Artigo de método

Um fluxo de trabalho para a avaliação quantitativa dos microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos da casca de Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

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27 de junho de 2025

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1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho confiável e eficiente, desde a coleta de amostras até a análise de dados, para traçar o perfil dos microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos presentes na casca de Populus trichocarpa.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os microrganismos que colonizam as superfícies das plantas e os tecidos internos podem possuir funções benéficas na promoção do crescimento e da saúde das plantas. No entanto, as informações sobre o microbioma dos tecidos da casca de plantas lenhosas permanecem limitadas, especialmente no que diz respeito à microbiota bacteriana endofítica e epífita da casca de Populus. Para superar essa limitação, estabelecemos um fluxo de trabalho para quantificar a composição e a diversidade da microbiota bacteriana endofítica e epífita que coloniza a casca de Populus trichocarpa. Resumidamente, a epiderme do caule de P. trichocarpa foi repetidamente limpa com uma bola de algodão embebida em 0,1% Tween 20 para adquirir amostras bacterianas epífitas. A epiderme descascada foi esterilizada e, em seguida, repetidamente congelada e triturada usando nitrogênio líquido e um batedor de contas, respectivamente, para coletar amostras bacterianas endofíticas. O DNA genômico foi extraído das comunidades bacterianas epífitas aderidas ao algodão e da casca triturada de P. trichocarpa, e submetido à amplificação da reação em cadeia da ploymerase (PCR) com primers direcionados às regiões hipervariáveis V5-V7 e V4 do gene bacteriano 16S rRNA. Três repetições dos produtos de PCR obtidos de cada amostra endofítica ou epífita foram misturadas em concentrações iguais para construir a biblioteca de amplicons, que foi então sequenciada. As sequências obtidas foram analisadas por splicing de sequências, filtragem de qualidade, remoção de quimera e anotações taxonômicas. Em resumo, estabelecemos um fluxo de trabalho confiável e eficiente desde a coleta de amostras até a análise de dados para determinar os microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos da casca de P. trichocarpa por meio do perfil do gene 16S rRNA. Juntamente com os métodos de exploração da microbiota colonizando cascas estabelecidos no estudo anterior, nossa metodologia pode servir como um modelo para o desenho de protocolos para investigar o microbioma da casca de outras espécies de plantas lenhosas, particularmente árvores de florestas economicamente importantes.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A casca é a camada mais externa dos caules das plantas lenhosas, referindo-se a todos os tecidos fora do câmbio vascular, incluindo o floema e a periderme 1,2. Uma extensa pesquisa demonstrou que a casca desempenha papéis fundamentais na translocação de água e carboidratos, na proteção das árvores contra incêndios e danos mecânicos3 e na adaptação a estresses abióticos4e bióticos5. Mais importante, como a interface entre uma árvore e o ar circundante, a casca também serve como um habitat único para microorganismos6. Notavelmente, foi confirmado que os micróbios associados à casca possuem as funções de promover o crescimento do hospedeiro7, auxiliar as árvores na aquisição de nutrientes8, aumentar a síntese de hormônios vegetais9 e proteger os hospedeiros da infecção por fitopatógenos5. No entanto, muito menos atenção tem sido dada às comunidades microbianas que colonizam a casca em comparação com a microbiota da filosfera e rizopsfera10,11. Existe um conhecimento limitado sobre as características biológicas do microbioma da casca das árvores. O objetivo do presente artigo metodológico é fornecer aos investigadores um conjunto de protocolos para descrever a diversidade e composição do microbioma bacteriano endofítico e epífito da casca de plantas lenhosas.

