Modelagem de ligantes em mapas derivados da criomicroscopia eletrônica

Summary

Este protocolo apresenta as ferramentas disponíveis para modelar ligantes de moléculas pequenas em mapas crioEM de macromoléculas.

Abstract

Decifrar as interações proteína-ligante em um complexo macromolecular é crucial para entender o mecanismo molecular, os processos biológicos subjacentes e o desenvolvimento de medicamentos. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica de amostra criogênica (cryoEM) surgiu como uma técnica poderosa para determinar as estruturas de macromoléculas e investigar o modo de ligação do ligante em resolução quase atômica. Identificar e modelar moléculas não proteicas em mapas cryoEM é muitas vezes um desafio devido à resolução anisotrópica em toda a molécula de interesse e ao ruído inerente aos dados. Neste artigo, os leitores são apresentados a vários softwares e métodos atualmente usados para identificação de ligantes, construção de modelos e refinamento de coordenadas atômicas usando macromoléculas selecionadas. Uma das maneiras mais simples de identificar a presença de um ligante, conforme ilustrado com a enzima enolase, é subtrair os dois mapas obtidos com e sem o ligante. A densidade extra do ligante provavelmente se destacará no mapa de diferenças, mesmo em um limite mais alto. Há casos, como mostrado no caso do receptor metabotrópico de glutamato mGlu₅, em que esses mapas de diferença simples não podem ser gerados. O método recentemente introduzido de derivar o mapa de omitir Fo-Fc pode servir como uma ferramenta para validar e demonstrar a presença do ligante. Finalmente, usando a bem estudada β-galactosidase como exemplo, o efeito da resolução na modelagem dos ligantes e moléculas de solvente em mapas de crioEM é analisado e uma perspectiva de como o cryoEM pode ser usado na descoberta de medicamentos é apresentada.

Introduction

As células realizam suas funções realizando inúmeras reações químicas simultânea e independentemente, cada uma meticulosamente regulada para garantir sua sobrevivência e adaptabilidade em resposta a estímulos ambientais. Isso é obtido pelo reconhecimento molecular, que permite que as biomoléculas, especialmente as proteínas, formem complexos transitórios ou estáveis com outras macromoléculas, bem como pequenas moléculas ou ligantes¹. Assim, as interações proteína-ligante são fundamentais para todos os processos da biologia, que incluem a regulação da expressão e atividade proteica, o reconhecimento de substratos e cofatores por enzimas, bem como a forma como as células percebem e transmitem sinais ^1,2. Uma melhor compreensão das propriedades cinéticas, termodinâmicas e estruturais do complexo proteína-ligante revela a base molecular da interação do ligante e também facilita o design racional do medicamento, otimizando a interação e a especificidade do medicamento. Uma abordagem econômica e mais rápida para estudar a interação proteína-ligante é usar o docking molecular, que é um método computacional que rastreia virtualmente uma gama diversificada de pequenas moléculas e prevê o modo de ligação e a afinidade desses ligantes às proteínas-alvo³. No entanto, evidências experimentais de estruturas de alta resolução determinadas por difração de raios X (XRD), ressonância magnética nuclear (RMN) ou criomicroscopia eletrônica (cryoEM) fornecem a prova essencial para tais previsões e auxiliam no desenvolvimento de ativadores ou inibidores mais novos e eficazes para um determinado alvo. Este artigo usa a abreviatura 'cryoEM', como a técnica é comumente chamada. No entanto, há um debate em andamento sobre a escolha da nomenclatura correta e, recentemente, o termo amostra criogênica Electron Microscopy (cryoEM) foi proposto para indicar que a amostra está em temperatura criogênica e fotografada com elétrons⁴. Da mesma forma, os mapas derivados do cryoEM foram chamados de potencial de elétrons, potencial eletrostático ou potencial de Coulomb e, para simplificar, aqui usamos mapas cryoEM 5,6,7,8,9,10.

Embora o XRD tenha sido a técnica padrão-ouro na determinação da estrutura de alta resolução de complexos proteína-ligante, o cryoEM pós-revolução^{de resolução 11} ganhou impulso, conforme indicado pelo aumento de mapas de potencial de Coulomb ou mapas de cryoEM depositados no Banco de Dados de Microscopia Eletrônica (EMDB) ^{12 , 13} nos últimos anos¹⁴ . Devido aos avanços nos métodos de preparação de amostras, imagens e processamento de dados, o número de depósitos do Protein Data Bank (PDB)¹⁴ empregando crioEM aumentou de 0,7% para 17% entre 2010 e 2020, com aproximadamente 50% das estruturas relatadas em 2020 sendo determinadas com resolução de 3,5 Å ou melhor^15,16. O CryoEM tem sido rapidamente adotado pela comunidade de biologia estrutural, incluindo a indústria farmacêutica, pois permite o estudo de macromoléculas biológicas flexíveis e não cristalinas, especialmente proteínas de membrana e complexos multiproteicos, em resolução quase atômica, superando o processo de cristalização e obtendo cristais bem difrativos necessários para a determinação da estrutura de alta resolução por DRX.

A modelagem precisa do ligante no mapa cryoEM é fundamental, pois serve como um modelo do complexo proteína-ligante em nível molecular. Existem várias ferramentas automatizadas de construção de ligantes usadas na cristalografia de raios-X que dependem da forma e topologia da densidade do ligante para ajustar ou construir o ligante na densidade de elétrons 17,18,19,20. No entanto, se a resolução for inferior a 3 Å, essas abordagens tendem a produzir resultados menos desejáveis porque as características topológicas das quais dependem para reconhecimento e construção tornam-se menos definidas. Em muitos casos, esses métodos se mostraram ineficazes na modelagem precisa de ligantes em mapas cryoEM, pois esses mapas foram determinados na faixa de resolução baixa a média, normalmente entre 3,5 Å-5 Ź⁷.

A primeira etapa na determinação da estrutura 3D de um complexo proteína-ligante por cryoEM envolve a co-purificação do ligante com a proteína (quando o ligante tem uma alta afinidade de ligação com a proteína) ou a incubação da solução proteica com o ligante por um período específico antes da preparação da grade. Posteriormente, um pequeno volume de amostra é colocado em uma grade TEM perfurada limpa por plasma, seguida de congelamento instantâneo em etano líquido e, finalmente, imagem com um crio-TEM. As imagens de projeção 2D de centenas de milhares a milhões de partículas individuais são calculadas para reconstruir um mapa de potencial de Coulomb tridimensional (3D) da macromolécula. Identificar e modelar ligantes e moléculas de solvente nesses mapas apresenta desafios significativos em muitos casos devido à resolução anisotrópica em todo o mapa (ou seja, a resolução não é uniforme em toda a macromolécula), flexibilidade na região onde o ligante está ligado e o ruído nos dados. Muitas das ferramentas de modelagem, refinamento e visualização que foram desenvolvidas para XRD estão agora sendo adaptadas para uso em cryoEM para os mesmos propósitos 18,19,20,21. Neste artigo, é apresentada uma visão geral de vários métodos e softwares usados atualmente para identificar ligantes, construir modelos e refinar as coordenadas derivadas do cryoEM. Um protocolo passo a passo foi fornecido para ilustrar os processos envolvidos na modelagem de ligantes usando complexos proteína-ligante específicos com resolução e complexidade variadas.

A primeira etapa na modelagem de ligantes em mapas cryoEM inclui a identificação da densidade de ligantes (não proteica) no mapa. Se a ligação do ligante não induz nenhuma mudança conformacional na proteína, então o cálculo de um mapa de diferença simples entre o complexo proteína-ligante e a apo-proteína destaca essencialmente as regiões de densidade extra, sugerindo a presença do ligante. Tais diferenças podem ser observadas imediatamente, pois requer apenas dois mapas, e mesmo mapas intermediários durante o processo de refinamento 3D podem ser usados para verificar se o ligante está presente. Além disso, se a resolução for alta o suficiente (<3,0 Å), o mapa de diferenças também pode fornecer informações sobre a localização das moléculas de água, bem como dos íons que interagem com o ligante e os resíduos de proteínas.

Na ausência do mapa de apo-proteína, agora é possível usar o Servalcat²², que está disponível como uma ferramenta autônoma e também foi integrado ao pacote de software CCP-EM ^23,24 como parte do refinamento do Refmac e no CCP4 8.0 versão^25,26. O Servalcat permite o cálculo de um mapa de diferença ponderada FSC (Fo-Fc) usando os semimapas não nitidos e o modelo de apoproteína como entrada. O mapa de omitir Fo-Fc representa a disparidade entre o mapa experimental (Fo) e o mapa derivado do modelo (Fc). Na ausência de um ligante no modelo, uma densidade positiva em um mapa Fo-Fc que se sobrepõe ao mapa EM experimental normalmente sugere a presença do ligante. A suposição aqui é que a cadeia de proteínas está bem ajustada no mapa e a densidade positiva restante indica a localização do ligante. No entanto, é importante examinar meticulosamente se a densidade positiva decorre de imprecisões de modelagem, como o rotâmero errado de uma cadeia lateral de proteína.

