Modelo Experimental de Periimplantite Induzida por Ligadura em Camundongos

Os implantes dentários são cada vez mais prevalentes como uma escolha desejável para substituir dentes perdidos¹. Projeta-se que a prevalência de implantes dentários na população adulta dos EUA aumente até 23% até 2026². Com base em um relatório de análise de mercado da Grand View Research (2022), o tamanho do mercado global de implantes dentários foi projetado para atingir aproximadamente US $ 4,6 bilhões em 2022. Além disso, prevê-se que apresente uma taxa de crescimento anual constante de cerca de 10% até ao ano de 2030³. Infelizmente, o uso de implantes dentários pode levar a complicações, como a periimplantite. A periimplantite tem sido definida como uma condição induzida por biofilme caracterizada por inflamação na mucosa peri-implantar e subsequente perda progressiva do osso de^{sustentação4}.

Uma revisão sistemática constatou que a prevalência média de periimplantite foi de 19,53% (intervalo de confiança [IC] 95%, 12,87 a 26,19%) no nível do paciente e 12,53% (IC 95% 11,67 a 13,39%) no nível do implante⁵. A periimplantite representa uma saúde pública crescente, devido ao aumento da falha do implante e, consequentemente, dos custos substanciais do^tratamento6.

A compreensão da patogênese da periimplantite é crucial para o desenvolvimento de uma abordagem sistemática que previna seu aparecimento e progressão e maximize a longevidade dos implantes dentários em termos de estética e^função7,8. Nesse sentido, o uso de modelos murinos em pesquisas odontológicas tem se mostrado vantajoso, uma vez que camundongos compartilham mais de 95% de seus genes com humanos ^9,10, o número de bancos de dados genéticos on-line disponíveis e a capacidade de reproduzir cenários clínicos¹¹. Todas as vantagens descritas permitem a dissecção de mecanismos genéticos em diferentes^doenças12, acomodações e manejo acessíveis e anticorpos amplamente disponíveis na forma de painéis humanos, além da disponibilidade de modificações genéticas (por exemplo, knockout e superexpressão) para avaliação do tecido inflamatório e mapeamento da^doença13. Apesar de vantajosa, há poucas publicações abordando a periimplantite em camundongos. Isso se deve a desafios metodológicos, entre outros, incluindo a dificuldade na obtenção de mini-implantes ou sua instalação.

Para o desenvolvimento de periimplantite em camundongos, muitos protocolos têm sido descritos, como a periimplantite induzida por ligadura, a periimplantite induzida por^bactérias14, a periimplantite induzida por lipopolissacarídeo (LPS)¹⁵ ou a combinação LPS + periimplantite induzida por ligadura¹⁶. Aqui, enfocaremos o modelo de ligadura por ser o método mais aceito para induzir periodontite17,18,19 e, mais recentemente, periimplantite20,21. A ligadura colocada ao redor dos implantes em posição submucosa estimula o acúmulo de placa e, consequentemente, a inflamação tecidual. Assim, o desenvolvimento dessa abordagem baseia-se na indicação de uma técnica custo-benefício viável para investigações pré-clínicas de doenças peri-implantares. Este estudo tem como objetivo descrever um modelo experimental de peri-implantite induzida por ligadura em camundongos e determinar se há eficácia na indução desta doença diante das alterações ósseas e teciduais observadas.

O objetivo geral deste artigo é relatar o protocolo aplicado para induzir peri-implantite em camundongos por ligadura e observar sua eficácia através da avaliação tecidual e perda óssea ao redor dos implantes.

Procedimentos envolvendo cobaias animais foram aprovados pelo Chancellor's Animal Research Committee da Universidade da Califórnia, Los Angeles (protocolo ARC número 2002-125), e pelo Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE)²². Para este método, dezoito camundongos machos C57BL/6J com 3 semanas de idade foram utilizados e submetidos a extrações dentárias, colocação de implantes e indução de periimplantite. Todos os procedimentos odontológicos foram realizados sob aumento microscópico de 10× e realizados por operadores treinados e calibrados (Figura 1A).

