Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Daniel Call; Sabrina S. Pizarro; Erica Tovey; Emily Knight; Carrie Baumgardner; Kenneth A. Christensen; James C. Morris

doi:10.3791/66279

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Artigo de método

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

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DOI:

10.3791/66279

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19 de janeiro de 2024

Daniel Call^*¹ , Sabrina S. Pizarro^*²^,³ , Erica Tovey¹ , Emily Knight²^,³ , Carrie Baumgardner²^,⁴ , Kenneth A. Christensen¹ , James C. Morris²

¹Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, ²Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, ³Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, ⁴Department of Physics and Astronomy, Clemson University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.

Resumo

O metabolismo da glicose é crítico para o tripanossoma africano, Trypanosoma brucei, como um processo metabólico essencial e regulador do desenvolvimento do parasita. Pouco se sabe sobre as respostas celulares geradas quando os níveis de glicose ambiental se alteram. Tanto na corrente sanguínea quanto na forma pró-cíclica (estágio de inseto) parasitas, os glicossomas abrigam a maior parte da glicólise. Essas organelas são rapidamente acidificadas em resposta à privação de glicose, o que provavelmente resulta na regulação alostérica de enzimas glicolíticas como a hexoquinase. Em trabalhos anteriores, localizar a sonda química usada para fazer medições de pH foi um desafio, limitando sua utilidade em outras aplicações.

Este trabalho descreve o desenvolvimento e o uso de parasitas que expressam pHluorina glicossomicamente localizada2, um biossensor de pH de proteína hereditária. A pHluorina2 é uma variante ratiométrica da pHluorina que apresenta uma diminuição da excitação dependente do pH (ácido) a 395 nm, ao mesmo tempo que produz um aumento da excitação a 475 nm. Parasitas transgênicos foram gerados pela clonagem do quadro de leitura aberta pHluorin2 no vetor de expressão de tripanossomas pLEW100v5, permitindo a expressão de proteínas induzíveis em ambos os estágios do ciclo de vida. A imunofluorescência foi utilizada para confirmar a localização glicossomal do biossensor pHluorin2, comparando a localização do biossensor com a aldolase da proteína residente no glicossomo. A responsividade do sensor foi calibrada em diferentes níveis de pH incubando as células em uma série de tampões que variaram em pH de 4 a 8, uma abordagem que usamos anteriormente para calibrar um sensor de pH baseado em fluoresceína. Em seguida, medimos a fluorescência da pHluorina2 a 405 nm e 488 nm usando citometria de fluxo para determinar o pH glicossomal. Validamos o desempenho dos parasitas transgênicos vivos que expressam pHluorina2, monitorando o pH ao longo do tempo em resposta à privação de glicose, um conhecido gatilho da acidificação glicossomal em parasitas PF. Esta ferramenta tem uma gama de aplicações potenciais, incluindo potencialmente ser usada na triagem de drogas de alto rendimento. Além do pH glicossomal, o sensor pode ser adaptado a outras organelas ou usado em outros tripanosomatídeos para entender a dinâmica do pH no ambiente de células vivas.

Introdução

Os cinetoplastídeos parasitas, como a maioria dos organismos vivos, dependem da glicose como um componente fundamental do metabolismo central do carbono. Este grupo inclui organismos medicamente importantes, como o tripanossoma africano, Trypanosoma brucei; o tripanossoma americano, T. cruzi; e parasitas do gênero Leishmania. O metabolismo da glicose é crítico para o crescimento do parasita nos estágios do ciclo de vida patogênico. Por exemplo, quando privado de glicose, a forma sanguínea (BSF) do tripanossoma africano morre rapidamente. Notadamente, a glicólise serve como única fonte de ATP durante esse estágio da infecção^....