A segunda etapa envolve a obtenção ou criação de um arquivo de coordenadas cartesianas do ligante com geometria bem definida a partir das informações químicas disponíveis. Os ligantes padrão (por exemplo, ATP e NADP⁺) que já estão disponíveis na biblioteca de monômeros CCP4 podem ser usados para refinamento recuperando os arquivos de coordenadas e geometria por meio de seu código de acesso de monômero. No entanto, para ligantes desconhecidos ou não padrão, várias ferramentas estão disponíveis para criar os arquivos de geometria. Alguns dos exemplos incluem o eLBOW²⁷ - (construtor de ligantes eletrônicos e bancada de otimização) no Phenix²⁸, Lidia - uma ferramenta embutida no Coot²⁹, JLigand / ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-a módulo do Glide dentro da suíte Schrödinger. O arquivo de coordenadas do ligante é então ajustado na densidade, guiado pelo mapa experimental cryoEM e pelo mapa de diferença em Coot. Isso é seguido pelo refinamento do espaço real no Phenix²⁸ ou refinamento recíproco no Refmac³³. É necessária uma estação de trabalho Linux ou um laptop equipado com uma boa placa gráfica e o software mencionado acima. A maioria desses programas está incluída em várias suítes. CCP-EM²⁴ e Phenix²⁸ estão disponíveis gratuitamente para usuários acadêmicos e incluem uma variedade de ferramentas usadas neste artigo, incluindo Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. Da mesma forma, o Chimera³⁷ e o ChimeraX³⁸ fornecem licenças gratuitas para usuários acadêmicos.

Protocol

1. Modelagem de fosfoenolpiruvato (PEP) em enolase de Mycobacterium tuberculosis

1. Identificação da densidade do ligante no mapa crioEM do complexo PEP-enolase
   1. Faça o download dos semimapas não nitidos (emd_30988_additional_1.map e emd_30988_additional_2.map) da apo-enolase a partir dos dados adicionais no EMDB (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Abra o ChimeraX (consulte a Tabela de Materiais). Abra os meios-mapas de apo-enolase clicando em Abrir na barra de ferramentas e selecionando os nomes dos arquivos. Digite vop add #1 #2 na linha de comando para combinar os dois meios-mapas para obter o mapa apo-enolase sem nitidez.
      NOTA: # 1 e # 2 denotam os dois mapas de meia para a enzima apo-enolase, conforme mencionado na etapa 1.1.1.
   3. Renomeie o mapa combinado (ID do mapa ChimeraX: #3) digitando rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Pinte o mapa de cinza no painel do modelo. O mapa indica que a enolase é octamérica na solução com simetria D4.
   4. Repita as etapas 1.1.1-1.1.3 usando os seguintes meios-mapas emd_30989_additional_1.map (ID do mapa: 4) e emd_30989_additional_2.map (ID do mapa: 5) para obter PEP-enolase-unsharpened-map (ID do mapa: #6).
   5. Para calcular um mapa de diferença, primeiro ajuste os dois mapas (mapas sem nitidez PEP-enolase e apo-enolase da etapa 1.1.3 e da etapa 1.1.4) um no outro clicando em Ajustar (mapa no mapa) no painel Mapa (barra de ferramentas) no ChimeraX.
      NOTA: A normalização não é executada entre os dois mapas. Em alguns casos, a normalização pode ser necessária para trazer os mapas para a mesma escala.
   6. Subtraia o mapa PEP-enolase do mapa apo-enolase digitando vop subtract #6 #3 na linha de comando.
      NOTA: # 6 = Mapa sem nitidez da PEP-enolase, # 3 = Mapa sem nitidez da Apo-enolase.
   7. Pinte o mapa subtraído (ID do mapa: 7) em verde, denotando densidade positiva (de acordo com a convenção da cristalografia de raios-X) ³⁹ .
   8. Baixe as coordenadas da enolase octamérica de M. tuberculosis (PDB: 7e4x) do Protein Data Bank (PDB), clique em abrir na barra de ferramentas e selecione o nome do arquivo.
   9. Renomeie o modelo 7e4x.pdb digitando rename #8 Apo_enolase.pdb na linha de comando. # 8 denota o Apo_enolase.pdb em ChimeraX.
   10. Selecione o modelo no painel do modelo. Clique em Botão direito do mouse na barra de ferramentas. Clique em Mover molécula para posicionar o modelo próximo ao mapa de pep-enolase (# 6) e alinhar o modelo em relação ao mapa. Ajuste este modelo no mapa PEP-enolase-unsharpened-digitando fit #8 em #6 na linha de comando. Aqui, o mapa é numerado 6 e o modelo é numerado 8.
       NOTA: Em alguns casos, o ajuste local no ChimeraX pode não ser suficiente para alinhar o modelo. Nesses casos, uma etapa adicional de ajuste global (DockinMap, consulte Tabela de Materiais) pode ser executada no Phenix.
   11. Salve o modelo ajustado digitando save Apo-enolase.pdb #8 na linha de comando.
2. Modelagem e refinamento de PEP no mapa crioEM aguçado do fator B do complexo PEP-enolase
   1. Abra "coot" (consulte Tabela de Materiais) no terminal digitando ./Coot &.
   2. Exiba "Apo-enolase.pdb" clicando em Arquivo > Coordenadas Apo-enolase.pdb. O arquivo de coordenadas é exibido por ligações (cor por átomo).
   3. Baixe o mapa nítido da Enolase ligado a PEP, ou seja, emd_30989.map do EMDB. Exiba o mesmo clicando em Arquivo > Abrir Mapa > emd_30989.map . Defina o limite para 7,00 σ rolando o botão do meio do mouse.
   4. Localize blobs não modelados clicando em Validar > blobs não modelados > Localizar blobs.
   5. Localize a densidade do ligante não modelada perto dos resíduos do sítio ativo, Ser 42, Lys-386 e Arg-364 do modelo enolase.
   6. Obtenha o arquivo de modelo de monômero PEP da biblioteca de monômeros Coot clicando em Arquivo > Obter monômero e inserindo PEP como o código de 3 letras.
   7. Mova a molécula PEP para a densidade usando a opção Girar/Traduzir- Zona/Cadeia/Molécula no menu da barra lateral. Use o refinamento do espaço real no Coot para ajustar a molécula PEP na densidade clicando em Real Space Refine Zone no menu da barra lateral. Mescle o ligante ajustado com o Apo-enolase.pdb usando a opção de molécula de mesclagem na guia de edição . Salve o modelo como PEP-Enolase.pdb.
      NOTA: Também é possível usar a opção de ligante Jiggle-Fit Ligand > para ajustar o ligante também.
   8. Para adicionar ligantes ao restante dos monômeros no arquivo de coordenadas, clique em Calcular > Ferramentas NCS > Ligantes NCS. Uma janela separada chamada Localizar ligantes relacionados ao NCS será exibida. Para a opção Proteína com NCS, selecione o arquivo de coordenadas Apo-enolase.pdb e o ID da cadeia A como Cadeia mestre NCS.
      1. Para a molécula que contém o ligante, selecione o Apo-enolase.pdb como o arquivo de coordenadas e ID da cadeia, J e número do resíduo 1 a 1. Clique em Encontrar Posições Candidatas. Uma janela chamada Ligantes ajustados aparecerá com uma lista de posições candidatas. Avalie o ajuste clicando nos ligantes candidatos individuais e analise o ajuste visualmente.
         NOTA: Em Servalcat/Refmac, apenas um modelo de monômero pode ser fornecido, e a simetria usada na reconstrução pode ser dada para obter um modelo expandido.
   9. Densidade adicional para as moléculas de solvente também foi observada perto do ligante. Estruturas cristalinas de alta resolução da enolase de vários homólogos sugerem a presença de dois íons Mg^{2+ 40,41}, o que provavelmente estabiliza a carga negativa do intermediário da reação. Modele dois íons Mg²⁺ na densidade do local ativo clicando em colocar átomo no ponteiro e selecionando MG na lista de tipos de átomo de ponteiro.
      NOTA: A geometria e a distância da ligação podem ser usadas como guia para selecionar o íon metálico. No caso do Mg²⁺ ligado a átomos de oxigênio em resíduos de proteínas, a distância de ligação varia entre 2,1 Å -2,4 Å, com geometria octaédrica. No entanto, no caso de mapas de baixa resolução, a esfera de coordenação geralmente é incompleta e a distância também pode variar devido a limitações na resolução.
   10. Repita a etapa 1.2.8 para adicionar os íons Mg²⁺ nos monômeros relacionados à simetria.
   11. Salve o modelo clicando em Arquivo > Salvar coordenadas > Selecionar nome do arquivo > e digitando Enolase+PEP+Mg.pdb.
   12. Abra a GUI do Phenix (consulte a Tabela de Materiais). Execute um trabalho de refinamento de espaço real com o Enolase+PEP+Mg.pdb e o emd_30989.map como o modelo de entrada e o mapa, respectivamente, usando parâmetros padrão. Esta etapa é feita iterativamente com o Coot para obter um bom ajuste e geometria do modelo de mapa.
       NOTA: O mapa de diferença não nítida é usado para demonstrar a presença de ligante, como em uma figura. Para fins de modelagem, o mapa nítido do fator B foi usado e é recomendado. O mapa nítido do fator B também pode ser usado para calcular o mapa de diferença para fins de demonstração, em oposição ao mapa sem nitidez. No entanto, se a resolução for menor na região onde o ligante está ligado, o único fator B usado para aumentar a nitidez de todo o mapa pode não revelar claramente a densidade do ligante.
3. Visualização e geração de figuras do ligante modelado
   1. Abra o modelo Enolase+PEP+Mg refinado do trabalho final de refinamento do Phenix no PyMOL⁴² (consulte a Tabela de Materiais) clicando em Arquivo > Abrir e selecionando o nome do arquivo.
   2. Carregue o emd-30989.map (mapa nítido vinculado a PEP) clicando em Arquivo > Abrir e selecionando o nome do arquivo.
   3. Renomeie o mapa como PEP-sharpened clicando em ações > renomear no objeto emd_30989 e digitando PEP-sharpened.
      NOTA: Na maioria dos casos, por exemplo, enolase, os mapas quando abertos no pymol são normalizados, pois a opção normalizar mapa é marcada por padrão no pymol. Como os mapas cryoEM são centralizados em uma caixa maior, a normalização incluirá tudo na caixa. Assim, a normalização pode ser desligada antes da abertura no pilol.
   4. Selecione os ligantes clicando em exibir > sequência.
   5. Digite isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 na linha de comando e pressione Enter.
   6. Pinte o mesh_ligand azul clicando na última caixa, C, ao lado do objeto mesh_ligand.
   7. Exibir os resíduos do sítio ativo, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 e Lys-386 interagindo com a PEP e Mg²⁺ na representação de bastão e esfera, respectivamente, e a enzima enolase na representação de desenho animado.
   8. Ray trace digitando ray 3600, 3600 para gerar imagens de qualidade de publicação e salve como um arquivo png clicando em Arquivo > salvar e escolhendo PEP.png como o nome do arquivo.