1. Etapas de pré-extração

1. Realizar o procedimento em sala cirúrgica obedecendo a todas as normas de biossegurança e proteção.
2. Realizar assepsia de todas as superfícies com triplo atrito utilizando solução de álcool isopropílico a 70%.
3. Anestesiar camundongos machos C57BL/6J com 3 semanas de idade com isoflurano a 3%. Verifique a ausência de resposta à retirada da pata ao toque para garantir que a profundidade anestésica suficiente seja obtida.
4. Para não interferir nos procedimentos na boca, use um cone nasal para manter a anestesia com isoflurano.
5. Ter um operador auxiliar para estabilizar o animal e manter a abertura bucal (Figura 1B).
6. Aplique lubrificante oftálmico, para evitar irritação nos olhos antes de iniciar a extração.

Figura 1: Adaptações operatórias: (A) Magnificação microscópica. (B) Sistema de anestesia inalatória adaptado e estabilização para abertura bucal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Extração dentária

1. Para as extrações dentárias, introduzir um explorador dentário #5 entre o primeiro e o segundo molar para iniciar os procedimentos de elevação e luxação, movendo o instrumento no sentido mesio-distal até que o dente se mova no alvéolo (Figuras 2A).
2. Em seguida, introduza o explorador dentário #5 no sítio mesial do primeiro molar. Faça isso movendo o instrumento no sentido mesio-distal até que o dente se mova no alvéolo.
3. Após a elevação, utilizar a pinça de ponta e a pinça de amarração de sutura para remover o^1º molar.
4. Em seguida, introduzir o explorador dentário entre o 2º^{e o 3º} molar para elevar e luxar o^2º molar (Figura 2B).
5. Em seguida, utilize a pinça de ponta e/ou a pinça de amarração de sutura para retirar o dente usando os instrumentos para segurá-lo e retirá-lo da boca. (Figura 2C).
6. Após as extrações dentárias, garantir a obtenção da hemostasia completa com o uso de algodão estéril inclinado (Figura 2D) por 1 min (Figura 2E,F).
7. Imediatamente após a extração, fornecer a todos os animais medicação para dor (Carprofeno/Rimadyl 5 mg/kg) a cada 24 h. Administrar a medicação através de injeção subcutânea.
8. Além disso, substitua a alimentação regular por uma dieta suave. Administrar o antibiótico (Amoxil 0,25 mg/mL) por via oral, incorporando o medicamento na água potável. Faça isso por quatro semanas após as extrações.

Figura 2: Sequência inicial das extrações: (A, B) Região maxilar com dentes de 1º e 2º molares e uso de explorador dentário para elevação e luxação. (C) Utilização da pinça de ponta e explorador para luxação e retirada dos dentes. (D) Hemostasia. (E, F) Aspecto alveolar após extrações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Colocação de implantes

1. Usando uma lâmina de 15c, crie uma incisão mesiodistal através do tecido queratinizado na área correspondente aos dentes anteriormente presentes. Utilizar os molares superiores direitos como referência espacial (Figura 3A).
2. Elevar os retalhos vestibulares e palatinos de espessura total utilizando um explorador dentário #5, garantindo a elevação completa do retalho (Figura 3B).
3. Realizar a osteotomia utilizando uma microbroca manual de carboneto de 0,3 mm de diâmetro acoplada a uma Pino Vise (broca manual) e ativá-la em rotação no sentido horário. Criar sítios de osteotomia com aproximadamente 1 mm de profundidade nos alvéolos de extração cicatrizados (Figura 3C).
4. Colocar os implantes em forma de parafuso personalizados com superfície lisa usinada (1,0 mm de comprimento e 0,5 mm de diâmetro) fabricados com hastes de titânio 6AL4V (Figura 3D), uma por animal, auto-roscando na região do primeiro e segundo molares superiores esquerdos usando um movimento de parafusamento no sentido horário (Figura 3E-I).
5. Imediatamente após a colocação do implante, administrar medicação para dor (Carprofeno/Rimadyl 5mg/kg a cada 24 h) através de injeção subcutânea.
6. Permitir que os implantes cicatrizem por quatro semanas, durante as quais administrar antibióticos e se alimentar conforme descrito anteriormente.
7. No final do período de cicatrização, certifique-se de que a ferida mucosa está completamente fechada e tem uma aparência rosa claro.