Com base nos métodos publicados para investigar a microbiota da casca12,13 neste trabalho, projetamos e testamos um fluxo de trabalho elaborado baseado na análise de sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA para explorar o microbioma bacteriano que estabelece os tecidos internos ou as superfícies da casca do caule de Populus trichocarpa, um importante organismo modelo usado na biologia de plantas lenhosas14. P. trichocarpa tem as características de crescimento rápido15, relativa facilidade de manipulação experimental16 e fácil transformação genética, além de ser conhecido por sua ampla aplicação na produção de madeira17. Especificamente, o método proposto neste trabalho começa com uma descrição detalhada da amostragem da microbiota endofítica e epífita da casca do caule de P. trichocarpa. Com a inclusão de uma etapa de esterilização superficial da casca com álcool e hipoclorito de sódio após a colheita do microbioma colonizador da superfície, este estudo estabeleceu um procedimento para coleta simultânea e separada de microrganismos residentes na estrutura interna da casca (endófitos) e aqueles que vivem na superfície externa da casca (epífitas). Até onde sabemos, entre os estudos publicados sobre o microbioma da casca da planta lenhosa, nenhum ensaio foi realizado nas comunidades microbianas endofíticas e epífitas coletadas da mesma amostra de casca com base em uma distinção clara feita entre os nichos interno e externo da casca 18,19,20. Assim, o método desenvolvido nesta pesquisa permitirá aos pesquisadores examinar a diversidade e a composição das comunidades bacterianas que habitam a casca de maneira precisa e abrangente. Além disso, este estudo fornece descrições detalhadas dos procedimentos para extração de DNA genômico, amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), preparação da biblioteca de sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA21 e análise de dados de sequenciamento. Em particular, este estudo empregou um par de primers direcionados às regiões hipervariáveis V5-V7 do gene bacteriano 16S rRNA para reduzir a amplificação inespecífica das sequências mitocondriais e de cloroplastos de plantas hospedeiras22, o que produziu perfis imparciais do microbioma associado à casca. As α-diversidades foram avaliadas usando o índice de Shannon23, um índice de diversidade popular amplamente utilizado na pesquisa de ecologia, e a composição taxonômica no nível do filo foi calculada e visualizada no software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24e R25. Juntamente com os métodos de exploração de cascas colonizadoras da microbiota estabelecidos no estudo anterior 1,6, nossa metodologia pode servir como um modelo para o projeto de protocolos para estudar o microbioma da casca de outras espécies de plantas lenhosas, particularmente árvores florestais economicamente importantes.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coleta de amostras

  1. Cresça P. de 3 meses.mudas de trichocarpa em uma câmara de crescimento (21–25°C; ciclo de 16 h de luz/8 h de escuridão com luz suplementar de aproximadamente 300 μEm−2 s−1 de uma lâmpada fluorescente linear de três bandas [T5 28 W 6400 K]; e 60–80% de umidade)26.
  2. Corte os segmentos de caule de 10 cm de comprimento de P. trichocarpa de 2 a 12 cm acima da superfície do solo esterilizado (Figura 1A) usando um podador esterilizado. Coloque os segmentos de caule em uma placa de Petri quadrada esterilizada (13 cm x 13 cm).
    NOTA: Seis árvores do mesmo tamanho foram selecionadas para este estudo, das quais três foram utilizadas para a amplificação por PCR com cada conjunto de primers.

2. Processamento de amostras

  1. Limpe repetidamente a epiderme do caule na placa de Petri quadrada esterilizada usando um cotonete estéril embebido em 0,1% Tween 20 para coletar com mais eficiência os microrganismos que colonizam as superfícies da casca (Figura 1B).
    NOTA: Algodões estéreis sub-úmidos são usados para coletar microorganismos aderidos à superfície do caule. Não use algodão muito seco ou muito úmido ao limpar a superfície do caule. Tween 20 é um surfactante capaz de reduzir a tensão superficial, propriedade benéfica para a obtenção de mais amostras microbianas das superfícies das plantas27,28.
  2. Corte a ponta de algodão do cotonete usando uma lâmina estéril e coloque cada ponta de algodão contendo amostras microbianas epífitas em um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL. Armazene as amostras a -80 °C.
  3. Depois de limpar a superfície do caule, corte a casca da qual os microrganismos epífitos foram amostrados usando um bisturi estéril, retire a casca e coloque-a em uma placa de Petri quadrada.
  4. Corte a casca descascada do caule na etapa 2.3 em segmentos de aproximadamente 1 cm (Figura 1C) com um bisturi estéril.
  5. Esterilize os segmentos mergulhando-os em álcool 70% (v/v) por 2 min. Em seguida, mergulhe os segmentos em hipoclorito de sódio (2,5% de teor efetivo de cloro) suplementado com 0,1% de Tween 80 por 5 min.
  6. Esterilizar os segmentos obtidos na etapa 2.5 por 30 s em álcool 70% (v/v)29. Em seguida, lave todas as amostras três vezes com água destilada estéril e coloque-as em uma bancada limpa para secar ao ar.
    NOTA: As amostras de casca são agitadas para frente e para trás usando pinças estéreis para garantir esterilização suficiente da superfície.
  7. Armazene cada segmento de casca do caule esterilizado na superfície (amostras endofíticas) em um tubo de centrífuga estéril de 2 mL a -80 ° C.

