Predição computacional de preferências de aminoácidos de domínios de ligação peptídica potencialmente multiespecíficos envolvidos em interações proteína-proteína

Resumo

Descrevemos uma metodologia baseada na diversificação de sequências para estimar as preferências de aminoácidos de sítios de ligação multiespecíficos em interações proteína-proteína (PPIs). Nessa estratégia, milhares de potenciais ligantes peptídicos são gerados e rastreados in silico, superando assim algumas limitações dos métodos experimentais disponíveis.

Resumo

Muitas interações proteína-proteína envolvem a ligação de segmentos curtos de proteínas a domínios de ligação a peptídeos. Normalmente, tais interações requerem o reconhecimento de motivos lineares com conservação variável. A combinação de regiões altamente conservadas e mais variáveis nos mesmos ligantes geralmente contribui para a multiespecificidade da ligação, uma propriedade comum de enzimas e proteínas de sinalização celular. A caracterização das preferências de aminoácidos dos domínios de ligação a peptídeos é importante para o projeto de mediadores de interações proteína-proteína (PPIs). Os métodos computacionais são uma alternativa eficiente às técnicas experimentais muitas vezes caras e complicadas, permitindo o projeto de potenciais mediadores que podem ser posteriormente validados em experimentos a jusante. Aqui, descrevemos uma metodologia usando a aplicação Pepspec do pacote de modelagem molecular Rosetta para prever as preferências de aminoácidos dos domínios de ligação a peptídeos. Essa metodologia é útil quando a estrutura da proteína receptora e a natureza do ligante peptídico são conhecidas ou podem ser inferidas. A metodologia começa com uma âncora bem caracterizada do ligante, que é estendida pela adição aleatória de resíduos de aminoácidos. A afinidade de ligação dos peptídeos gerados dessa maneira é então avaliada por docking de peptídeos de backbone flexível para selecionar os peptídeos com as melhores pontuações de ligação previstas. Esses peptídeos são então usados para calcular as preferências de aminoácidos e, opcionalmente, calcular uma matriz posição-peso (PWM) que pode ser usada em estudos posteriores. Para ilustrar a aplicação dessa metodologia, usamos a interação entre subunidades do fator regulador de interferon humano 5 (IRF5), anteriormente conhecido por ser multiespecífico, mas globalmente guiado por um motivo conservado curto chamado pLxIS. As preferências estimadas de aminoácidos foram consistentes com o conhecimento prévio sobre a superfície de ligação do IRF5. As posições ocupadas por resíduos de serina fosforilável exibiram uma alta frequência de aspartato e glutamato, provavelmente porque suas cadeias laterais carregadas negativamente são semelhantes à fosfoserina.

Introdução

A interação entre duas proteínas geralmente envolve a ligação de segmentos curtos de aminoácidos a domínios de ligação a peptídeos, assemelhando-se a interfaces proteína-peptídeo. As proteínas receptoras envolvidas em tais interações proteína-proteína (PPI) geralmente têm a capacidade de reconhecer um certo conjunto de sequências de ligantes sobrepostas, mas divergentes, uma propriedade conhecida como multiespecificidade ^1,2. O reconhecimento multiespecífico é uma característica de muitas proteínas celulares, mas é particularmente notável em enzimas e proteínas de sinalização celular³. As proteínas que interagem com sítios de ligação multiespecíficos geralmente têm uma combinação de regiões mais e menos conservadas em sua sequência ^4,5,6. Nesse cenário, os motivos de sequência mais conservados estão envolvidos em interações moleculares rigorosas. Por outro lado, as sequências mais variáveis interagem com superfícies de alguma forma permissivas no local de ligação ao receptor. Normalmente, esses segmentos menos conservados, mas ainda funcionalmente relevantes, são loops sem padrões de estrutura secundária definidos ou têm conformações ainda mais dinâmicas, como as típicas de proteínas intrinsecamente desordenadas⁷.