2. Modelagem de ligantes no receptor metabotrópico de glutamato mGlu₅

1. Identificando e modelando a densidade do ligante no mapa cryoEM de mGlu ligado a agonistas e antagonistas₅
   1. Baixe os dois meios-mapas junto com seus arquivos de coordenadas correspondentes para cada um dos complexos mGlu₅ ligados ao agonista (EMD-31536, 7fd8.pdb) e ao antagonista ligado (EMD-31537,7fd9.pdb).
   2. Abrir o ChimeraX
      1. Abra o arquivo de coordenadas, 7fd8.pdb clicando em abrir e selecionando 7fd8.pdb.
      2. Digite delete ligand na linha de comando e pressione Enter.
      3. Da mesma forma, use o comando delete/B para excluir a cadeia B.
         NOTA: Ligantes e cadeias podem ser excluídos usando o menu suspenso na parte superior usando selecionar e ações > átomos/ligações > excluir.
      4. Salve o pdb não ligado digitando o seguinte na linha de comando: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 denota o ID do modelo.
      5. Repita as etapas 2.1.2.1-2.1.2.4 para 7fd9.pdb.
   3. Abra o CCP-EM. Crie um novo projeto chamado mGlu₅ e especifique o diretório do projeto e o nome de usuário.
      1. Abra o Relion nas opções do painel esquerdo.
         1. Vá para a guia Criação de máscara .
         2. Forneça um dos semimapas para EMD-31536 como entrada.
            NOTA: O Relion aceita mapas com .mrc como sufixo e os mapas EMD têm o sufixo .map. Os arquivos de mapa podem ser abertos no ChimeraX para exame e salvos no formato .mrc.
         3. Na guia máscara , forneça o tamanho do pixel como 0,89 Å e o limite de binarização inicial como 0,007.
         4. Execute o trabalho com o alias 31536 (ou qualquer outro nome que seja fácil de seguir).
         5. Da mesma forma, crie uma máscara para o meio mapa EMD - 31537.
      2. Abra o programa Refmac Servalcat nas opções do painel esquerdo do CCPEM.
         1. Forneça o nome como mGlu₅_agonist.
         2. Importe o arquivo .pdb 7fd8_noligand_chainA conforme descrito na seção 2.1.2.4 do modelo. Forneça a localização dos dois mapas da metade e a máscara correspondente criada no Relion.
         3. Especifique a resolução como 3.8 Å.
         4. Vá para as configurações de refinamento > Simetria estrita e mencione C2 como a simetria do grupo de pontos de Relion.
         5. Inicie o programa pressionando o botão Iniciar na parte superior.
   4. Assim que o trabalho for concluído, abra o resultado no Coot (opção disponível na parte superior da seção de resultados). Isso exibirá um diffmap.mtz em Coot por padrão, onde as cores vermelho e verde indicam densidades negativas e positivas, respectivamente.
      1. Vá para Gerenciador de exibição > propriedades do mapa de diferenças denominado DELFWT PHDELWT e altere o nível de contorno para 4.0 (valor absoluto).
         NOTA: A escolha do limite depende do mapa e da resolução.
      2. Oculte o mapa rotulado FWT PHWT e a molécula rotulada refined.pdb.
      3. Mova o mapa usando o mouse para visualizar a densidade positiva (colorida de verde) e traga a bolha maior para o centro.
      4. Vá para Arquivo > Obter monômero, digite QUS e pressione Enter.
      5. Vá para Calcular > molécula de modelagem > ajuste de corpo rígido e clique duas vezes no monômero QUS para ajustar a molécula para caber na densidade Fo-Fc.
      6. Use a opção mesclar molécula na guia de edição para adicionar a molécula QUS ao arquivo de coordenadas, refined.pdb.
      7. Repita as etapas 2.1.4.3-2.1.4.6 para ajustar o ligante com o código de monômero NAG e CHS na bolha menor no domínio extracelular e no topo do domínio transmembrana, respectivamente.
      8. Salve a coordenada como refined_ligands.pdb.
         NOTA: A resolução do domínio transmembrana (TM) é menor e, portanto, não é discutida aqui.
2. Refinamento da estrutura ligante mGlu₅
   1. Abra o CCPEM e clone o trabalho de refinamento anterior (etapa 2.1.3.2) e execute-o com o refined_ligands.pdb e o mapa afiado (emd. 31536.mrc) como entrada, usando parâmetros padrão e simetria C2.
      NOTA: Se o programa não reconhecer o ligante, os arquivos CIF precisarão ser fornecidos. Esses arquivos CIF podem ser baixados do PDB ou gerados usando vários programas (consulte a etapa 3.1.1 para obter detalhes).
3. Visualização e geração de figuras no PyMOL
   1. Abra o modelo refined_expanded.pdb do trabalho de refinamento Refmac mais recente no PyMOL.
   2. Vá para Arquivo > Abrir e navegue até o diretório de tarefas Refmac para carregar o arquivo diffmap_normalised_fofc.mrc (mapa de diferenças da tarefa Servalcat na etapa 2.1.3.2).
      NOTA: Se os arquivos de extensão .mrc não estiverem visíveis durante a navegação, altere o tipo de arquivo para todos os arquivos e navegue.
   3. Selecione os ligantes usando a sequência de > de exibição.
   4. Vá para o botão Ações e renomeie a seleção como ligantes.
   5. Digite o seguinte na linha de comando e pressione Enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      NOTA: A largura da malha pode ser ajustada. Aqui, a largura da malha de 0,2 é usada e isso é definido usando o seguinte comando: set mesh_width=0,2.
   6. Clique com o botão direito do mouse em um dos monômeros e vá para encadear > cor para especificar a cor de cada monômero. Pinte o ligante e a malha usando a última caixa rotulada como c nos objetos ligante e mesh_ligands. O dímero do receptor mGlu₅ é mostrado em representação de desenho animado, e os monômeros são coloridos em azul-petróleo e trigo. Os ligantes são mostrados em bastão, e a malha que contorna os ligantes é colorida de verde.
   7. Use as ações > opção orientar/centralizar/zoom contra os objetos e ajuste manualmente para visualizar a malha com clareza. Selecione os resíduos próximos que podem estar interagindo com o ligante, por exemplo, Tyr64, Trp100 para QUS e, conforme necessário, exiba sua cadeia lateral ou cadeia principal ou ambas como representação de bastão.
   8. Ray trace para gerar imagens de alta resolução e salvá-las como um arquivo png.
      NOTA: As etapas acima são repetidas para o mapa vinculado ao antagonista EMD-31537 e o arquivo de coordenadas correspondente PDB-7fd9.

