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Artigo de método

Um aparelho de exercícios de peixe-zebra induzido por natação para abordagens de treinamento versáteis

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DOI:

10.3791/66382

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18 de outubro de 2024

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1Exercise Genetics and Metabolism Laboratory, Molecular Biology Program, Department of Biophysics, Federal University of São Paulo, 2Exercise Genetics and Metabolism Laboratory, Nephrology Program, Department of Biophysics, University Federal of Sao Paulo

Neste artigo

Resumo

O aparelho de exercícios projetado para peixes menos afortunados facilita a implementação de diversos protocolos de exercícios com intensidades variadas, manipulando a velocidade do fluxo de água, alcançável por meio da reotaxia.

Resumo

Para investigar de forma abrangente os efeitos do exercício na saúde e na doença, os modelos animais desempenham um papel fundamental. O peixe-zebra, um organismo modelo de vertebrado amplamente utilizado, oferece uma plataforma única para tais estudos. Este estudo introduziu o desenvolvimento de um aparelho econômico adaptado para estudos de exercícios de peixe-zebra utilizando materiais prontamente disponíveis. O dispositivo é baseado nos princípios de um túnel de natação e engloba uma rede de tubos e válvulas ligados a uma bomba submersível. O fluxo de água é meticulosamente monitorado por um sensor e regulado por válvulas . Para avaliar a eficácia do aparelho, foram implementados dois protocolos de treinamento: treinamento contínuo de intensidade moderada (MICT) e treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT). Os peixes foram treinados coletivamente e seu desempenho na natação foi avaliado por meio de um teste de resistência. Ambos os protocolos de treinamento levaram a melhorias no desempenho da natação após 30 dias de treinamento e induziram alterações na resposta molecular ao exercício em comparação com um grupo controle sedentário. Notavelmente, o HIIT demonstrou eficiência superior em relação ao MICT. O sistema de treinamento do peixe-zebra provou ser uma ferramenta valiosa para investigações em fisiologia do exercício e avança ainda mais a utilidade do modelo do peixe-zebra neste campo.

Introdução

O exercício físico engloba qualquer movimento corporal realizado pelos músculos esqueléticos que resulte em aumento do gasto energético, sendo o exercício um subconjunto estruturado e repetitivo das atividades físicas1. O exercício, uma atividade multifatorial e econômica que envolve todo o corpo, traz inúmeros benefícios à saúde, como a prevenção da síndrome metabólica e da sarcopenia2. Consequentemente, o campo da fisiologia do exercício tem um interesse significativo, pois busca elucidar como o corpo se adapta ao estresse agudo do exercício, ao estresse crônico do treinamento físico e ao impacto geral do exercício na saúde1.

A realização de estudos de fisiologia do exercício em humanos pode ser cara e demorada devido a desafios no projeto experimental e no monitoramento dos participantes3. Portanto, o uso de modelos animais em ambientes laboratoriais tem sido altamente recomendado devido à sua uniformidade genética e fisiológica. Além disso, em condições controladas de laboratório, os animais geralmente têm estilos de vida sedentários e ingestão regularde alimentos 4. Dentre os modelos animais, os roedores têm sido os mais empregados em pesquisas envolvendo exercício físico1. No entanto, o peixe-zebra (Danio rerio; Hamilton, 1822) é um modelo complementar aos murinos e outras espécies para estudos de exercício 5,6,7,8.

Na pesquisa com peixe-zebra, o exercício físico pode ser realizado usando túneis de natação disponíveis comercialmente ou personalizados. Dentre as opções disponíveis comercialmente, o túnel do tipo Blazka, desenvolvido pelo Sistema Loligo, é o mais utilizado 7,9,10. Este sistema induz a natação forçada através de uma hélice acoplada a um motor elétrico, gerando um fluxo contínuo de água dentro do túnel. Essa capacidade de natação está enraizada no princípio da reotaxia, um comportamento inato nos peixes que os leva a nadar contra as correntes de água e manter sua posição11. A reotaxia permite a medição da velocidade crítica de natação (Ucrit), representando a velocidade máxima que um peixe pode sustentar por um período específico. No entanto, vale ressaltar que esse equipamento, embora valioso para avaliar o comportamento de natação e o consumo de oxigênio, tem um custo significativo12.