Figura 3: Sequência de colocação do implante: (A) Incisão com lâmina de 15c acoplada ao cabo. (B) Retalhos de espessura total utilizando explorador dental #5. (C) Osteotomia com microbroca manual de carboneto de 0,3 mm acoplada a Pino Vise. (D) Implante dentário de titânio. (E, F) Suporte para implante e suporte para implante. (G-I) Colocação do implante usando um movimento de parafuso no sentido horário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Indução da peri-implantite

1. Coloque uma ligadura de seda (6-0) ao redor de cada fixador imediatamente apical à cabeça do implante, contornando a superfície do implante e fixando-a com um nó duplo. Manter a ligadura por duas semanas permitindo o desenvolvimento da peri-implantite.
2. Verifique as ligaduras a cada dois dias para se certificar de que elas ainda estão presentes. Se faltar, coloque uma nova ligadura.

Figura 4: Sequência peri-implantite induzida por ligadura. (A-D) Ligadura de seda (6.0) colocada ao redor da cabeça do implante. (E-G) Fechamento do nó. (H) Corte da ligadura. (I) Aparição final. Imagens clínicas obtidas de animais vivos sob sedação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Sacrifício

1. Após o período de indução da periimplantite (duas semanas), sacrificar todos os animais com alta concentração inalatória de isoflurano, seguido de um método secundário de luxação cervical com uma haste pressionada na base do crânio e puxando rapidamente os membros posteriores, causando a separação das vértebras cervicais do crânio.
2. Separe as maxilas usando instrumentos afiados, como uma tesoura cirúrgica, que separará toda a mandíbula do animal do resto do corpo.
3. Fotografar as maxilas com microscópio óptico, fixá-las em formalina a 10% por 24 h e armazenar em etanol 70%.

6. Microtomografia computadorizada (μCT)

1. Realizar exames de maxila conforme previamente descrito^18,19 por meio de microtomografia computadorizada (micro-TC).
2. Ligue o scanner e o computador, abra o software de digitalização, clique no sinal de radiação e aguarde 15 minutos para pré-aquecê-lo.
3. Abra a porta do equipamento clicando no ícone da porta.
4. Use uma mesa giratória de um quarto de tamanho. Coloque a maxila em um tubo cônico de 15ml. Fixe o tubo na base da mesa giratória. Coloque a mesa giratória no parafuso do equipamento.
5. Feche a porta do equipamento clicando no ícone da porta.
6. Ligue a fonte de Raios-X.
7. Clique no ícone de imagem de captura e verifique se o osso está no campo.
8. Ajuste uma resolução de tamanho de pixel de 10 μm, energia de raios-X de 55 KVp e 181 μA, filtro de AI 0,5 mm, passo de rotação 0,4, quadro médio 10. Essas configurações gerarão um tempo de varredura estimado de 24 minutos.
9. Inicie a aquisição.
10. Para reconstrução abra o software de reconstrução. Utilizar endurecimento de viga de 20%. Use artefato de anel de 5%. Use um intervalo dinâmico de 0-0,13. Desmarque o rótulo ATIVADO. Clique em Pré-visualizar. Escolha a visualização adequada que é vista para a região de interesse e salve-a como TIFF.
11. Orientar as imagens obtidas por meio de softwares de visualização e análise de dados. Tornar o eixo longo da cabeça do implante paralelo aos eixos sagital e coronal e perpendicular ao eixo axial.
12. Salve a imagem sagital como uma única imagem para análise óssea linear.
13. Salve a imagem transaxial como um conjunto de dados para análise óssea volumétrica.
14. Realizar análise óssea linear utilizando o software de análise de dados. Medir as distâncias em milímetros entre a cabeça do implante e o osso alveolar nos planos sagital e coronal, incluindo os sítios mesial, distal, bucal e palatino.
15. Realizar análise óssea volumétrica usando software de análise de dados. Rastrear a perda óssea ao redor dos implantes desenhando a região de interesse em todas as lâminas correspondentes à perda óssea.