3. Modelando o inibidor, desoxigalacto-nojirimicina (DGN) e moléculas de solvente em um mapa nítido de alta resolução de β-galactosidase

1. Identificação do ligante, DGN, utilizando os meios-mapas do cryoEM
   1. Preparação de dicionário de ligantes desconhecidos para modelagem [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      NOTA: O arquivo do dicionário Deoxygalacto-nojirimycin está incluído na biblioteca de monômeros CCP4 como DGJ (ID do ligante de 3 letras). No entanto, aqui é considerado como um ligante novo e desconhecido para ilustrar o processo de geração de arquivos de dicionário para ligantes desconhecidos, DGN é usado como o código de 3 letras.
      1. Abra o resumo do composto para desoxigalacto-nojirimicina (DGN) na página do PubChem e copie a string de sorrisos para o composto desoxigalacto-nojirimicina.
      2. Abra os ligantes Phenix > > eLBOW.
      3. Especifique a string de sorrisos como entrada.
      4. Especifique o método de otimização de construção de ligante apropriado. Aqui, a otimização simples é usada.
      5. Cole a string de sorrisos químicos na seção de definição de ligante.
      6. Forneça um cargo, um prefixo do arquivo de saída e um ID do ligante adequadamente e pressione executar.
         NOTA: A saída do trabalho contém um arquivo de coordenadas, DGN.pdb, e um arquivo de dicionário, arquivo DGN.cif. O Jligand²⁹ também pode ser usado para criar o arquivo cif.
   2. Baixe o arquivo de coordenadas da β-galactosidase (6tsh.pdb) do PDB e remova as coordenadas das cadeias de proteínas (B, C, D), ligante, DGN e outras moléculas de solvente usando um editor de texto ou exclua a opção de cadeia/zona no Coot. Salve o arquivo de coordenadas como apo-betaGal_chainA.pdb.
      NOTA: ChimeraX ou Pymol também podem ser usados para remover a molécula de ligante/solvente.
   3. Baixe os meios-mapas (emd_10563_half_map_1.map e emd_10563_half_map_2.map) a partir de dados adicionais da entrada EMD-10563 do EMDB.
   4. Abra o CCPEM e use o Relion para criar a máscara para o mapa em um limite de 0,01 (conforme descrito nas etapas 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
   5. Execute o Servalcat (dentro do pacote CCPEM, conforme descrito na etapa 2) com os semimapas obtidos na etapa 3.1.3 e o modelo apo na etapa 3.1.2 e simetria D2.
      NOTA: O modelo deve ser alinhado a um dos semimapas ou mapas completos para localizar a densidade do ligante. Isso pode ser feito ajustando o modelo ao mapa usando o ChimeraX e, em seguida, salvando as coordenadas relativas ao meio mapa. Neste exemplo, os meios-mapas e o mapa primário no EMDB têm diferentes tamanhos/grades de caixa, e o modelo precisa ser colocado no meio-mapa.
   6. Galeirão aberto.
      1. Abra DGN.cif para o dicionário de ligantes conforme gerado na etapa 3.1.1 com o Phenix eLBOW. Isso é feito acessando Arquivo > Importar dicionário CIF e navegando no diretório de tarefas do eLBOW.
      2. Abra os arquivos de coordenadas de proteína e ligante, apo-betaGal_chainA.pdb da etapa 3.1.2 e DGN.pdb da etapa 3.1.6, respectivamente.
      3. Abra automaticamente o arquivo diffmap.mtz da tarefa Servalcat (etapa 3.1.5) e visualize o mapa rotulado DELFWT PHDELWT em Coot. Contorne o mapa em um limite de ~ 4 valor absoluto.
         NOTA: É importante verificar as estatísticas do mapa digitando header map.mrc ou usando as ferramentas do Chimera. Todas as informações necessárias sobre o tamanho do pixel, tamanho da caixa, densidade mínima, média e máxima e desvio rms da densidade média podem ser obtidas. É crucial verificar o tamanho do pixel e o tamanho da caixa dos mapas cryoEM. O mapa 3D representa o volume do mapa proteína-ligante em uma grade de voxels 3D. Em cada voxel, o valor potencial do elétron ou a probabilidade de encontrar o elétron naquele local é armazenado. Quando um determinado limite é escolhido, os voxels, que têm uma densidade menor que o valor especificado, são definidos como zero. Isso ajuda a minimizar o ruído experimental no mapa e visualizar melhor os recursos do mapa⁴³. Assim, o mapa deve ser contornado em um limite onde as feições do mapa sejam facilmente visíveis e o ruído no mapa seja mínimo.
      4. Vá para Ligante > encontre Ligantes. Na nova janela exibida, selecione o ligante, o mapa de diferenças e o modelo apo-betaGal_chainA.pdb. Deixe as outras opções em suas configurações padrão e clique em Localizar ligantes para iniciar a pesquisa.
      5. Uma lista dos principais resultados mostrando a densidade potencial do ligante é exibida com uma cópia colocada em cada uma das densidades. Verifique manualmente todos os acertos onde o ligante foi colocado. Mantenha os acertos mais prováveis e remova os ambíguos.
         NOTA: A diferença na densidade do mapa em um limite alto sugere claramente a presença do ligante no sítio ativo.
2. Modelando o ligante DGN e as moléculas de solvente
   1. Execute um refinamento de espaço real em Coot para ajustar o ligante (DGN.pdb) no mapa de densidade de diferença e, em seguida, mescle as coordenadas do ligante com o apo-betaGal_chainA.pdb e salve-o como betaGal_chainA+ligand.pdb.
      NOTA: Os ligantes que foram colocados em regiões de outras cadeias podem ser removidos e não são mesclados ao salvar o arquivo de coordenadas mesclado. Os ligantes em outras cadeias podem ser gerados por ligantes NCS, conforme mostrado no exemplo 1, etapa 1.2.8, ou em Refmac/Servalcat usando expansão de simetria.
   2. Execute outro trabalho Servalcat como acima (etapa 3.1.5) com betaGal_chainA+ligand.pdb como modelo de entrada e os meios-mapas (da etapa 3.1.3) com simetria D2.
   3. A densidade de diferença (do trabalho Servalcat na etapa 3.2.2) ao redor do ligante modelado sugere a presença das moléculas de solvente em coordenação com a molécula do ligante. A densidade central próxima ao ligante parece ser grande demais para moléculas de água.
   4. Com base em dados bioquímicos e estruturais anteriores indicando a presença de Mg²⁺ nessa posição, o íon Mg²⁺ é modelado aqui clicando na opção colocar átomo e especificando o átomo como MG.
   5. Modele as moléculas de água na densidade de diferença no sítio ativo que indicam a presença da molécula de solvente clicando no átomo de lugar no ponteiro e selecionando água.
      NOTA: Coot também tem a opção de escolher moléculas de água automaticamente. Aqui, como o foco está apenas no sítio ativo, as moléculas de água são adicionadas manualmente.
   6. Mescle as coordenadas para Mg²⁺ e água com o arquivo betaGal+ligand.pdb e salve-o como betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
   7. Com o betaGal+ligante+solvent_chainA.pdb, execute o refinamento Refmac no Servalcat com simetria D2.
      NOTA: O mapa de diferença de saída deste trabalho pode servir como um meio de validar se o ligante foi modelado com precisão, pois o mapa de diferença deve mostrar densidade residual positiva ou negativa mínima.
3. Visualização e geração de figuras com PyMOL
   NOTA: As etapas descritas abaixo fornecem alguns exemplos de como fazer figuras usando modelos e mapas que podem ser usados para ilustrar a presença de ligantes e solventes.
   1. Abra o refined_expanded.pdb do último trabalho do Servalcat (etapa 3.2.6) com o ligante e o solvente modelados.
   2. Selecione cadeias diferentes separadamente para colori-las magenta, amarelo, verde e azul-petróleo, conforme descrito no exemplo 2.
   3. Vá para Exibir sequência >, faça seleções separadas para as moléculas de água, magnésio e DGN e renomeie os objetos como água, MG e DGN, respectivamente.
   4. Exiba MG e moléculas de água como esferas selecionando os objetos, clicando com o botão direito do mouse e mostrando > esfera. Da mesma forma, exiba o ligante na representação do bastão e pinte os ligantes e solventes adequadamente. Nesse caso, o ligante foi colorido de amarelo por um heteroátomo, o íon de magnésio é de cor roxa e as moléculas de água são de vermelho.
   5. Selecione DGN, MG e moléculas de água. Clique com o botão direito do mouse e selecione ações > copiar para o objeto e nomeá-lo como ligantes.
   6. Abra o diffmap_normalised_fo.mrc da tarefa Servalcat na etapa 3.2.6 e renomeie como ligand_fo.mrc. Digite o seguinte comando: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      NOTA: A opção de entalhe de 2 Å é aplicada ao redor dos átomos e, dependendo da resolução e qualidade dos mapas, valores de 3-5 podem ser usados. Além disso, ao abrir mapas cryoEM no PyMOL, é aconselhável desativar normalize_ccp4_maps.
   7. Use as ações > opções de orientação/zoom e ajuste manualmente para visualizar os ligantes e resíduos de interação próximos (quando aplicável), conforme mostrado na etapa 2.3.7.
   8. Ray trace essas cenas para salvar imagens de alta resolução usando o comando ray 3600, 3600.
   9. Salve a cena como .png arquivo.
      NOTA: As etapas a seguir são opcionais e descrevem o processo para visualizar (1) a densidade de diferença (Fo-Fc) para o ligante não modelado, DGN, (2) a densidade (Fo) do ligante modelado, DGN, bem como a densidade de diferença (Fo-Fc) para solventes não modelados e, por último, para (3) a densidade (Fo) para o ligante modelado, DGN e as moléculas de solvente no sítio ativo.
   10. Para demonstrar a presença do ligante, DGN e moléculas de solvente circundantes usando o mapa de diferenças, abra diffmap_normalised_fofc.mrc do trabalho Servalcat na etapa 3.1.5. Renomeie o arquivo de mapa como unliganded_fofc.mrc clicando em ações > renomear ao lado do objeto de mapa. Digite o seguinte na linha de comando: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
   11. Para demonstrar a densidade do ligante modelado, DGN, e a densidade de solvente não modelada circundante, abra o diffmap_normalised_fo.mrc e o diffmap_normalised_fofc.mrc do trabalho servalcat na etapa 3.2.2. Renomeie o diffmap_normalised_fo.mrc como DGN_fo e o diffmap_normalised_fofc.mrc como DGN_unmodelled_solvents_fofc.
   12. Selecione MG e água em Exibir sequência >, clique com o botão direito do mouse e selecione ações > copiar para o objeto e nomeie-as como solventes.
   13. Digite o seguinte na linha de comando: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solventes, level=6, carve=2.
       NOTA: O mesh_DGN_fo mostrará a densidade do ligante e o mesh_solvent_fofc mostrará a densidade omitida para o MG e a água.
   14. Finalmente, para visualizar os ligantes modelados, bem como as moléculas de solvente circundantes no sítio ativo, abra o diffmap_normalised_fo.mrc do trabalho Servalcat na etapa 3.2.6 e renomeie-o como ligand_fo.mrc.
   15. Digite o seguinte na linha de comando: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       NOTA: Aqui, usamos diffmap_normalised_fo.mrc, mas o mapa final nítido pode ser usado para mostrar a densidade dos ligantes e os resíduos circundantes. É uma boa prática mencionar o tipo de mapa usado, valores de nitidez do fator B na legenda da figura.
   16. A largura da malha e o tamanho da esfera podem ser definidos digitando os seguintes comandos: set mesh_width=0.2 e set sphere_scale=0.25 para diminuir o tamanho da esfera.
   17. Pinte a malha fo azul e a malha fofc verde.
   18. Use as ações > opções de orientação/zoom e ajuste manualmente para visualizar os ligantes e resíduos de interação próximos (quando aplicável), conforme mostrado na etapa 2.3.7.
   19. Ray trace essas cenas para salvar imagens de alta resolução usando o comando ray 3600, 3600.
   20. Salve as cenas individuais como arquivos .png.

