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Artigo de método

Medindo a aprendizagem associativa em quimiotaxia do nematóide Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/66311

⸱

17 de junho de 2025

 ,  , 
1Institute for Mind Brain and Behavior, Faculty of Medicine, HMU Health and Medical University Potsdam

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para testar o aprendizado associativo realizando o condicionamento clássico no organismo modelo C. elegans. O paradigma baseia-se no emparelhamento da concentração de sal no ambiente com a presença ou ausência de alimentos, o que altera sua quimiotaxia para perto ou para longe do sal.

Resumo

Para adaptar seu comportamento, os animais atribuem valência à informação sensorial por meio do aprendizado associativo e atualizam essa associação quando as condições ambientais mudam. As respostas comportamentais de Caenorhabditis elegans ao cloreto de sódio oferecem um paradigma bem definido para investigar os mecanismos que regem a aprendizagem associativa. A exposição de vermes a níveis específicos de NaCl emparelhados com a presença ou ausência de alimentos provoca quimiotaxia em direção ou afastamento dessa concentração de NaCl, respectivamente. A memória associativa é formada em poucas horas e pode ser modificada no mesmo período de tempo ao expor os animais a uma concentração diferente de NaCl.

Aqui, descrevemos como testar a plasticidade comportamental e o aprendizado com base na quimiotaxia do sal de C. elegans . As cepas do ensaio são cultivadas em coortes sincronizadas até atingirem a idade adulta e são então condicionadas por várias horas em placas com diferentes concentrações de NaCl, seja na presença ou ausência de alimento. Os animais são então transferidos para placas de ensaio que contêm regiões de baixa, média ou alta concentração de NaCl e podem rastejar por 30 minutos antes de contar o número de vermes em cada região. Um índice de quimiotaxia é então calculado a partir da distribuição dos vermes na placa. O ensaio pode ser usado para testar o efeito de uma série de fatores que afetam a aprendizagem.

Introdução

Para interagir significativamente com seu ambiente e gerar comportamento adaptativo, os animais precisam interpretar as informações sensoriais que recebem: se uma determinada sugestão sensorial é benéfica ou prejudicial à sua sobrevivência quase sempre não é pré-determinado, mas depende do contexto. Uma tarefa fundamental dos sistemas sensoriais e nervosos é, portanto, atribuir valência à informação ambiental por meio do aprendizado associativo. Alguns estímulos são inerentemente apetitosos, como comida, e outros são inerentemente aversivos, como pistas nociceptivas. Tais estímulos incondicionais (US) podem alterar as respostas a outros estímulos apresentados em conjunto com eles; como resultado, os animais podem desenvolver uma atração ou aversão ao outro estímulo condicionado (CS). Isso é interpretado de tal forma que o CS sinaliza ou prevê a US 1,2,3. O estudo de modelos de aprendizagem associativa é necessário para elucidar os mecanismos genéticos, celulares e fisiológicos subjacentes. No entanto, isso pode ser desafiador devido à necessidade de usar modelos in vivo, à variabilidade do comportamento, ao licenciamento necessário do manejo de animais ou aos prazos muitas vezes longos de treinamento tanto do pesquisador quanto dos animais, e isso geralmente impede que seja realizado por alunos de graduação em um ambiente de pesquisa e, mais ainda, em um ambiente de ensino.

Portanto, os modelos de invertebrados oferecem a oportunidade de realizar ensaios de aprendizagem associativa com alunos de graduação ou mestrado. Os invertebrados não requerem licenciamento de animais para manuseá-los e podem ser econômicos. Um paradigma frequentemente usado para aprendizagem associativa é a aprendizagem de quimiotaxia salina em C. elegans 4,5,6,7,8,9. C. elegans sentem a concentração de cloreto de sódio (NaCl) em seu ambiente e aprendem a associar um determinado [NaCl] com a presença ou ausência de alimento, respectivamente. Geralmente, os animais aprendem a migrar para concentrações de sal que antes eram apresentadas com amplo alimento bacteriano e aprendem a migrar para longe daquelas que eram apresentadas na ausência de alimento bacteriano. O sal é, portanto, o estímulo condicionado, e a comida ou a fome é o estímulo incondicional3. Essa associação é formada em menos de uma hora e é um exemplo de memória associativa de curto prazo. O aprendizado associativo da quimiotaxia de NaCl é modulado, entre outros, pela sinalização de quinase dependente de cálcio/calmodulina (CaMK), sinalização dopaminérgica e insulina/fosfatidilinositol (PI) 3-quinase 5,9,10, o que sugere que envolve sistemas motivacionais e plasticidade sináptica dependente de CaMK e pode operar de maneira semelhante às vias de sinalização que regem o aprendizado associativo em vertebrados.