7. Análise estatística

1. Medir a perda óssea microtomográfica linear e volumétrica e normalizar esses valores dividindo cada valor pela média do grupo controle. Apresentar média para todos os grupos, como média ± erro padrão da média (EPM).
2. Comparar a significância usando uma análise de variância (ANOVA) de duas vias seguida pelo teste de Tukey com intervalo de confiança de 95%. (Prisma 5). Aplicar os níveis de significância da seguinte forma: p≤0,01**, p≤0,001****.

Para este método, dezoito camundongos machos C57BL/6J com 3 semanas de idade foram utilizados e submetidos a extrações dentárias, colocação de implantes e indução de periimplantite. Foram nove animais por grupo, o que foi estatisticamente significante, considerando a perda óssea linear atingindo 80% de potência, 15% de desvio padrão (σ) e intervalo de confiança de 95% (α=0,05). Os camundongos foram alimentados com dieta soft ad libitum durante o experimento. Nove camundongos receberam ligadura (grupo periimplantite induzida por ligadura-experimental) e nove não receberam ligadura (grupo controle).

A taxa de sucesso da osseointegração do implante
Respeitando o período de cicatrização de quatro semanas e observando a estabilidade clínica, os implantes em nosso estudo tiveram alta sobrevida e 100% de sucesso, pois nenhum dos implantes colocados foi perdido. Não foram observados outros eventos adversos.

Avaliação clínica
Por microscopia óptica, a avaliação clínica foi realizada por meio de inspeção visual e fotos clínicas imediatamente após o sacrifício dos camundongos (Figura 5). Quando comparado ao grupo controle, no grupo periimplantite observou-se inflamação, formação de bolsa e aumento do edema de partes moles ao redor do implante. Não foram observadas evidências de complicações graves do fenótipo clínico.

Figura 5: Imagens clínicas representativas dos grupos (A) não ligadura (NL) e (B) ligadura (L) 2 semanas após a ligadura. Observou-se aumento do edema de partes moles ao redor do implante no grupo peri-implantite em relação ao outro grupo. Ampliação de 20X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise microcomputadorizada (μCT)
Duas semanas após a colocação da ligadura, quando comparados os grupos não ligadura e ligadura, houve diferenças significativas na altura óssea observada pela análise linear (Figura 6A, B e C) e no volume de perda óssea pela análise volumétrica (Figura 6D). A perda óssea linear no grupo IP induzido por ligadura foi significativamente maior em comparação com o grupo controle. Da mesma forma, quando comparado a perda óssea volumétrica, o grupo IP apresentou perda óssea circunferencial mais significativa em relação ao grupo controle.

Figura 6: Análise microtomográfica. (A) Cortes microtomográficos representativos dos grupos controle (não ligadura - NL) e (B) periimplantite (ligadura - L). (C) Gráfico representa a distância média da cabeça do implante ao osso alveolar 2 semanas após a ligadura. (D) O gráfico representa a perda óssea volumétrica circunferencial média 2 semanas após a ligadura. *p<0,05 (n≥5 para todos os grupos/momentos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação histológica
Para determinar alterações celulares, incluindo perda óssea ao redor do implante, amostras descalcificadas foram seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina (HE) (Figura 7). O processo de descalcificação foi realizado por imersão das amostras em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 15%, pH 7,4, durante quatro semanas, trocando-se a solução a cada três dias. Com a retirada dos implantes, os espécimes foram incluídos em parafina. Assim, cortes de parafina de dimensões sagitais de 5 μm de espessura foram corados com HE, seguindo protocolos padrão. Como resultado, observou-se maior migração epitelial apical, infiltração celular moderada e perda óssea nas amostras periimplantite quando comparadas ao grupo controle.

Figura 7: Imagens representativas de H&E sagital dos grupos de ligadura (NL) (A) e (B) não ligadura (L). Aumento da migração epitelial apical e perda óssea no grupo ligadura em relação ao grupo controle. Ampliação de 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

De acordo com o consenso mais recente sobre a classificação das doenças e condições peri-implantares, o diagnóstico de peri-implantite requer perda óssea além das alterações do nível ósseo crestal decorrentes da remodelação ósseainicial22. Portanto, nosso estudo apresenta parâmetros diagnósticos de periimplantite bem estabelecidos e validados. E oferecer uma avaliação abrangente da condição sob investigação.

Os autores não têm nada a revelar.