4. Efeito da resolução na modelagem de ligantes na β-galactosidase

1. Abra o Terminal e vá para o diretório que contém os dois meios-mapas.
2. Abra os dois meios-mapas (etapa 3.1.3) no formato .map no ChimeraX, visualize-os e salve-os como emd10563_half1_1_unfil.mrc e emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. A máscara criada na etapa 3.1.4 pode ser usada como entrada.
4. Execute um trabalho de pós-processamento no Relion usando meios-mapas e máscaras das etapas 4.2 a 4.3, com os parâmetros padrão.
5. Repita a etapa 4.4, agora com um Skip FSC-weighing habilitado e especificando um filtro passa-baixa ad-hoc de 3 Å.
6. Repita a etapa 4.4 com um filtro passa-baixo ad-hoc de 3.5 Å.
7. Abra os mapas (postprocess.mrc) das etapas 4.4-4.6, filtre em diferentes resoluções e a coordenada do modelo, 6tsh.pdb (alinhado aos meios-mapas no ChimeraX) arquivo da etapa 3.1.2 no PyMOL. Renomeie os diferentes mapas como 3.0, 3.5 e 2.3, conforme definido por suas resoluções.
   NOTA: Pode-se confirmar a filtragem passa-baixa dos mapas visualizando-os em ChimeraX ou Coot.
8. Visualize o efeito da resolução na densidade das moléculas de ligante e solvente criando uma malha de 2 Å ao redor das moléculas de ligante e solvente em um limite de 6σ, conforme descrito na etapa 3.3.6, com mapas filtrados para diferentes resoluções.

Results

Exemplo 1
A enzima enolase de M. tuberculosis catalisa a penúltima etapa da glicólise e converte 2-fosfoglicerato em fosfoenolpiruvato (PEP), que é um intermediário essencial para várias vias metabólicas^44,45. Os dados de CryoEM para as amostras de apo-enolase e enolase ligada a PEP foram coletados com o mesmo tamanho de pixel de 1,07 Å, e o processamento da imagem foi realizado com Relion 3.1 ^46,47. As estruturas da apo-enolase e da PEP-enolase foram determinadas a 3,1 Å e 3,2 Å, respectivamente⁴⁸. Os mapas e modelos foram depositados no EMDB e PDB^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x e PDB-7e51). O mapa crioEM da enzima mostra que ela é um octâmero na solução (Figura 1A). Para identificar a densidade do ligante no mapa de PEP-enolase, foram selecionados os mapas não nitidos da apoenzima e da enzima ligada à PEP, e um mapa de diferença foi calculado no ChimeraX, subtraindo-se o mapa de PEP-enolase do mapa de apoenzima. Observou-se uma densidade distinta (verde) em um limiar alto, o que sugeriu a presença do ligante (Figura 1B). A modelagem da cadeia de proteínas no mapa não nitido indicou claramente que a densidade extra está presente no sítio ativo da proteína (Figura 1C). O ligante, PEP, foi então modelado no mapa aguçado do fator B usando Coot, e o modelo proteína + ligante foi refinado no espaço real com Phenix. Dois íons Mg²⁺ foram modelados na densidade observada nas proximidades do ligante (Figura 1D). O ligante, PEP, adota uma orientação semelhante à observada em outros homólogos de enolase, e vários resíduos de sítios ativos, como Lys-386, Arg-364, formam interações de ligações de hidrogênio com o ligante PEP. Os íons Mg²⁺ formam ligações de coordenação metálica com Asp-241, Glu-283, Asp-310 e o fosfato de PEP (Figura 1D).

Exemplo 2
Na ausência de uma estrutura apo-proteica disponível ou se a proteína sofrer uma grande mudança conformacional, não é possível calcular os mapas de diferença conforme descrito acima. Em 2021, o grupo de Garib Murshudov no Laboratório de Biologia Molecular de Cambridge apresentou o Servalcat²², que implementa um fluxo de trabalho de refinamento usando o Refmac e também calcula um mapa de diferenças Fo-Fc após o refinamento. Uma densidade de diferença Fo-Fc positiva sugere a presença de moléculas/ligantes que não foram incluídos no modelo durante o refinamento, essencialmente um mapa omitido. No entanto, recomenda-se primeiro avaliar o ajuste do modelo ao mapa em geral e, em seguida, avaliar o mapa de densidade de diferença.