A identificação de potenciais ligantes peptídicos de sítios de ligação é geralmente o primeiro passo no projeto de mediadores capazes de interferir nos PPIs correspondentes⁸. No entanto, muitas vezes é improvável encontrar um único resíduo de aminoácido mais frequente na maioria das posições de sequência em ligantes de sítios de ligação multiespecíficos. Em vez disso, esses locais podem ter preferências particulares por uma classe específica de aminoácidos de acordo com suas propriedades químicas, por exemplo, aminoácidos ácidos e carregados negativamente, como aspartato ou glutamato, aminoácidos aromáticos volumosos, como fenilalanina, ou resíduos mais hidrofóbicos, como aminoácidos alifáticos alanina, valina, leucina ou isoleucina³. Vários métodos experimentais podem fornecer informações sobre as preferências de aminoácidos dos locais de ligação às proteínas, incluindo evolução dirigida⁹, mutagênese de varredura de múltiplos códons¹⁰ e varredura mutacional profunda¹¹. Todos esses métodos seguem a abordagem de diversificação de sequência, que se baseia na introdução de mutações nos ligantes originais e na análise de seu efeito na função da proteína receptora (ver Bratulic e Badran¹² para uma revisão abrangente). No entanto, esses métodos geralmente exigem o levantamento de grandes bibliotecas de sequências, o que os torna mais complicados, caros e demorados.

Métodos computacionais para inferir as preferências de aminoácidos de sítios de ligação multiespecíficos têm o potencial de contornar as limitações dos métodos de laboratório úmido. Dentre estes, a abordagem de diversificação da sequência in silico avalia o impacto energético de uma ampla gama de substituições de aminoácidos na sequência do ligante como forma de caracterizar a plasticidade estrutural do PPI¹³. Este método começa com a estrutura ou modelo do ligante peptídico ligado ao local de ligação do receptor e, posteriormente, introduz mutações na sequência do ligante. As funções estatísticas e de pontuação de energia são então usadas para avaliar o impacto dessas mutações na estabilidade e na afinidade de ligação. O conjunto de sequências de ligantes de melhor pontuação resultantes da fase de avaliação pode então ser usado para calcular as preferências de aminoácidos. Essa estratégia tem o potencial de processar um número muito alto de sequências de ligantes de maneira eficiente. Portanto, ele pode fornecer uma inferência mais completa e consistente das preferências de aminoácidos em comparação com aquelas calculadas a partir do número mais limitado de sequências que geralmente podem ser processadas em abordagens de laboratório úmido.

A aplicação Pepspec do conjunto de modelagem molecular Rosetta¹⁴ é uma ferramenta que realiza a diversificação de sequências como uma etapa fundamental de seu modo de design de peptídeos. Esta aplicação requer uma estrutura ou modelo da proteína receptora com um peptídeo ligado a um único resíduo de aminoácido de comprimento, que é usado como âncora para as próximas etapas. A sequência do peptídeo ligado é então estendida (se necessário) e diversificada para gerar um grande número de ligantes peptídicos putativos. A afinidade de ligação desses peptídeos é então avaliada por acoplamento de peptídeos de backbone flexível para selecionar aqueles com as melhores pontuações de ligação previstas. Embora a principal saída desta aplicação sejam os melhores candidatos a peptídeos selecionados no final da fase de projeto, o conjunto muito maior de peptídeos aceitos durante esta fase também pode ser usado para calcular as preferências de aminoácidos do local de ligação alvo. As preferências de aminoácidos são calculadas como a frequência de cada resíduo de aminoácido por posição da sequência de ligantes representada como uma matriz de peso de posição (PWM) ou como um logotipo de sequência mais visual.

Neste artigo, descrevemos um protocolo para estimar as preferências de aminoácidos da superfície de ligação de uma proteína receptora envolvida em um PPI. O protocolo é focado em PPIs nos quais um segmento linear do ligante de proteína é conhecido por se ligar à proteína receptora, de modo que o cenário pode ser modelado como uma interface proteína-peptídeo. Nesse cenário, os motivos conservados do ligante normalmente interagem com bolsas definidas no local de ligação do receptor, embora todo o segmento do ligante envolvido no PPI possa conter regiões menos conservadas. Um fluxograma resumindo as principais etapas do protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo começa com a estrutura 3D do complexo proteína-proteína e reduz ainda mais a proteína ligante para o potencial segmento de melhor interação, deixando a proteína receptora intacta. O segmento de melhor interação é inferido usando o servidor BUDE Alanine Scan¹⁵, que conduz mutagênese computacional de varredura de alanina para identificar resíduos de pontos quentes entre as duas proteínas que interagem. Nesta abordagem, os resíduos do ligante são substituídos individualmente por alanina, e a mudança estimada na energia livre ou estabilidade do complexo (ΔΔG) é então usada para inferir a relevância do resíduo correspondente para o PPI alvo. Uma vez inferido o segmento de melhor interação, seu complexo com a proteína receptora é usado como a estrutura de base submetida ao Pepspec para realizar a diversificação de sequências.