Em um protocolo estabelecido para aprendizado de quimiotaxia salina, os animais migram em um gradiente espacial de sal em uma placa de ágar criada pela colocação de dois tampões de ágar sem ou com alto teor de sal, respectivamente, na placa7. Esses ensaios são difíceis de realizar de forma quantitativa por alunos de graduação devido à mudança dinâmica na concentração de NaCl na placa de ensaio de quimiotaxia ao longo do tempo e do espaço, porque o NaCl dos plugues se difunde continuamente na placa de ágar. Um ensaio mais fácil de realizar é o uso de placas de quadrantes, onde duas concentrações diferentes de sal (por exemplo, NaCl 25 mM e NaCl 0 mM) são apresentadas e separadas por barreiras plásticas11. No entanto, devido à apresentação de apenas duas concentrações diferentes de NaCl, ele não pode ser usado simultaneamente para avaliar a atração e/ou evitar NaCl reduzido ou aumentado em relação à condição basal. C. elegans é geralmente cultivado em placas NGM (Nematoid Growth Media) na presença de bactérias 50 mM NaCl e E. coli OP5012 e, portanto, forma uma associação positiva dessa concentração de NaCl com alimentos por padrão.

Aqui, apresentamos um protocolo de aprendizado de quimiotaxia salina adaptado que pode ser realizado tanto por pesquisadores quanto por alunos de graduação. Os animais são primeiramente condicionados a diferentes ambientes de NaCl apresentados na presença ou ausência de alimento. Eles são então transferidos para placas de ensaio com uma escolha de concentrações de sal baixas, médias e altas em placas de ágar com câmara Y. Seu aprendizado de quimiotaxia neste cenário pode ser usado para investigar o efeito de vários fatores que o modulam, como genótipo, contextos ambientais ou idade dos animais.

Este protocolo é adaptado a uma aula prática de laboratório de graduação dividida em oito grupos de alunos, com cada grupo de alunos realizando um conjunto de seis medições em cada ponto de tempo experimental (uma medição por condição experimental). No entanto, o protocolo pode ser ajustado para funcionar para um único experimentador ou para qualquer número de grupos/pessoas, com alterações apropriadas nas quantidades de reagentes.

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Protocolo

1. Preparação de placas de crescimento (GP) para sincronizar C. elegans antes do teste de aprendizagem associativa e placas de condicionamento (CP) para induzir a associação [NaCl]-alimento no dia do teste

NOTA: As placas de Petri para crescimento e condicionamento são idênticas às placas padrão de meios de crescimento de nematóides (NGM)12, exceto que a concentração de NaCl variou nas placas 0 mM NaCl CP e 100 mM NaCl CP.