Para ilustrar o uso de Servalcat/Refmac, foi escolhido o mGlu₅, um receptor acoplado à proteína G dimérica que se liga ao neurotransmissor, o L-glutamato. Após a ligação do agonista, L-quisqualato, o domínio extracelular se reorienta, o que desencadeia a rotação do 7TM, aproximando-o para estabilizar o estado ativado. Assim, há uma grande mudança conformacional observada entre o apo / antagonista vs. estados ligados ao agonista⁵¹ (Figura 2A e Figura 2E). Os dois meios-mapas para os complexos ligados ao agonista (EMD-31536) e ao antagonista (EMD-31537) foram obtidos do EMDB, e os mapas cryoEM mostram resolução variada em toda a molécula e domínio extracelular melhor resolvido. Posteriormente, estes foram utilizados como entradas no Servalcat junto com a apo-proteína como modelo para calcular a diferença ou mapa Fo-Fc para cada conjunto de dados. Este mapa mostrou distintamente a presença de várias moléculas ligantes (não proteicas). A resolução estimada pelo FSC (correlação da camada de Fourier) para os complexos ligados ao agonista e ao antagonista foi de 3,8 Å e 4,0 Å, respectivamente. No caso do mGlu₅ ligado ao agonista, o mapa de diferença Servalcat Fo-Fc mostrou a presença tanto do agonista (L-quisqualato) (Figura 2B) quanto da N-AcetilGlucosamina (NAG) (Figura 2C) no ECD do receptor (devido à menor resolução do TMD, aqui focamos apenas no ECD e no topo do TMD). Resíduos de proteínas, incluindo Tyr-64, Trp-100, Ser-151 e Thr-175, são vistos interagindo com o agonista. A densidade próxima ao resíduo de Asn-210 sugeriu a presença de N-acetil glucosamina (Figura 2C). Uma densidade consistente com hemisuccinato de colesterol, que foi adicionado durante a purificação de mGlu_5, foi observada perto do topo da hélice transmembrana 1 (Figura 2D). Como a resolução é moderada e o ligante, L-quisqualato, pode ser colocado em diferentes orientações, a estrutura prévia do domínio extracelular com o ligante (PDB-6N50) foi utilizada como guia para modelar o ligante. A ligação do antagonista estabiliza o estado aberto ou de repouso do receptor (Figura 2E). Uma densidade consistente com o antagonista LY341495 foi observada na dobradiça do lobo I e do lobo II do domínio da armadilha para moscas no ECD. O antagonista interage com resíduos semelhantes aos do agonista. A interação de empilhamento entre Tyr-223 no lobo II com o antagonista estabiliza o receptor em um estado aberto (Figura 2F). Semelhante à estrutura agonista, glicosilação ou presença de porção N-acetilglucosamina foi observada perto de Asn-210 (Figura 2G).

Exemplo 3
O terceiro exemplo elucida o protocolo para modelar ligantes e moléculas de solvente de tamanho fragmentado ou pequeno em mapas CryoEM de alta resolução. A descoberta de medicamentos baseada em fragmentos (FBDD) emergiu como um método poderoso e inovador no desenvolvimento de novas terapias baseadas em alvos em várias áreas de doenças, tornando-se um caminho promissor em P&D farmacêutico^52,53. O FBDD começa com a triagem e seleção cuidadosa de fragmentos pequenos, altamente solúveis e de baixo peso molecular de moléculas que se ligam a proteínas-alvo específicas ou biomoléculas de interesse. A determinação das estruturas desses complexos proteína-fragmento revela o modo de ligação desses fragmentos, que serve como um guia para projetar moléculas maiores e mais complexas semelhantes a drogas com crescente afinidade e especificidade em relação à proteína alvo⁵⁴. No entanto, este método exige uma densidade de ligante de alta resolução para determinar com precisão a pose e posicionar corretamente os grupos funcionais do ligante¹⁵.

A β-galactosidase, uma das primeiras estruturas de alta resolução a ser determinada a partir dos avanços na tecnologia cryoEM, é uma enzima homotetramérica de 450kDa bem estudada que catalisa a hidrólise da lactose em glicose e galactose⁵⁵. Para mostrar o uso de crioEM em FBDD, Astex, Reino Unido, determinou a estrutura da β-galactosidase com um inibidor do tamanho de um fragmento, desoxigalacto-nojirimicina (DGN) ligado no sítio ativo (EMDB-10563, PDB: 6tsh) ⁵⁶ . Este conjunto de dados é usado para ilustrar o protocolo para modelar ligantes e solventes de forma inequívoca em mapas de alta resolução. Para mostrar o efeito da resolução na modelagem e visualização do ligante, os mapas foram filtrados para 3,0 Å e 3,5 Å na etapa de pós-processamento no Relion. Isso destaca a qualidade da densidade do mapa em diferentes resoluções e ressalta a necessidade de maior resolução para modelar ligantes e solventes.

A enzima é um tetrâmero com simetria D2 em solução (Figura 3A). O mapa de diferença (entre o mapa e o modelo), calculado por Servalcat, sugeriu a presença de DGN e várias moléculas de solvente no sítio ativo da enzima (Figura 3B). Com uma resolução estimada de 2,3 Å, a densidade apresentou características de alta resolução, o que auxiliou na modelagem precisa do inibidor no sítio ativo da proteína. Foram observadas interações entre DGN e Tyr-503 e His-540 (Figura 3C). A densidade de diferença também sugeriu a presença de moléculas de solvente que interagem com DGN, bem como os resíduos de proteínas. Mg²⁺ e várias moléculas de água foram modeladas na densidade (Figura 3D). Ligações de coordenação de metais entre Mg²⁺ e Glu-416, Glu-461 e várias moléculas de água são observadas (Figura 3D). Mg²⁺ foi visto interagindo com DGN por meio de uma molécula de água.

Em uma resolução mais baixa de 3,5 Å e 3,0 Å, a densidade do ligante se assemelha a uma bolha e carece de recursos de alta resolução cruciais para a modelagem precisa do ligante ( Figura 4A , B ). A densidade das moléculas de água era quase inexistente nessas resoluções. Em resumo, com o aumento da resolução, especialmente superior a 3,0 Å, a densidade possibilitou a modelagem de um maior número de moléculas de água (Figura 4C,D). O posicionamento correto do centro quiral do ligante tornou-se alcançável em ~ 2,3 Å ( Figura 4C, D ) devido à presença de características distintas no mapa que guiaram a colocação, bem como a modelagem de moléculas de água e Mg²⁺. Em comparação, a densidade para Mg²⁺ permaneceu discernível em toda a faixa de resolução (Figura 4A-C).

