadro de leitura reversa'. †Essas mudanças são relativas a um deslocamento de quadro (A) 10→11 presente no isolado de S. acidocaldarius DSM639 (Tabela Suplementar 1). Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela suplementar 1: Mutações presentes no isolado de S. acidocaldarius DSM639 em relação à sequência de referência (acesso RefSeq NC_007181.1). → gene no 'quadro de leitura direta'; ← gene no 'quadro de leitura reversa'. ‡SACI_RS04020 é anotado como um pseudogene em NC_007181.1, mas a mutação frameshift Δ1 bp observada aqui supostamente restaura sua função, pois com a mutação, ela codifica uma proteína com 100% de identidade ao gene da girase reversa rgy (acesso RefSeq WP_176586667.1). Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não declaram quaisquer conflitos de interesse.