Figura 1: Visão geral das principais etapas do protocolo proposto neste trabalho. Os números correspondem aos números das etapas na seção de protocolo. As figuras foram feitas com o complexo proteína-proteína usado como exemplo descrito no texto. Neste complexo, a cadeia de proteínas considerada como o receptor é mostrada em rosa, enquanto a cadeia considerada como o ligante é mostrada em azul claro com seu segmento de melhor interação previsto destacado em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma das limitações do protocolo sugerido é a necessidade de uma estrutura resolvida da interface proteína-peptídeo. O protocolo pode, alternativamente, começar com um modelo da interface proteína-peptídeo alvo, embora as etapas específicas de modelagem não sejam descritas aqui. Além disso, embora o protocolo possa ser conduzido em um computador pessoal executando qualquer sistema operacional, um ambiente Linux é necessário para as etapas que envolvem os aplicativos Rosetta. Um cluster de computadores também é altamente recomendado para a etapa de diversificação de sequências devido ao grande número de iterações normalmente executadas pelo Pepspec.

A aplicação do protocolo sugerido é ilustrada com a estimativa das preferências de aminoácidos da superfície de ligação do IRF5, um membro da família do fator regulador do interferon humano (IRF). Escolhemos essa proteína como exemplo porque, durante sua ativação, duas subunidades se ligam para formar um dímero cuja estrutura é bem caracterizada¹⁶. Nos dímeros IRF, a ligação pode ser modelada como uma interface proteína-peptídeo na qual uma subunidade fornece a superfície de ligação e a outra interage através de uma região contendo um motivo conservado curto chamado pLxIS^17,18. Além disso, a ligação às subunidades IRF é multiespecífica; portanto, eles podem formar homodímeros, heterodímeros e complexos com outras proteínas celulares conhecidas como coativadores¹⁸.

Protocolo

1. Preparação inicial da interface proteína-peptídeo

1. Baixando a estrutura do complexo proteína-proteína
   1. Navegue até a página inicial do Protein Data Bank (PDB) (https://www.rcsb.org/) e digite o ID do PDB para a estrutura do complexo proteína-proteína na caixa de pesquisa principal (Figura 2A). O ID PDB para a estrutura do dímero IRF5, usado como exemplo neste trabalho, é 3DSH¹⁹.
   2. Na página principal da estrutura desejada, clique em Download Files (Figura 2B) e depois em Biological Assembly 1 (PDB - gz) (Figura 2C).
      NOTA: No banco de dados PDB, estruturas de muitos complexos proteicos formados por monômeros idênticos são representadas como conjuntos biológicos, nos quais apenas a estrutura de um monômero (unidade assimétrica) é armazenada no arquivo PDB. A estrutura do multímero, neste caso, o dímero IRF5, deve ser baixada como o conjunto biológico contendo duas instâncias da unidade assimétrica. Para facilitar as próximas etapas deste protocolo, os dois monômeros são primeiro separados e diferentes IDs de cadeia são atribuídos a eles.
   3. Abra a estrutura baixada no UCSF Chimera²⁰ e clique em Ferramentas > Edição de Estrutura > IDs da Cadeia de Alterações. Neste exemplo, ambas as cadeias na montagem biológica são nomeadas A. Renomeie a segunda cadeia (rotulada como #0.2) para B e clique em OK.
   4. Clique em Favoritos > Painel Modelo e selecione o modelo que contém as duas cadeias. Clique no botão Agrupar/Desagrupar para separar cada cadeia em um modelo diferente. Em seguida, selecione os dois modelos e clique no botão Copiar/Combinar. Insira um novo nome para o modelo combinado, marque Fechar modelos de origem e clique em OK.
   5. Clique em Selecionar > Cadeia e confirme que cada corrente no dímero agora é identificada por uma letra diferente, ou seja, A e B.
   6. Use File > Save PDB para salvar a estrutura editada em um arquivo PDB diferente, que será usado nas próximas etapas do protocolo (aqui, o nome IRF5_dimer.pdb foi usado).