Figura 1: Modelando o ligante fosfoenolpiruvato em M. tuberculosis enolase. (A) mostra o mapa nítido do fator B da enzima enolase ligada à PEP. O mapa sugere que a enolase é octamérica em solução, e cada monômero no mapa é colorido de forma diferente. (B) exibe um mapa crioEM não agudo da enzima apo-Enolase em cinza com o mapa de diferença (entre os mapas ligados a PEP e apo-Enolase não aguçados) sobreposto em verde, sugerindo a presença de ligante, PEP. Este é um mapa de demonstração para mostrar a presença de ligantes. (C) exibe o ajuste do modelo de enolase no mapa crioEM não nitido, destacando a posição da densidade da diferença em relação à proteína. O modelo de proteína é mostrado em representação de desenho animado e colorido em Chainbow. Esta figura mostra que a densidade extra (verde) está presente no sítio ativo de cada monômero. (D) mostra o ligante, PEP, envolto no mapa nítido do fator B, colorido em azul. Além disso, também foi observada densidade para dois íons Mg²⁺, que formam ligações de coordenação de metal com vários resíduos do sítio ativo, incluindo Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 e átomos de ligante. O ligante faz interações de ligação de hidrogênio com Lys-386, Lys-335 e Arg-364. Os resíduos de proteína são mostrados na representação do bastão e os íons Mg²⁺ são mostrados como esferas roxas. As figuras em painéis (A-D) foram geradas com Pymol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Identificação, modelagem e visualização de vários ligantes no receptor mGlu₅ . Os mapas de omitir Fo-Fc foram obtidos usando Servalcat. (A) mostra a estrutura do dímero do receptor mGlu₅ (PDB-7fd8) em representação de desenho animado, com cada monômero colorido em azul-petróleo e trigo, respectivamente, e ligado ao agonista L-quisqualato. Todos os ligantes que foram identificados no domínio extracelular e no topo do domínio transmembrana do receptor são envoltos no mapa de omitir Fo-Fc, coloridos de verde e contornados em 6σ. (B) destaca o ajuste do agonista, L-quisqualato envolto no mapa de diferenças. O L-quisqualato interage com vários resíduos de mGlu₅ , incluindo Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 e Gly-280. As interações da ligação H são representadas por traços vermelhos. Em (C), uma densidade adicional é evidente perto de Asn-210, que está presente no domínio extracelular do receptor, e a molécula de N-acetilglucosamina (NAG) foi modelada nessa densidade. Para maior clareza, o NAG não está vinculado ao Asn na figura atual. (D) mostra a diferença na densidade do hemisuccinato de colesterol (CHS) em verde próximo à superfície exposta a lipídios do receptor. A molécula de CHS, representada nos bastões, foi modelada nesta densidade. (E) mostra a estrutura do receptor mGlu₅ (PDB-7fd9) ligada ao antagonista LY341495 na representação de desenhos animados. Em (F), uma densidade extra no mapa de diferença Fo-Fc localizada na dobradiça entre o lobo I e o lobo II do domínio extracelular indica a presença do antagonista. Os principais resíduos (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 e Tyr-223) ao redor do antagonista são mostrados em representações de bastão, e as possíveis interações da ligação de hidrogênio com o antagonista são mostradas em traços vermelhos. (G) mostra a diferença na densidade sugestiva da presença da molécula NAG perto de Asn-210 na estrutura ligada ao antagonista (observe que o NAG não está ligado a Asn para maior clareza). Os números foram gerados com Pymol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Identificação, modelagem e refinamento de um pequeno inibidor e moléculas de solvente no mapa de alta resolução da β-galactosidase (EMD-10563). (A) mostra o modelo de β-galactosidase resolvido para 2,3 Å (PDB: 6tsh) na representação de desenhos animados, onde cada monômero é colorido distintamente. A caixa cinza destaca o local de ligação do ligante. (B) exibe a densidade de diferença Fo-Fc (de Servalcat) em malha verde no sítio ativo da enzima. A diferença de densidade sugere a presença do inibidor (DGN) e de várias moléculas de solvente no sítio ativo. (C) demonstra que, guiado pelo mapa Fo-Fc, o inibidor desoxigalacto-nojirimicina (DGN) é modelado no sítio ativo. Este ligante modelado é representado em formato de bastão e envolto na densidade Fo (por Servalcat), que é colorida em blue_mesh. Interações de ligações de hidrogênio entre DGN e vários resíduos de proteínas, incluindo Tyr-503 e His-540, são observadas. A densidade adicional da diferença Fo-Fc ao redor do ligante (verde) é indicativa das moléculas de solvente. (D) O mapa mostra várias moléculas de solvente, incluindo água e Mg²⁺, representadas como esferas vermelhas e roxas, respectivamente, são modeladas no sítio ativo após garantir que cada molécula de solvente esteja ligada a proteínas (Glu-416, His-418 e Glu-461) ou resíduos de ligantes. As moléculas de água e Mg²⁺ estão envoltas na densidade Fo (malha azul). Mg²⁺ é visto interagindo com o ligante, DGN por meio de uma molécula de água. O mapa Fo-Fc (malha verde) em painéis (B,C) é contornado em 6σ, enquanto a densidade Fo - malha azul em C e D (do refinamento Servalcat após a modelagem) é contornada em 3σ. As figuras em painéis (A-D) foram geradas com Pymol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Efeito da resolução na modelagem de ligantes na β-galactosidase. Semi-mapas do EMD-10563 foram usados como entrada na etapa de pós-processamento do Relion, e os mapas de pós-processamento combinados foram filtrados para resoluções de 2,3 Å, 3,0 Å e 3,5 Å com diferentes fatores B. O mapa mostrado em todos os painéis é contornado em 6σ. Para maior clareza, apenas a estrutura da proteína é mostrada sem cadeias laterais, moléculas de ligante ou solvente nos painéis A, B e C. (A) O mapa é filtrado para 3,5 Å e o sítio ativo da β-galactosidase é mostrado. Uma bolha semelhante ao ligante, DGN, é vista nesta resolução, acompanhada por algumas bolhas menores nas proximidades. Modelar o ligante na orientação correta é um desafio devido à falta de características distintas no mapa. (B) O mapa filtrado para resolução de 3,0 Å é mostrado. Aqui, a bolha do ligante torna-se um pouco mais definida, mas ainda carece de recursos em geral. Mais algumas pequenas bolhas sugestivas de moléculas de solvente também são observadas. (C) O mapa filtrado para resolução de 2,3 Å revela a densidade do ligante com características distintas, revelando notavelmente a conformação da cadeira do iminoaçúcar. Um número significativo de pequenas bolhas correspondentes a moléculas de água é observado nesta resolução. A estimativa/nitidez automática do fator B no pós-processo Relion fornece um valor de -18 Ų para os mapas filtrados para 3 Å e 3,5 Å, enquanto o valor é -52 Ų para o mapa filtrado para 2,3 Å. A nitidez do fator B diferente de mapas EM também pode ser realizada com Coot e útil na construção de modelos. (D) O painel ilustra que o ligante DGN (representação do bastão), Mg²⁺ e moléculas de água (como esferas) conforme modelado no sítio ativo e no mapa afiado a 2,3 Å, mostrado em malha azul ao redor desses átomos. As figuras em painéis (A-D) foram geradas com Pymol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

As melhorias no hardware e software do microscópio resultaram em um aumento no número de estruturas crioEM nos últimos anos. Embora a resolução mais alta alcançada no momento em crioEM de partícula única seja de 1,2 Å 57,58,59, a maioria das estruturas está sendo determinada em torno de 3-4 Å de resolução. A modelagem de ligantes em mapas de média a baixa resolução pode ser complicada e muitas vezes repleta de ambiguidade. Dado o uso generalizado de cryoEM na academia e na indústria farmacêutica para pesquisa translacional e descoberta de medicamentos, é essencial garantir que os ligantes sejam modelados corretamente e sem ambiguidade. Assim, é prudente quantificar a resolubilidade dos átomos de ligantes calculando Q-scores⁶⁰, que agora está disponível no EMDB como uma métrica para avaliar a qualidade dos mapas e o ajuste do modelo, bem como no Chimera.

No primeiro exemplo, o ChimeraX foi usado para calcular o mapa de diferença no espaço real entre o apo e os mapas ligados ao ligante na enzima enolase de M. tuberculosis. A densidade adicional em um limiar alto sugere a presença do ligante, fosfoenolpiruvato, no sítio ativo e Mg²⁺ ligado ao ligante. É importante notar que, neste caso, o mapa é de resolução média (3,2 Å), e as moléculas de água não podem ser modeladas com segurança (Figura 1). A limitação associada a este método é que ele só pode ser aplicado quando a ligação ao ligante não induz mudanças conformacionais significativas na proteína. A normalização do mapa não foi realizada neste caso, uma vez que os conjuntos de dados apo e ligados ao ligante foram adquiridos com o mesmo tamanho de pixel e processados com parâmetros idênticos no Relion. No entanto, vale ressaltar que ao comparar mapas gerados por diferentes programas de reconstrução, como Relion^46,47 e CryoSparc⁶¹, ou com qualidade diferente, a normalização dos mapas torna-se essencial antes que comparações significativas possam ser feitas.

O próximo exemplo é o mGlu₅, que sofre grande reorganização molecular após a ligação do agonista, como fica evidente nas estruturas cryoEM^51,62 (Figura 2). Nesse cenário, não é viável calcular um mapa de diferença simples entre os receptores não ligados (apo) e ligados ao ligante devido a diferenças substanciais entre os mapas. Aqui, foi utilizado o Servalcat, que usa semimapas não nítidos e não ponderados como entrada para refinamento no espaço recíproco e, posteriormente, calcula um mapa de diferença entre o mapa experimental e o mapa derivado do modelo. Em um limiar alto, pode-se visualizar diferenças e atuar como um guia para correção e melhoria do modelo. Várias bolhas não modeladas no domínio extracelular e próximo ao domínio transmembrana de mGlu₅ foram observadas e usadas como um guia para modelar ligantes (Figura 2).

O terceiro exemplo mostra como a resolução (2,3 Å) desempenha um papel crucial na interpretação do mapa e na modelagem de um inibidor do tamanho de um fragmento na β-galactosidase. Aqui, o desafio era identificar um ligante muito pequeno (<200 Da) no mapa de diferenças do Servalcat em meio ao ruído inerente aos dados e modelá-lo com precisão. Além da alta resolução global determinada usando a Correlação de Casca de Fourier (FSC), a resolução local específica do ligante também foi suficientemente alta para garantir o posicionamento preciso dos centros quirais dos ligantes (Figura 3). A densidade das moléculas de solvente foi observada no mapa de diferenças em toda a enzima e especialmente ao redor do ligante. O efeito da resolução na modelagem de ligantes e átomos de solvente também foi demonstrado (Figura 4). É importante ter cuidado ao modelar moléculas de água ou solvente porque, ocasionalmente, o ruído em um limite baixo pode se assemelhar a moléculas de água ou solvente, levando a possíveis interpretações errôneas.