3. Extração de DNA genômico

  1. Execute as etapas a seguir para pré-tratar as amostras para extração de DNA.
    1. Coloque os segmentos de casca do caule esterilizados na superfície obtidos na etapa 2.7 em tubos rígidos estéreis de 5 mL e adicione três esferas de aço esterilizadas (4 mm) em cada tubo.
      NOTA: Execute esta etapa em uma bancada limpa para evitar contaminação microbiana. As bolas de algodão preparadas na etapa 2.2 (amostras epífitas) não precisam ser pré-processadas e são usadas diretamente para extração de DNA genômico.
    2. Congele os tubos rígidos contendo as amostras em nitrogênio líquido por 10 min.
    3. Esmague as amostras de casca por 5 min com um batedor de contas. Em seguida, congele o tubo rígido novamente em nitrogênio líquido por 1 min e repita a etapa de bater o cordão por 5 min.
  2. Extraia DNA genômico.
    NOTA: Use um kit comercial de extração de DNA para isolar o DNA genômico das amostras endofíticas e epífitas.
    1. Adicione a casca do caule esmagado de P. trichocarpa e as comunidades bacterianas epífitas aderidas ao algodão (0,25 g cada) a cada um dos tubos de contas. Em seguida, adicione 60 μL da solução C1 fornecida por um kit comercial e misture suavemente por inversão.
    2. Em seguida, homogeneizar as amostras endofíticas e epífitas usando um batedor de esferas em quatro corridas de 1 minuto. Após cada corrida, coloque as amostras no gelo por 30 s.
    3. Centrifugue os tubos a 10.000 x g por 1 min.
    4. Extrair as amostras endofíticas e epífitas utilizando um kit (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
    5. Adicionar 30 μL da solução C6 ao centro da membrana filtrante branca e incubar a 25 °C durante 5 min.
    6. Centrifugue a 10.000 x g em temperatura ambiente por 1 min.

4. Amplificação por PCR

  1. Padronize a concentração de DNA extraído.
    1. Medir as concentrações do ADN genómico extraído de amostras epífitas e endofíticas utilizando um espectrofotómetro de microvolume.
    2. Dilua cada amostra de DNA com ddH2O estéril a 2 ng/μL para obter o molde de DNA para amplificação por PCR.
  2. Amplifique essas amostras de DNA.
    1. Amplificar a região V5-V7 do gene bacteriano 16S rRNA usando o primer direto 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') e o primer reverso 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. Amplificar a região V4 do gene bacteriano 16S rRNA usando o primer direto 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') e o primer reverso 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      NOTA: O DNA genômico extraído de cada amostra é utilizado como modelo para cada uma das reações de amplificação de PCR triplicadas, e uma reação adicional sem DNA é definida como controle negativo. Para cada amostra, o volume da mistura de reação de PCR é de 25 μL. Para o par de primers 799F / 1193R, cada reação contém 12 μL de água de PCR, 1 μL de cada um dos primers F / R (10 μM), 1 μL de molde de DNA e 10 μL de solução de mistura. Para o par de primers 515F / 806R, cada reação contém 12 μL de água de PCR, 1 μL de cada um dos primers F / R (10 μM), 1 μL de molde de DNA e 10 μL de solução de mistura. As reações de PCR com o par de primers 799F/1193R são realizadas com as seguintes condições de ciclo: desnaturação inicial a 98 °C por 5 min, 25 ciclos de 98 °C por 30 s, 53 °C por 30 s e 72 °C por 45 s, e uma extensão final a 72 °C por 5 min. As reações de PCR com o par de primers 515F / 806R são conduzidas com as seguintes condições de ciclo: desnaturação inicial a 94 ° C por 3 min, 35 ciclos de 94 ° C por 45 s, 50 ° C por 60 s e 72 ° C por 90 s e uma extensão final por 10 min a 72 ° C.
    2. Misture bem cada amostra e centrifugue para eliminar bolhas.
    3. Realize a amplificação da região V5–V7 ou V4 dos genes bacterianos 16S rRNA em um termociclador.
  3. Detecte os produtos amplificados.
    1. Carregue 5 μL de cada amplicon em um gel de agarose a 1% e realize eletroforese a 120 V por 30 min.
    2. Visualize o gel sob luz UV para validar a amplificação de PCR bem-sucedida. Os tamanhos dos produtos de PCR obtidos com os pares de primers 799F/1193R e 515F/806R devem ser de aproximadamente 430 pb e 400 pb, respectivamente.