  1. Prepare quatro garrafas de vidro limpas de 500 mL e adicione o seguinte:
    1. Adicione 1,25 g de peptona, 8,5 g de ágar, 487,5 mL de água destilada e um agitador magnético a uma garrafa (para 0 mM NaCl CP);
    2. Adicione 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona, 8,5 g de ágar, 487,5 mL de água destilada e um agitador magnético a cada uma das duas garrafas (para 50 mM de NaCl CP e GP, respectivamente);
    3. Adicione 3 g de NaCl, 1,25 g de peptona, 8,5 g de ágar, 487,5 mL de água destilada e um agitador magnético a uma garrafa (para 100 mM de NaCl CP).
  2. Autoclave as quatro garrafas por 15 min a 121 ° C e, em seguida, deixe as garrafas esfriarem por 30 min a 55 ° C em banho-maria.
  3. Coloque as garrafas (uma de cada vez) em um agitador magnético aquecido. Adicione a cada frasco 12,5 mL de 1 M KPO4 (pH = 6,0 à temperatura ambiente [RT]). Misture bem por 2 min e, em seguida, adicione 0,5 mL de 1 M CaCl2, 0,5 mL de colesterol 5 mg / mL em etanol e 0,5 mL de 1 M MgSO4 (todas as soluções devem ser estéreis). Misture por agitação magnética.
    NOTA: Misturar bem após a adição de KPO4 evita a precipitação de fosfato de cálcio após a adição de CaCl2.
  4. Para cada tipo de placa (0 mM CP, 50 mM CP, 100 mM CP, GP), alíquota 8 mL do respectivo meio para cada placa de Petri de 55 mm x 10 mm em condições quase estéreis (em capela de fluxo ou próximo ao bico de Bunsen).
    NOTA: Aproximadamente 62 placas NGM de cada tipo podem ser feitas a partir desta etapa.
  5. Arrefecer as placas deixando-as em repouso durante cerca de 3 h e conservá-las a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas até à utilização.
  6. Adicione 200 μL de suspensão de E. coli OP50 a cada GP NGM e deixe secar durante a noite a 20 °C em uma incubadora.
    NOTA: As placas podem ser armazenadas em RT por até 1 semana antes de serem usadas.

2. Manutenção de C. elegans e preparação para teste de aprendizagem associativa via postura cronometrada 13 (3 dias antes do ensaio)

NOTA: Uma rodada do ensaio de quimiotaxia no formato sugerido requer pelo menos 24 placas para crescimento (GP), 48 placas para o ensaio (Placas de Ensaio, AP) e 8 placas por grupo de condicionamento (Placas de Condicionamento, CP). Para uma turma dividida em oito grupos de alunos, isso significa que cada grupo de alunos recebe 3 GP, 6 CP e 6 AP - ou seja, 1 CP e 1 AP para cada condição experimental.

  1. Manter C. elegans N2 (var. Bristol) em placas de ágar NGM alimentadas com E. coli OP50 viva a 20 °C. Armazene as placas de cabeça para baixo durante a manutenção para minimizar a perda de umidade das placas.
  2. Transfira 30 adultos jovens (dia 2) N2 para cada GP.
  3. Deixar os animais botarem ovos durante cerca de 8 h a 20 °C.
  4. Retire todos os adultos das placas e cultive de cabeça para baixo a 20 °C durante 3 dias.