Outra consideração importante é que os mapas cryoEM por si só podem não ser suficientes para identificar com precisão um íon metálico por conta própria. Métodos biofísicos adicionais, como Estrutura Fina de Absorção de Raios-X Estendida (EXAFS) ou Espectroscopia de Raios-X por Dispersão de Energia (EDX), são frequentemente necessários para confirmar a presença e a identidade do íon metálico. Nas enzimas enolase e β-galactosidase, o Mg²⁺ foi modelado devido à riqueza de informações já disponíveis sobre essas proteínas, confirmando a identidade do íon metálico. Além disso, a coordenação dos íons metálicos nesses casos, exemplificada pela geometria octaédrica clássica e as distâncias de coordenação quase ideais de Mg²⁺, forneceram provas substanciais de sua identidade.

Em geral, algumas considerações importantes devem ser levadas em consideração ao modelar ligantes em mapas cryoEM. Para começar, é importante escolher o mapa correto para identificação e modelagem de ligantes. Em todos os casos, um mapa ou meio mapa não nítido e não ponderado é aconselhável em vez de um mapa nítido e ponderado para visualizar a densidade do ligante, pois a nitidez e a ponderação podem resultar em regiões sub-nítidas ou excessivamente acentuadas (ruído devido ao término da série) no mapa. Isso pode resultar em uma densidade de ligante abaixo do ideal, e o uso de diferentes fatores de nitidez do fator B pode ser empregado para avaliar a densidade durante a construção do modelo em Coot. Embora haja um risco em usar o mapa afiado para identificar ligantes em um mapa crioEM, o mapa não afiado pode não mostrar todos os detalhes da densidade do ligante, mas pode ser usado para fins de demonstração, conforme mostrado na Figura 1B, C.

A pose do ligante modelado deve ser validada, especialmente nos casos em que os dados são fracos. Como mostrado aqui para mGlu₅, a resolução local varia em todo o mapa cryoEM, e a modelagem imparcial do ligante pode ser um desafio. O Servalcat pode ser usado como uma ferramenta valiosa para detectar possíveis imprecisões na modelagem de proteínas e ligantes²².

A heterogeneidade composicional pode estar presente em um complexo proteína-ligante onde apenas uma população específica pode ter o ligante presente (se o ligante for de baixo peso molecular, a etapa de classificação pode não remover a heterogeneidade). No entanto, é importante realizar a classificação 3D⁶³ passo iterativamente durante o processamento da imagem antes da modelagem do ligante e verificar se a densidade do ligante melhora. Se várias cópias da proteína estiverem presentes, deve-se ter cuidado ao aplicar simetria no mapa durante a geração e refinamento inicial do modelo, pois isso pode calcular a média da densidade do ligante em todas as moléculas relacionadas à simetria. A simetria só deve ser imposta após o mapa ter sido minuciosamente inspecionado para confirmar a presença de densidade de ligantes em todas as cadeias de proteínas.

Dependendo do estado (cristal ou solução) e da localização (enterrado ou superfície), os átomos podem ser dinâmicos e, no refinamento do modelo, isso é chamado de parâmetro de deslocamento atômico (ADP). Juntamente com o mapa de diferenças, que fornece pistas visuais para possíveis imprecisões no modelo, os valores de ADP podem ser usados para avaliar a precisão dos ligantes após o refinamento 64,65,66,67. Normalmente, o ligante deve ter valores de ADP semelhantes aos resíduos circundantes, ou seja, se eles estiverem ligados de forma estável e modelados com precisão. No entanto, ligantes na periferia ou átomos de um ligante (como lipídios) que estão longe de macromoléculas podem ter valores de ADP mais altos. Além de refinar as coordenadas, tanto o Refmac^33,34 quanto o Phenix permitem o refinamento dos valores de ADP^28,68. Em Refmac, a aproximação de Mott-Bethe é usada para calcular o fator de espalhamento de elétrons de átomos individuais durante o cálculo do mapa. Na versão recente do Phenix, o refinamento individual do fator B, semelhante à cristalografia, foi introduzido para explicar a desordem atômica. Muitas vezes, nos modelos refinados derivados do cryoEM, uma ampla gama de valores de ADP é observada (às vezes valores próximos de zero), e até mesmo o Q-score que é usado no EMDB para avaliar o ajuste do modelo com o mapa depende do mapa primário depositado e da natureza da nitidez do fator B⁶⁰. Na construção de modelos cryoEM, vários mapas são frequentemente usados e, portanto, os mapas usados na modelagem e refinamento devem ser claramente mencionados nos métodos, pois devido à resolução anisotrópica em muitas macromoléculas, um único mapa pode não ser suficiente para explicar todos os detalhes. 

Na modelagem de ligantes em macromoléculas, uma das principais limitações dos mapas cryoEM (como na cristalografia) é que, se o local de ligação do ligante for de baixa resolução ou se o ligante ligado for dinâmico, determinar a conformação correta pode ser difícil. Além disso, a maioria das estruturas crioEM tem resoluções abaixo de 3 Å, e a representação das moléculas de água nos mapas é limitada, dificultando a avaliação do papel da hidratação na ligação de ligantes ou fármacos (como mostrado aqui com os exemplos de enolase e mGluR). Métodos computacionais podem ser usados em combinação com dados crioEM para resolver essas limitações⁶⁹. Em contraste com a cristalografia, apenas o modelo passa por refinamento, não o mapa. Atualmente, o único método para indicar a presença de um ligante ou garantir uma modelagem precisa é gerando mapas omitidos (usando ferramentas como Servalcat). Assim, existem várias ferramentas para ajudar os pesquisadores a construir e avaliar o modelo, mas existem várias áreas no refinamento do modelo em que novas abordagens ou modificações das abordagens atuais podem ser esperadas em um futuro próximo.

Neste artigo, nos concentramos nas abordagens atuais para modelagem de ligantes, que incluem inspeção manual da densidade do ligante, geração do arquivo de geometria do ligante, seguida de modelagem do ligante no mapa cryoEM. Este é um período emocionante na biologia estrutural e na descoberta de medicamentos, pois detectores diretos de elétrons com taxas de quadros mais rápidas e o uso de aquisição de dados mais rápida⁷⁰ resultaram na obtenção de mapas de alta resolução (<2,8 Å) de várias macromoléculas, muitas vezes ligadas a ligantes de moléculas pequenas em um tempo relativamente curto. A recente introdução de ferramentas automatizadas de modelagem de ligantes, como GEMspot⁶⁹ na suíte Schrödinger e EMERALD¹⁷ na suíte Rosetta, que tenta encontrar a pose de ligação mais provável do ligante enquanto leva em consideração os dados experimentais do cryoEM, promete agilizar e automatizar esse processo. Semelhante à cristalografia de raios-X, prevê-se que identificar os modos de ligação de ligantes de moléculas pequenas por cryoEM, talvez dois ou mais em um único dia, se tornará uma possibilidade realista.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consórcio de vários institutos	https://www.ccp4.ac.uk	gratuito para usuários acadêmicos e inclui Coot e lista de ferramentas desenvolvidas para cristalografia de raios-X
CCP-EM	Consórcio de vários institutos	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	gratuito para usuários acadêmicos e inclui Coot, Relion e muitos outros
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	Software geral para construção de modelos, mas também disponível com outras suítes descritas acima
DockinMap (Phenix)	Consórcio de vários institutos	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software dentro da suíte Phenix para acoplamento de modelos em mapas cryoEM
Banco de Dados de Microscopia Eletrônica	Consórcio de vários institutos	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Repositório Público de Mapas de Microscopia Eletrônica
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Comercial, câmera da Thermo Fisher
Phenix	Consórcio de vários institutos	https://phenix-online.org/download	Gratuito para usuários acadêmicos e inclui Banco
Dados de Proteínas	Consórcio de vários institutos	https://rcsb.org	Banco de dados público de estruturas macromoleculares
Pymol	Schrödinger	https://pymol.org/2/	Ferramenta de viusalização molecular. A versão educacional é gratuita, mas vem com limitações. A versão completa pode ser obtida com uma pequena taxa.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software para processamento de imagens cryoEM, também disponível com CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Comercial, cryoTEM da Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, EUA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	Software de uso geral para exibição, análise e muito mais
UCSF Chimera X	UCSF, EUA		https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Software de uso geral para exibição, análise e muito mais