5. Preparação da biblioteca de sequenciamento de amplicon

  1. Misture os produtos amplificados e determine suas concentrações.
    1. Misture os produtos gerados a partir das três réplicas da amplificação por PCR para cada amostra em um tubo de PCR.
    2. Adicione 5 μL dos produtos de PCR e 195 μL de solução de trabalho em um poço de uma microplaca de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante para o kit (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, adicione 10 μL do DNA padrão (reagentes de DNA com concentrações de 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 ng / μL do kit) e 190 μL de solução de trabalho em um poço da mesma microplaca. Após esta etapa, determine a intensidade de fluorescência dos produtos de PCR e do DNA padrão.
    3. Meça a fluorescência usando um leitor de microplacas.
      NOTA: A excitação/emissão dos comprimentos de onda padrão da fluoresceína é ajustada em 480/530 nm para medir a quantidade de ADN de fita dupla em cada amostra.
    4. Estabelecer a curva padrão das concentrações de ADN e das intensidades de fluorescência utilizando as concentrações de ADN padrão das soluções de ADN padrão (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 ng/μL) e a intensidade de fluorescência de cada uma das soluções de ADN padrão. Substitua o valor da intensidade de fluorescência de cada um dos produtos de PCR na curva padrão para calcular as concentrações de DNA dos produtos de PCR.
  2. Crie bibliotecas de sequenciamento amplicon.
    1. De acordo com as concentrações detectadas na etapa 5.1.4, misture os demais produtos de PCR amplificados pelo mesmo par de primers em concentrações iguais para construir a biblioteca de sequenciamento de amplicon.
      NOTA: A fração dos produtos de PCR de cada amostra usada para quantificar a concentração do DNA de fita dupla medindo a intensidade de fluorescência não está incluída na biblioteca de sequenciamento de amplicon, que é construída a partir dos produtos de PCR restantes da mesma amostra.
  3. Realize a extração do gel.
    1. Realize eletroforese em gel de agarose usando aparelho de eletroforese. Resumidamente, prepare um gel de agarose a 1,3% (ou seja, 1,3 g de pó de agarose em 100 mL de 1 x tampão TAE).
      NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a quantidade de alvéolos no gel seja suficiente para conter cada produto de PCR e escada de DNA; neste estudo, o gel de agarose a 1,3% é preparado dissolvendo 1,3 g de pó de agarose em 100 mL de tampão 1 x TAE.
    2. Remova os pentes após a solidificação do gel e coloque o gel em um tanque de eletroforese com 1 x tampão TAE. Em seguida, adicione 1 unidade de volume de 6 x tampão de carregamento laranja a 5 unidades de volume de cada produto de PCR, com 100 μL deste último carregado em cada poço. Adicione 30 μL da escada de DNA a um poço. Após conectar os fios positivo e negativo, realize eletroforese a 80 V por 50 min.
      NOTA: Neste estudo, a extração em gel é empregada para purificar a biblioteca de sequenciamento de amplicon representada pela banda de 400 pb ou 430 pb amplificada com o par de primers 515F / 806R ou 799F / 1193R, respectivamente.
    3. Extirpar fragmentos de ADN do gel de agarose com um bisturi limpo e afiado.
    4. Pese a fatia de gel e transfira-a para um tubo incolor. Adicione tampão para mergulhar a fatia de gel.
      NOTA: A quantidade máxima de gel por coluna de centrifugação é de 400 mg. Três unidades de volume de buffer são adicionadas a uma unidade de volume de uma determinada fatia de gel.
    5. Realize a extração de gel usando o Kit de Extração de Gel (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: A biblioteca de amplicons construída a partir dos produtos da PCR direcionada ao gene bacteriano 16S rRNA usado para sequenciar as comunidades bacterianas endofíticas e epífitas é obtida usando este método.
  4. Confirme a qualidade da biblioteca de sequenciamento de amplicon purificada.
    1. Determine a concentração de DNA de fita dupla na biblioteca de sequenciamento de amplicon purificada obtida na etapa 5.3.5 por um fluorômetro usando um kit comercial (consulte a Tabela de Materiais) seguindo o protocolo do fabricante (Figura 2).
    2. Determine o tamanho do fragmento de DNA alvo da biblioteca de sequenciamento de amplicon obtida na etapa 5.3.5 usando um sistema de análise de controle de qualidade de ácido nucleico com chips e kits comerciais (consulte a Tabela de Materiais) seguindo o protocolo do fabricante.
      NOTA: Certifique-se de que o tamanho do fragmento esteja dentro do intervalo esperado e que não haja dímeros de primer na biblioteca de sequenciamento de amplicon.
    3. Determine a concentração efetiva da biblioteca de sequenciamento obtida na etapa 5.3.5 usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) com um kit comercial (consulte a Tabela de Materiais) seguindo o protocolo do fabricante.
    4. Dilua a biblioteca de sequenciamento do amplicon para atender à concentração de carga recomendada para a plataforma de sequenciamento.