Figura 2: A página do Banco de Dados de Proteínas (PDB) para a estrutura usada como exemplo representativo neste trabalho. (A) Caixa de pesquisa para introduzir o código de acesso PDB da estrutura alvo. (B) Menu para baixar a estrutura em vários formatos. (C) Opções para baixar montagens biológicas quando a estrutura tiver sido salva como uma unidade assimétrica (consulte a etapa 1.1.2 para obter mais detalhes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Identificando o segmento alvo na proteína ligante
   1. Navegue até o servidor de varredura de alanina BUDE (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Clique no botão Escolher arquivo em Upload de estrutura e selecione o arquivo PDB salvo na etapa 1.1.6.
   2. Na próxima página, verifique se a estrutura foi carregada corretamente (Figura 3A) e insira um nome para o trabalho no servidor (Figura 3B).
   3. Defina as cadeias do PDB que serão tratadas como receptor (A) e ligante (B) (Figura 3C). Em seguida, clique no botão Iniciar digitalização para enviar o trabalho.
   4. Quando o trabalho estiver concluído, clique em Mostrar resultados para abrir a página de resultados (Figura 4).
      NOTA: Na página de resultados, os resíduos da estrutura do ligante são coloridos de acordo com sua mudança estimada na energia livre (ΔΔG), e aqueles com valores mais altos são coloridos em vermelho.
   5. Na lista de resíduos, selecione o trecho de resíduos previsto para interagir melhor com a superfície de ligação alvo. Certifique-se de que esses resíduos agrupem os valores mais altos para a diferença de energia livre (ΔΔG). Neste exemplo, o segmento entre os resíduos Leu424 e Ser436 foi selecionado (destacado com uma caixa vermelha no painel direito da Figura 4).
3. Preparando a interface proteína-peptídeo para diversificação de sequências
   1. Abra o arquivo PDB salvo na etapa 1.1.6 no Chimera e verifique se não há átomos ou ligações ausentes na estrutura das subunidades alvo.
   2. Exclua todas as pequenas moléculas, íons e solventes que foram co-cristalizados com a estrutura original. Para fazer isso, clique em Selecionar resíduos > e, em seguida, selecione todas as moléculas, exceto os aminoácidos padrão. Em seguida, clique em Ações > Átomos/Ligações e Excluir.
   3. Corte a cadeia de ligantes para o segmento de melhor interação escolhido na etapa 1.2.5. Para fazer isso, clique em Favoritos e Sequência e, em seguida, clique na cadeia considerada como o ligante (B). No painel Sequência , arraste o mouse para selecionar todos os resíduos, exceto aqueles entre as posições 424 e 436. Para excluir esses resíduos, clique em Ações > Átomos/Ligações e Excluir.
   4. Use File > Save PDB para salvar a estrutura editada em um arquivo PDB diferente, que é usado nas próximas etapas do protocolo (aqui, o nome IRF5_interface.pdb foi usado).

Figura 3: Seleção do receptor e do ligante no servidor BUDE Alanine Scan. (A) Representação gráfica do complexo proteína-proteína. (B) Caixa de texto para inserir o nome do trabalho no servidor. (C) Painel para selecionar interativamente as cadeias que serão consideradas como receptor e ligante (consulte a etapa 1.2 para obter mais detalhes). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Página de resultados do servidor BUDE Alanine Scan. O segmento potencial de melhor interação na sequência de ligantes é indicado com uma caixa vermelha. No painel esquerdo, o resíduo com a maior contribuição de energia prevista (Leu433) é destacado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Diversificação de sequências

NOTA: Nas etapas a seguir, rosetta_main refere-se ao diretório principal de instalação do Rosetta, que normalmente está localizado em /opt/rosetta_src__bundle/main/, onde indica a versão instalada do Rosetta. Além disso, presume-se que os aplicativos Rosetta sejam acessíveis em todo o sistema; Se esse não for o caso, o caminho completo para os executáveis deve ser fornecido. Quando compilados a partir da origem, esses executáveis estão localizados no diretório /rosetta_main/source/bin/ .