Os pesquisadores desenvolveram aparelhos alternativos para o exercício do peixe-zebra, muitas vezes baseados no mecanismo do tipo Blazka10,13,14 ou mecanismos mais simples 8,15,16. No entanto, esses métodos podem ser limitados pelas demandas técnicas do protocolo, incluindo durações prolongadas, despesas substanciais com equipamentos e limitações de rendimento e precisão. Consequentemente, o objetivo principal do estudo foi projetar um sistema de exercícios de peixe-zebra acessível e fácil de usar, usando materiais prontamente disponíveis, fornecendo um novo aparelho alternativo para exercícios físicos em peixes. Um objetivo secundário era implementar regimes de exercícios aeróbicos e anaeróbicos em peixe-zebra, avançando ainda mais na utilização do modelo de peixe-zebra como estratégia de intervenção na pesquisa de exercícios.

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Protocolo

Os procedimentos receberam aprovação prévia do Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo (CEUA/UNIFESP nº 9206260521). Apenas fêmeas adultas de Danio rerio selvagem, com 6 meses de idade e peso de 2,5 a 3 g, foram empregadas neste estudo. O equipamento e os reagentes necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aparelho de exercício de peixe-zebra feito sob medida

NOTA: O aparelho de exercícios foi feito sob medida. Para obter detalhes, consulte a Figura 1, a Tabela Suplementar 1, o Arquivo Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 2.

  1. Coloque uma bomba submersível (N) dentro de um tanque de água (O) (≥30 L). Certifique-se de que a água atende às seguintes condições: pH de 7,2 ± 0,5 e 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
  2. Fluxo Suplementar Tabela 1 e Figura 1, conecte o Tubo (I) ao ponto do Tubo em T (B) e conecte um pequeno tubo (G) ao lado de B. A partir de G, estabelecer conexões com a Válvula Globo (F), depois com outra G, e em sequência com o Cotovelo do Tubo (A) e I, completando assim o segmento responsável pela regulação da pressão da água dentro do sistema. Esta regulação é conseguida através de um fluxo de retorno para o tanque de água (O).
  3. Na seção alternativa de B, conecte-o a um tubo (J), seguido de conexões a A e G. Utilize o encaixe do tubo de soquete (D) para conectar a válvula de água do portão (E) a G.
  4. Integre uma porta de entrada de peixes no sistema conectando B a G em uma extremidade e anexando outro G na extremidade oposta. Em seguida, conecte o encaixe do soquete (C) a este segundo G, estabelecendo uma sequência que se conecta ao tubo de acrílico (K), que é crucial para visualizar o comportamento da natação.
    1. Para ligar K ao Sensor de Fluxo de Água (M), utilize os tubos C, G e D. Prossiga para conectar M a G usando D e, em seguida, integre A, G e H para facilitar o retorno da água ao reservatório.
      NOTA: Insira uma tela mosquiteira no segmento do tubo curto entre a comporta e a válvula globo (F2) para evitar que os peixes acessem outras seções do aparelho. A válvula globo (F) tem um duplo propósito. A primeira válvula globo (F1) controla o fluxo de água que retorna ao reservatório antes de entrar no restante do aparelho, atuando como uma válvula de controle de pressão do sistema. A válvula globo (F2) é um ponto de entrada e saída para o peixe-zebra dentro do sistema.
  5. Conecte um sensor de fluxo de água a jusante do tubo de acrílico.
    NOTA: O sensor de fluxo deve ser conectado a um display LCD e programado usando um Arduino (Figura 1). Os detalhes da configuração do Arduino são fornecidos no Arquivo Suplementar 2.

2. Operação do aparelho

  1. Para introduzir os peixes com segurança no sistema, é essencial interromper o fluxo de água. Para conseguir isso, feche a válvula gaveta (E) enquanto mantém a válvula globo (F1) aberta. Em seguida, abra a válvula globo (F2), que serve como entrada para o sistema, introduza suavemente os peixes e feche imediatamente a válvula F2. Por fim, abra a válvula E para encher a área de exercícios com água.
  2. Use a válvula globo para controlar a velocidade do fluxo, desviando a água de volta para o reservatório quando necessário.
  3. Utilize a válvula gaveta (F2) para ajuste preciso do fluxo e para gerenciar o acesso dos peixes.
  4. Para retirar o peixe no final do ensaio, fechar a válvula (E) após observar os critérios de esgotamento. Em seguida, abra a válvula F e gire-a 180° em relação ao eixo do tubo de acrílico; Isso facilitará a drenagem da água que carrega os peixes exaustos junto com ela.
  5. Execute o monitoramento de fluxo.
    NOTA: É necessário monitorar a velocidade do fluxo de água através de um sistema que incorpore um Arduino Nano, uma tela LCD de 16 x 2, um resistor de 10 kΩ, 0.25 W e um potenciômetro de 10 kΩ. O sensor de fluxo monitora continuamente a velocidade do fluxo de água com base na tecnologia Hall Effect17. Cada pulso de corrente corresponde a uma revolução do flopper do sensor, resultando em uma frequência (Hz) de 6,6 x Q (vazão em L/min).
    1. Conecte os fios apropriados do sensor de fluxo aos pinos de 5 V, GND e D2 do Arduino Nano (Tabela Suplementar 1). Carregue o esboço fornecido (Supplemental File 1) no Arduino usando o Arduino IDE. Ligue o sistema através da porta USB do Arduino.
      NOTA: As medições de vazão são exibidas na tela LCD de 16 x 2. A calibração do sensor de fluxo de água é mostrada na Figura 2. Os esquemas das conexões do Arduino com o LCD são ilustrados na Figura 3.