6. Processamento de sequências e análise estatística

  1. Após o sequenciamento, a biblioteca amplicon obtida na etapa 5.4.4 usando uma plataforma de sequenciamento (ver Tabela de Materiais)31. Crie uma pasta chamada emp-paired-end-sequences no diretório de trabalho e salve o arquivo de sequenciamento compactado no formato fastq nessa pasta. Em seguida, abra o Ubuntu e ative o ambiente conda e o Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Escreva um arquivo de mapeamento e salve-o como um arquivo de texto. O conteúdo do arquivo é mostrado na Tabela 2.
  3. Divida os dados de sequenciamento obtidos com a biblioteca de sequenciamento amplicon e remova os primers dos dados de sequenciamento usando o arquivo de mapeamento.
    1. Use o seguinte comando para dividir os dados de sequenciamento: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Use o seguinte comando para remover primers: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F or 515F --p-front-r 1193R or 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Filtre e remova qualquer quimera usando o pipeline DADA233. Agrupe as sequências filtradas em variantes de sequência de amplicon (ASVs) com 99% de similaridade.
    1. Use o seguinte comando para filtrar e remover sequências de quimera e cluster em ASVs: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Faça anotações taxonômicas usando o banco de dados SILVA (v138) com base nas sequências de referência34.
    1. Use o seguinte comando para anotar os ASVs obtidos na etapa 6.4: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Crie uma tabela ASV no QIIME2 (v2021.2) usando os seguintes comandos:
    qiime tools export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomia.tsv --observation-header OTUID, taxonomia --sc-taxonomia separada
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taxonomia
    NOTA: Esses comandos geram uma tabela contendo o número de leituras de todos os ASVs para cada amostra.
  7. Calcule o número de ASVs e leituras das comunidades bacterianas endofíticas e epífitas geradas com os pares de primers 799F / 1193R e 515F / 806R, respectivamente.
    1. Calcule o número total de ASVs com ≥ 1 leituras nos níveis de filo, classe, ordem, família e gênero, respectivamente, em cada amostra na tabela ASV obtida na etapa 6.6 por contagem.
    2. Calcule o número total de leituras em cada amostra com base na soma do número de leituras de todos os ASVs na tabela ASV obtida na etapa 6.6 por contagem.
    3. Calcule o número de leituras de plantas em cada amostra usando o número de leituras de ASVs anotadas como cloroplastos ou mitocôndrias na tabela ASV obtida na etapa 6.6 por contagem.
    4. Calcule o número de leituras bacterianas em cada amostra usando a seguinte fórmula:
      Número de leituras bacterianas = Número de leituras totais − Número de leituras de plantas.
    5. Calcule e visualize o número médio de ASVs (nos níveis de filo, classe, ordem, família e gênero, respectivamente) ou leituras (no total ou de planta e bactéria, respectivamente) das comunidades bacterianas endofíticas e epífitas geradas pelos pares de primers 799F / 1193R e 515F / 806R usando os softwares Excel (2019) e Prism (v8.0).
    6. Avalie a significância das diferenças entre os números de ASVs (nos níveis de filo, classe, ordem, família e gênero, respectivamente) ou leituras (no total ou de planta e bactéria, respectivamente) geradas com os pares de primers 799F / 1193R e 515F / 806R usando o teste t de Student no software Prism (v8.0).
  8. Filtre as leituras anotadas como cloroplastos e mitocôndrias usando o seguinte comando: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitocôndrias, cloroplasto --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Crie uma árvore filogenética usando o seguinte comando: time qiime filogenia align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree-rooted-tree.qza
  10. Calcule e visualize as diversidades alfa representadas pelo índice de Shannon das comunidades bacterianas endofíticas e epífitas usando o QIIME2 (v2021.2) e o pacote 'ggplot2' em R (v4.0.5)35.
    1. Use o seguinte comando para calcular as diversidades alfa: tempo qiime diversidade core-metrics-phylogenetic --i-filogenia rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth o menor valor de leitura entre todas as amostras --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Calcule as abundâncias relativas das populações no nível do filo das comunidades bacterianas endofíticas e epífitas. Gere um arquivo no formato qzv chamado "taxa-bar-plots" usando o seguinte comando do QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Abra o arquivo taxa-bar-plots.qzv online em https://view.qiime2.org/. Baixe e salve o arquivo recém-gerado do level2. Calcule a abundância relativa pela seguinte fórmula com R (v4.0.5):