1. Otimização inicial das cadeias laterais de aminoácidos
   1. Copie a estrutura editada salva na etapa 1.3.4 para um local Linux acessível pelos aplicativos Rosetta.
   2. Use o aplicativo FixBB da Rosetta para realizar um reempacotamento de todas as cadeias laterais de aminoácidos da estrutura de base antes da diversificação da sequência. Nesta operação, a orientação de todas as cadeias laterais de aminoácidos é otimizada para minimizar a energia e melhorar a estabilidade do complexo. Para fazer isso, execute o seguinte comando:
      
      NOTA: Este comando gera um arquivo PDB com o nome da estrutura original com um sufixo numérico adicional (IRF5_interface_0001.pdb neste exemplo).
   3. Para facilitar a próxima etapa do protocolo, renomeie o arquivo PDB reempacotado com o sufixo _repack usando o seguinte comando:
      MV IRF5_interface_0001.PDB IRF5_repack.PDB
2. Diversificação de sequências
   1. Execute Pepspec no modo de design para executar a etapa de diversificação de sequência real usando o seguinte comando:
      
      A seguir estão as opções gerais:
      • -s indica o arquivo de entrada (o arquivo PDB reempacotado gerado na etapa 2.1.3).
      • -o indica o prefixo para nomear os arquivos de saída.
      • - database indica o caminho para o banco de dados principal do Rosetta 3.
      • -ex1, -ex2 e extrachi_cutoff são opções de biblioteca de rotâmeros (consulte a documentação do Pepspec para obter mais detalhes).
      • -overwrite informa ao aplicativo para substituir possíveis saídas pré-existentes geradas por iterações anteriores.
      A seguir estão as opções relativas à diversificação de sequências per se:
      • -pepspec:pep_chain indica as cadeias PDB consideradas como ligante ('b' neste exemplo).
      • -pepspec:native_pep_anchor indica o resíduo de aminoácido usado como âncora (neste exemplo, o resíduo de Leu na posição 10 do peptídeo ligante).
      • -pepspec:n_peptides indica o número de estruturas peptídicas a serem emitidas.
      • -pepspec:no_prepack_prot informa ao aplicativo para ignorar o reempacotamento na estrutura base de entrada (já que isso foi executado anteriormente na etapa 2.1).
        NOTA: A saída principal do Pepspec é um diretório que contém os arquivos PDB para peptídeos resultantes da fase de design, nomeado usando o prefixo de saída com o sufixo .pdbs (IRF5.pdbs no exemplo). Além disso, o Pepspec gera todas as sequências de peptídeos aceitas testadas como parte da etapa de diversificação de sequências e suas pontuações de energia Rosetta correspondentes em um arquivo de texto delimitado por tabulação com o nome do prefixo de saída, com o . spec (IRF5.spec no exemplo). Como o protocolo descrito neste trabalho visa estimar as preferências de aminoácidos em vez do design real do peptídeo, os próximos passos usam IRF5.spec em vez das estruturas PDB no diretório .pdbs .

3. Estimativa das preferências de aminoácidos

1. Calculando um PWM
   1. Para gerar um PWM, use o script gen_pepspec_pwm.py incluído no pacote Rosetta. Para executar esse script, use o seguinte comando:
      