3. Preparação do ensaio (1 dia antes do ensaio)

  1. Preparar a PB semeada (+) e não semeada (-).
    1. Semeie metade do lote de cada um dos 0 mM NaCl CP, 50 mM NaCl CP e 100 mM NaCl CP com 200 μL OP50 por placa (CP0+, CP50+ e CP100+, respectivamente).
      NOTA: A adição da suspensão OP50 ao CP0+ pode resultar no transporte de uma pequena quantidade de NaCl (NaCl <2 mM), o que provavelmente não afetará substancialmente o comportamento da quimiotaxia. Em situações em que pequenas concentrações de NaCl são relevantes, isso pode ser acomodado adicionando 2 mM de NaCl às placas CP0 e o setor 'sem sal' nas placas de ensaio.
    2. Deixar secar as placas durante a noite a 20 °C numa incubadora ao lado da metade não semeada da PC (CP0-, CP50- e CP100-, respetivamente)
  2. Prepare placas de ensaio (AP).
    1. Prepare três garrafas de vidro limpas de 1 L e adicione o seguinte:
      1. Adicione 2,5 g de peptona, 17 g de ágar, 975 mL de água destilada e um agitador magnético a uma garrafa (para NaCl 0 mM)
      2. Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de ágar, 975 mL de água destilada e um agitador magnético a uma garrafa (para 50 mM de NaCl)
      3. Adicione 6 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de ágar, 975 mL de água destilada e um agitador magnético a uma garrafa (para 100 mM de NaCl)
    2. Autoclave as três garrafas por 15 min a 121 ° C e, em seguida, deixe as garrafas esfriarem por 30 min a 55 ° C em banho-maria.
    3. Enquanto isso, rotule a parte inferior de cada seção da placa de Y-Petri (uma placa de Petri de 90 mm x 10 mm dividida em três compartimentos por uma parede interna) com a concentração de NaCl correspondente do meio a ser derramado nela. Desenhe um círculo com um raio de 5 mm ao redor do centro da placa, onde as três paredes se encontram (Figura 1).
      NOTA: A área dentro do círculo, juntamente com as próprias paredes, representará a área de exclusão para fins de contagem: os vermes encontrados dentro dessas áreas durante a contagem não contarão para o total de nenhum setor.
    4. Coloque as garrafas (uma de cada vez) em um agitador magnético aquecido. Adicionar a cada frasco 25 mL de 1 M KPO4 (pH = 6,0 à RT). Misture bem por 2 min e, em seguida, adicione 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg / mL em etanol e 1 mL de 1 M MgSO4 (todas as soluções devem ser estéreis). Misture por agitação magnética.
    5. Alíquota do meio 0 mM em um compartimento de uma placa de Y-Petri de 90 mm x 10 mm até que o meio atinja o topo da parede interna e, em seguida, deixe solidificar por aproximadamente 5 min.
    6. Alíquota do meio de 100 mM no segundo compartimento da placa de Y-Petri até que o meio toque a seção solidificada de NaCl de 0 mM adjacente a ele. Para evitar transbordamento para a seção vazia adjacente, encha a seção de 100 mM até a borda da parede Y interna e, em seguida, use uma ponta de pipeta estéril de 10 μL para quebrar a tensão superficial do meio ao longo da parede Y e conecte-a à seção de NaCl 0 mM. Em seguida, deixe solidificar por aproximadamente 5 minutos.
    7. Alíquota do meio de 50 mM para o compartimento vazio restante da placa de Y-Petri até que o meio toque as seções adjacentes de NaCl 0 mM e NaCl 100 mM solidificadas. Tome cuidado para que o meio não transborde para as seções adjacentes. Em seguida, deixe solidificar por aproximadamente 5 minutos.
    8. Armazenar as placas durante a noite a 20 °C em uma incubadora.
      NOTA: Aproximadamente 50 AP podem ser feitos a partir deste método.
  3. Prepare 1 L de tampão M9 estéril14.