      Abundância relativa de cada filo bacteriano (%) = (número de leituras de cada filo bacteriano em cada amostra / número de leituras totais de cada amostra) x 100 %.
      Visualize os dados usando os pacotes ggplot2, RColorBrewer, reshape e ggalluvial no R (v4.0.5).
  12. Analise a significância da diferença entre a abundância relativa de cada um dos filos dominantes (definidos como um filo que possui uma abundância relativa de > 0,5%) nas comunidades bacterianas endofíticas e epífitas sequenciadas com o par de primers 799F / 1193R usando a análise de variância (ANOVA) unidirecional com o teste post-hoc de Tukey a um nível de significância de 0,05 no software STAMP36.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA genômico de alta qualidade dos microbiomas bacterianos endofíticos e epífitos da casca de P. trichocarpa foi obtido usando o protocolo otimizado (Tabela 1). A amplificação por PCR de todas as 12 amostras produziu bandas fortes únicas com o tamanho correto (Figura 3). Ambos os pares de primers 799F / 1193R e 515F / 806R amplificaram com sucesso os produtos-alvo de amostras de tecido de casca endofítica ou epífita em torno de 40...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvido a partir da metodologia publicada para examinar a microbiota da casca 7,18, o fluxo de trabalho proposto por nós fornece orientação geral para identificar e caracterizar microbiomas endofíticos e epífitos da casca de plantas lenhosas. Este método compreende protocolos para coleta e processamento de amostras, extração de DNA genômico, amplificação por PCR, preparação de bibliotecas de sequenciamento de amplicon e anál...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Sr. David Anthony Atherton por fornecer a narração em vídeo e aos membros do laboratório BN por conselhos valiosos. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da China (número de concessão 32071741 [para BN]), os Principais Projetos do Plano de P&D na Região Autônoma Uigur de Xinjiang (número de concessão 2022B02014), o Plano de Introdução de "Talentos Tianchi" (para BN), o Programa Nacional de P&D da China (número de concessão 2021YFD2200203 [para GQ]) e o Projeto de Inovação do Laboratório Estadual de Genética e Melhoramento de Árvores (Universidade Florestal do Nordeste) (número de concessão 2019A01 [para BN]).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento:
Batedor de esferasDHS Life Science401265
Centrífuga para tubos de 1,5 mLde 75002440Thermo Scientific
para tubos de PCR Leitor
microplacasBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Fornecedor:Technology Co., Ltd.2010/2020 espectrofotômetro de microvolume
Fluorômetro Qubit 3.0fluorômetro invitrogenQ33216 
Refrigerador(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 TermocicladorBio-Rad1861096termociclador
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313Para eletroforese
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Library Detecção de distribuição de fragmentos de DNA, análise de controle de qualidade de ácidos nucleicos
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Quantification library
Illumina Novaseq6000Illumina Materiais de sequenciamento de biblioteca
:
LuvasQualquerde
10 μ LAxygenTF-300-R-S
ponta de barreira de aerossol 20μ LAxygenTF-20-R-S
ponta de barreira de aerossol 200μ BarreiraAxygenTF-200-R-S
tipr 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
de centrífuga 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96-well Preto/Transparente Microplaca de Fundo PlanoCorning3631
bastão de algodãoZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100Para extração de DNA
de centrífuga sem enzimas 1.5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
etanolTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
tubos rígidos(5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
2.0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR ÁguaQIAGEN Kit de Extração de Gel QIAquick 17000-10
 QIAGEN28704Para extração de gel
Quant-iT dsDNA Kits de ensaio, ampla gamaInvitrogenQ33130Para determinação da concentração dos produtos amplificados e das bibliotecas de amplicon purificadas
placa de Petri quadradaChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
contas de açoShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
solução de hipoclorito de sódioTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Kit de reagentes de alta sensibilidade de DNA de protocolo duploPerkinElmerCLS760672biblioteca de DNA
Kit de quantificação de biblioteca VAHTS para IlluminaVazyme Biotech Co., LtdNQ104Biblioteca de quantificação
Centrífuga de ponta barreira de aerossol NA de aerossol tubo tubo Tubo de microcentrífuga YXB36985 detecção de

Referências

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