      onde:
      • IRF5.spec é o arquivo de saída Pepspec gerado na etapa 2.2.
      • -1 indica que não há resíduos N-terminais adicionais na sequência e, portanto, as posições no PWM são baseadas em 1.
      • 0,2 diz ao script para considerar apenas os 20% dos peptídeos com melhor pontuação da saída Pepspec (o valor padrão é 0,1, correspondente aos 10%)
      • interface_score diz ao script para classificar os peptídeos com base na pontuação da interface, que é uma das várias pontuações da Rosetta incluídas no arquivo de saída do Pepspec.
        NOTA: Este script gera dois arquivos de saída, um para o PWM calculado (com o sufixo .pwm ) e outro para as sequências do subconjunto de peptídeos usados para calcular o PWM (com o sufixo .seq ). Os nomes desses arquivos também incluem a pontuação e a fração de peptídeos usados para classificação. Neste exemplo, esses arquivos são nomeados respectivamente IRF5_interface_score_0.2.pwm e IRF5_interface_score_0.2.seq.
2. Gerando um logotipo de sequência
   1. Navegue até o servidor WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)²¹ e clique no botão Escolher arquivo ao lado de Carregar dados de sequência. Carregue o arquivo com sequências de peptídeos geradas na etapa 3.1.1 (IRF5_interface_score_0.2.seq neste exemplo).
   2. Escolha o formato e o tamanho desejados do logotipo de acordo com o comprimento de entrada. O exemplo usa o formato PDF e um tamanho de 15 cm x 12 cm. Clique em Criar logotipo.

Resultados

Neste artigo, descrevemos um protocolo para prever as preferências de aminoácidos da superfície de ligação do IRF5, um membro de uma família de fatores de transcrição conhecidos como fatores reguladores do interferon humano. Essas proteínas são reguladoras das respostas imunes inatas e adaptativas e participam da diferenciação e ativação de várias células imunes. As subunidades IRF possuem superfícies de ligação altamente plásticas e multiespecíficas, sendo capazes de formar homodímeros, heterodímeros e complexos com outras proteínas celulares^17,18. Acredita-se que a dimerização seja o primeiro passo na ativação desses fatores e, na maioria dos membros da família, é desencadeada pela fosforilação de múltiplos resíduos de serina/treonina¹⁸. Durante a dimerização, cada monômero interage com a superfície de ligação do outro monômero por meio de um motivo altamente conservado chamado pLxIS, localizado na região C-terminal de sua sequência. A abreviatura pLxIS representa parcialmente as preferências de aminoácidos da superfície de ligação, que reconhece sequencialmente um aminoácido polar ('p'), seguido por duas posições com alta frequência de leucina ('L') e isoleucina ('I'), separadas por uma posição ocupada por qualquer aminoácido ('x') e seguida por um resíduo de serina fosforilável (Ser436 neste exemplo). A fosforilação de vários resíduos de serina, incluindo o do motivo pLxIS, promove a curvatura do segmento C-terminal de um monômero e sua interação com a superfície de ligação do outro monômero^19,22.

O protocolo aqui descrito começou com uma estrutura 3D do dímero IRF5¹⁹, em que um dos monômeros foi arbitrariamente considerado como o receptor no PPI, enquanto o outro foi considerado como o ligante contendo o motivo pLxIS. Para definir melhor o segmento do ligante que interage com o local de ligação do receptor, realizamos mutagênese computacional de varredura de alanina (etapa 1.2). O segmento previsto foi composto por 13 resíduos de aminoácidos das posições 424 a 436, com o motivo pLxIS começando em Arg432. A estrutura do dímero original foi então reduzida a um complexo peptídeo-proteína no qual a sequência do monômero considerado como ligante foi cortada para o segmento de melhor interação previsto, enquanto o outro monômero foi deixado intacto (etapa 1.3). Essa estrutura foi então usada como entrada para a estratégia de diversificação de sequências (seção 2), designando o resíduo de leucina do motivo pLxIS (Leu433) como a âncora exigida pelo Pepspec. Esse processo resultou em mais de 26.000 ligantes peptídicos potenciais. Os 20% principais ligantes potenciais com as melhores pontuações de energia (5.280) foram usados para estimar as preferências de aminoácidos da superfície de ligação na forma de um PWM (Figura 5A) e um logotipo de sequência (Figura 5B) (seção 3).