4. Ensaio de aprendizagem associativa de C. elegans (aqui realizado por 8 grupos em paralelo)

  1. Pipete 1 mL de tampão M9 estéril em um GP e gire a placa suavemente para desalojar os vermes (principalmente adultos de 1 dia) do OP50 e do ágar, formando uma suspensão.
  2. Incline a placa, recolha a suspensão sem-fim em tampão M9 com uma ponta de pipeta de plástico de 1 mL e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: A parte superior da ponta da pipeta pode ser aparada com uma tesoura para aumentar o diâmetro da abertura; isso reduz a tensão de cisalhamento e os danos físicos à medida que os vermes passam pela ponteira e pode ser especialmente útil ao trabalhar com ponteiras de pipeta de 200 μL. Antes de iniciar os experimentos, é importante garantir que os vermes não grudem no tipo de tubo utilizado; Isso pode ser feito observando o tubo sob um microscópio de dissecação após remover a suspensão do verme.
  3. Repita o processo para todos os GP e, em seguida, deixe os vermes assentarem no fundo dos tubos da microcentrífuga por aproximadamente 60 s, formando um pellet.
  4. Remova o sobrenadante/excesso de tampão M9 usando uma pipeta de 1 mL, tomando cuidado para não perturbar o pellet.
  5. Lave o pellet com 1 mL de tampão M9 estéril mais duas vezes para remover qualquer OP50 residual. Deixe o pellet repousar por aproximadamente 60 s entre as lavagens. Ressuspenda o pellet após lavá-lo a 300 μL com M9 Buffer.
  6. Transfira lentamente 50 μL da suspensão de minhoca (aproximadamente 200-300 animais) para cada placa de condicionamento (CP0-, CP0+, CP50-, CP50+, CP100- e CP100+). Gire a suspensão a cada vez antes de aliquotar para manter as minhocas suspensas uniformemente. Para placas semeadas com OP50, coloque a gota de minhoca longe do gramado de alimentos bacterianos. Deixe a suspensão ser absorvida pelo ágar.
  7. Armazene as placas de cabeça para baixo a 20 °C em uma incubadora por aproximadamente 4 h, permitindo que as minhocas vaguem.
    NOTA: A etapa de condicionamento pode ser encurtada para 2 h para acomodar os horários dos cursos de graduação.
  8. Pipete 1 mL de tampão M9 estéril em um CP e gire a placa suavemente para desalojar os vermes, formando uma suspensão.
  9. Incline a placa, recolha a suspensão M9-worm com uma ponta de pipeta de plástico de 1 mL e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  10. Deixe os vermes assentarem no fundo do tubo da microcentrífuga por aproximadamente 60 s.
  11. Remova o sobrenadante/excesso de tampão M9 usando uma pipeta de 1 mL sem perturbar o pellet de minhoca.
  12. Lave os vermes mais duas vezes com 1 mL de tampão M9 estéril. Deixe o pellet repousar por aproximadamente 60 s entre as lavagens.
  13. Encha o tubo da microcentrífuga com tampão M9 até a marca de 1 mL e deixe o pellet sem-fim repousar por aproximadamente 60 s.
  14. Remova 960 μL do sobrenadante usando uma pipeta de 1 mL, tomando cuidado para não perturbar o pellet.
  15. Agite ou agite o tubo da microcentrífuga suavemente para ressuspender os vermes e, em seguida, use uma pipeta de 20 μL para transferir 20 μL do pellet de minhoca (contendo aproximadamente 100-150 animais) para o centro de um AP, onde todos os segmentos da parede em Y se encontram. Repita esta etapa para os outros pontos de acesso.
  16. Deixe os vermes vagarem por 30 min a 20 ° C e, em seguida, conte o número de vermes presentes em cada uma das seções do AP (NaCl 0 mM, NaCl 50 mM e NaCl 100 mM, respectivamente) sob um microscópio estereoscópico. Exclua quaisquer vermes presentes a menos de 5 mm do centro da placa em qualquer seção ou na borda entre as seções (Figura 1).
  17. Deixe os vermes vagarem por mais 30 minutos a 20 °C e, em seguida, conte o número de vermes em cada seção do AP novamente. Exclua quaisquer vermes presentes a menos de 5 mm do centro da placa em qualquer seção.
  18. Calcular o índice de quimiotaxia (IC) por placa e por ponto no tempo, utilizando a fórmula15,16:
    figure-protocol-1

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Resultados

O condicionamento por 4 h em placas com várias quantidades de NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM), com ou sem alimento, afetou significativamente o comportamento de C. elegans do tipo selvagem (N2). Após 30 min na placa de ensaio, os vermes condicionados em placas com altas concentrações de NaCl e alimento (CP100+) e os vermes condicionados em placas sem NaCl e sem alimento (CP0-) tiveram um IC positivo, indicando uma preferência por maiores concentrações de NaCl (Fi...

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Discussão

Neste artigo, descrevemos a avaliação da aprendizagem associativa no nematóide C. elegans usando quimiotaxia como paradigma experimental. Em nosso exemplo, usamos seis condições experimentais. Especificamente, C. elegans do tipo selvagem N2 foram condicionados em placas com concentrações baixas (0 mM), médias (50 mM) ou altas (100 mM) de NaCl que foram semeadas com o alimento padrão do nematóide (cepa bacteriana E. coli OP50) ou deixadas sem sementes. Em seguid...

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Divulgações

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Agradecimentos

Dedicamos este artigo à memória de Johannes Berthold. Algumas cepas foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center (CGC), que é financiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa do NIH (P40 OD010440). A E.I.B. agradece o apoio financeiro da Studienstiftung des deutschen Volkes.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgarChemsolute9972-2KG
Bacto-peptoneGibco211677
CaCl2 1M solution Merck2389
Caenorhabditis elegans strainsCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Cholesterol Roth8866.1
E. coli OP50 liquid cultureN/AN/A
EthanolChemsolute22731000
KH2PO4 Roth P018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) 1 M solution Chemsolute16341000
MgSO4 1 M solution RothT888.2
Microcentrifuge tubes 1.5 mLEppendorfN/A
Na2HPO4 RothT877.1
NaClChemsolute13671000
Y-Petri dishes 90 x 10 mmMoonlab4-0033

Referências

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