Figura 5: Preferências de aminoácidos da superfície de ligação do IRF3. (A) PWM indicando a frequência de cada resíduo de aminoácido (linhas) por posição na sequência (colunas) do ligante peptídico. (B) Logotipo da sequência representando visualmente as frequências de aminoácidos correspondentes. As posições da sequência IRF5 original são mostradas entre parênteses abaixo de cada coluna do logotipo da sequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No PWM, cada linha corresponde a um resíduo de aminoácido específico, enquanto cada coluna representa uma posição na sequência. Cada célula da matriz contém a frequência relativa de cada aminoácido nessa posição, ponderada pelas frequências gerais de fundo. Os logotipos de sequência são construídos empilhando as letras de aminoácidos de modo que a altura total da pilha em cada posição indique a conservação da sequência geral nessa posição. Por outro lado, a altura das letras individuais dentro da pilha indica a frequência do aminoácido correspondente. Neste exemplo, tanto o PWM quanto o logotipo da sequência são consistentes com o conhecimento prévio sobre a superfície de ligação do IRF5, com uma preferência maior por um aminoácido polar (glutamato) na posição 432 ('p') e uma preferência muito alta por leucina e isoleucina nas posições 433 e 435, respectivamente. Notavelmente, as posições 427, 429 e 436 foram previstas para ter maior conservação de aspartato, apesar de serem ocupadas por serina na sequência IRF5 original. Esse achado evidencia a importância da fosforilação dessas posições para a formação do dímero IRF5, uma vez que a carga negativa nas cadeias laterais do aspartato e do glutamato se assemelha à da fosfoserina. De fato, um estudo anterior relatou que um peptídeo chamariz chamado IRF5D, no qual esses resíduos de serina foram substituídos por aspartato, foi capaz de inibir a atividade do IRF5²³. Por outro lado, a posição 425 foi prevista para ter uma preferência muito alta pela serina, sugerindo que o resíduo de serina nesta posição pode participar do PPI em sua forma não fosforilada. De fato, foi relatado anteriormente para outros IRFs que a fosforilação do resíduo de serina equivalente afeta negativamente a dimerização e a ligação a outros coativadores^16,24.

Discussão

O presente artigo descreve um protocolo para estimar as preferências de aminoácidos de sítios de ligação potencialmente multiespecíficos com base na diversificação de sequências in silico. Poucas ferramentas computacionais foram desenvolvidas para estimar as preferências de aminoácidos das interfaces proteína-peptídeo 14,25,26. Essas ferramentas têm natureza preditiva, mas diferem nos algoritmos computacionais usados para realizar suas previsões e nas correções que implementam para melhorar a precisão. Neste trabalho, utilizamos a aplicação Pepspec da suíte de modelagem molecular Rosetta¹⁴. Embora orientado principalmente para o design de peptídeos, este aplicativo implementa um algoritmo de diversificação de sequência que pode ser usado para prever preferências de aminoácidos. Até onde sabemos, essa ferramenta é a única atualmente disponível que fornece um script integrado para calcular um PWM diretamente dos resultados da diversificação de sequências. É importante ressaltar que o protocolo é focado em PPIs, portanto, espera-se que a estrutura inicial seja um complexo de duas subunidades proteicas. Antes da etapa real de diversificação da sequência, a proteína considerada como ligante é cortada para o segmento que se espera que interaja com a proteína receptora e é posteriormente tratada como um peptídeo. No entanto, o protocolo também pode ser aplicado a complexos proteína-peptídeo, um cenário no qual as etapas 1.1-1.3 podem não ser necessárias. Durante a etapa de preparação (seção 1), também é essencial corrigir resíduos e heteroátomos formatados incorretamente, bem como modelar segmentos da estrutura complexa relevantes para o local de ligação alvo que não puderam ser resolvidos adequadamente. Essas correções dependem da estrutura específica em estudo e não foram necessárias para a estrutura usada como exemplo aqui.

As etapas mais críticas deste protocolo são aquelas realizadas com os aplicativos Rosetta, que incluem um reempacotamento inicial de cadeias laterais com FixBB (etapa 2.1) e a diversificação de sequência real com Pepspec (etapa 2.2). Essa etapa inicial de reembalagem, chamada de pré-embalagem, é explicitamente mencionada como exigida pelos autores do Pepspec¹⁴. Embora possa ser realizado pelo Pepspec, os autores deste aplicativo recomendam o uso do aplicativo FixBB, que foi especialmente projetado para otimizar os rotâmeros de cadeia lateral em backbones de proteínas fixas. Na etapa de diversificação de sequências, é importante considerar que a aplicação do Pepspec é orientada para o design de peptídeos. Consequentemente, ele relata alguns candidatos a peptídeos com melhor pontuação por padrão. Como o objetivo do protocolo apresentado aqui é gerar um grande número de ligantes peptídicos putativos em vez de alguns candidatos com melhor pontuação, mudamos a opção "-pepspec:n_peptides" de 8 (seu padrão) para 200 (etapa 2.2.1). Usando essa configuração, a Pepspec previu mais de 20.000 peptídeos como ligantes potenciais. Este conjunto de peptídeos putativos forneceu uma visão muito ampla do cenário de ligação do receptor, que foi então amostrado para os 20% melhores peptídeos de melhor pontuação para estimativa real das preferências de aminoácidos. Se um número menor de peptídeos for passado para "-pepspec:n_peptides", um número significativamente menor de candidatos será aceito pelo Pepspec. Nesse cenário, a amostragem proposta no protocolo pode capturar muitos ligantes peptídicos putativos com pontuações de energia abaixo do ideal, resultando potencialmente em estimativas menos robustas.

Uma das principais limitações do protocolo apresentado neste trabalho é que ele se baseia no conhecimento prévio da estrutura da proteína que contém a superfície de ligação. No entanto, essa estrutura não precisa necessariamente ser determinada experimentalmente, mas pode ser modelada ab initio ou por modelagem por homologia¹⁴. Além disso, também é necessário conhecer o modo de ligação de pelo menos um resíduo de aminoácido (âncora) do ligante peptídico. Esta âncora será estendida a um determinado número de resíduos por meio de opções específicas de extensão de âncora da Pepspec para realizar a diversificação da sequência. Se a orientação de todo o ligante no sítio de ligação for conhecida, como é o caso do exemplo representativo deste estudo, as opções relacionadas à extensão da âncora devem ser deixadas como padrão (sem extensão), embora um resíduo do peptídeo ainda deva ser especificado como uma âncora para guiar o algoritmo de diversificação de sequência. A aplicação Pepspec não suporta o acoplamento de novo de um possível resíduo de âncora, mas pode usar como entrada a saída de outras aplicações de acoplamento ou um modelo de um complexo proteína-peptídeo homólogo para realizar o acoplamento da âncora¹⁴; embora esses cenários estejam além do escopo deste artigo.

Uma desvantagem importante do protocolo sugerido é sua natureza preditiva inerente, que é diretamente afetada pela resolução e precisão da estrutura ou modelo inicial do complexo proteína-proteína. No entanto, os autores do Pepspec afirmaram que a precisão desta aplicação foi significativamente melhorada ao tratar as coordenadas do backbone de entrada como um conjunto de estruturas, em vez de usar uma única estrutura de proteína e aplicar a normalização de fundo ao calcular o PWM¹⁴. Além disso, o protocolo é uma alternativa aos métodos experimentais complicados e dispendiosos para a estimativa das preferências de aminoácidos. Todos esses métodos experimentais dependem da avaliação de grandes bibliotecas de sequências obtidas pela introdução de mutações na sequência de ligantes de proteínas, seguida de avaliação experimental do impacto de tais mutações (ver Bratulic e Badran¹² para uma revisão). Protocolos computacionais como o proposto neste trabalho permitem a triagem de milhares de ligantes peptídicos putativos de maneira muito eficiente, potencialmente fornecendo um conjunto mais robusto para a estimativa de preferências de aminoácidos 13,14,25. Nosso protocolo proposto pode ser aplicado a qualquer IBP que possa ser reduzido a uma interface proteína-peptídeo. Além disso, esse protocolo pode servir como uma estratégia inicial para identificar mediadores de IBPs, como potenciais ativadores ou inibidores. Os mediadores identificados podem ser usados posteriormente para estudar esses IBPs em laboratório ou podem ser avaliados como potenciais agentes terapêuticos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BUDE Alanine Scan Server	Universidade de Edimburgo	https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/	doi: 10.1021/acschembio.9b00560
Rosetta Modeling Software	Rosetta Commons	https://www.rosettacommons.org/software	doi: 10.1002/prot.22851
UCSF Chimera	University of California San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	doi: 10.1002/ jcc.20084