3. Teste de resistência

NOTA: Esta etapa descreve o procedimento para o teste de resistência para determinar a velocidade máxima de natação (Umax) do peixe-zebra.

  1. Primeiro, permita que os peixes se adaptem por 60 minutos por dia a uma baixa velocidade de fluxo de água (0,06 m/s) dentro do túnel de natação por duas semanas.
    NOTA: Após um período de pré-condicionamento de 24 horas, o peixe-zebra individual será submetido ao teste de desempenho de natação sustentada. O objectivo deste ensaio é estabelecer o Umax de cada peixe.
  2. Coloque o peixe-zebra individualmente no aparelho.
  3. Condições de teste: Posicione o peixe contra um fluxo de água com uma velocidade inicial de 0,06 m/s por 10 min.
  4. Incrementos de velocidade: Aumente o fluxo de água em estágios discretos, com incrementos de velocidade de 0,02 m/s ocorrendo a cada minuto por 40-50 min.
  5. Determinação Umax: Registar a velocidade máxima de natação (Umax) quando os peixes satisfizerem os critérios de exaustão.
    NOTA: A exaustão é definida quando a primeira das seguintes situações é observada: (1) Incapacidade de manter sua posição contra o fluxo de água por mais de três instâncias, ou (2) Incapacidade de sustentar sua posição por mais de 5 s.
  6. Feche a válvula (E) observando os critérios de exaustão. Em seguida, abra a válvula F e gire-a 180° em relação ao eixo do tubo de acrílico. Isso facilitará o escoamento da água, carregando os peixes exaustos.

4. Grupos de exercícios e procedimento

NOTA: Para estabelecer protocolos de exercícios distintos, é essencial incluir um grupo sedentário exposto a condições experimentais idênticas para comparar os efeitos dos protocolos de exercícios, embora sem realizar exercícios de alta intensidade. Também é essencial estabelecer o Umax porque as frações do valor do Umax são necessárias para determinar a intensidade dos protocolos de exercício.

  1. Grupo sedentário (SED): Submeter os peixes a nadar forçadamente contra o fluxo de água a 0,06 m/s por 60 min.
    NOTA: O aparelho gera um fluxo contínuo de água, obrigando os peixes a nadar contra essa corrente com base no princípio da reotaxia11.
  2. Grupo Treinamento Contínuo de Intensidade Moderada (MICT): Submeter os peixes a nado forçado contra o fluxo de água a 60% do Umax, conforme determinado no teste de capacidade máxima, por 35 min.
    NOTA: Este protocolo foi adaptado de Húngaro et al.18. Durante os primeiros 10 min, os peixes foram aclimatados à mesma velocidade do grupo sedentário (0,05 m/s).
  3. Grupo de Treinamento Intervalado de Alta Intensidade (HIIT): Sujeitar os peixes a natação forçada alternando as velocidades de natação: 2 min a 90% do Umax seguido de 2 min a 30% do Umax, repetido por 18 min (9 ciclos). Esse protocolo foi adaptado de Marcinko et al.19.
    NOTA: Durante os primeiros 10 min do período de exercício, é necessário aclimatar os peixes à mesma velocidade do grupo sedentário (0,06 m/s).
  4. Implemente todos os protocolos de exercícios por 5 dias por semana durante um período de quatro semanas.
    NOTA: Os peixes devem ser alojados em aquários que ofereçam condições adequadas e só devem ser introduzidos no aparelho de exercício durante os períodos de exercício designados. Os peixes devem receber alimentos em flocos de peixes tropicais três vezes ao dia, e a água nos aquários de manutenção deve sofrer uma troca parcial a cada 2 dias.
  5. Repita o teste de resistência no final de cada semana, com dados de latência e velocidade no ponto de fadiga como indicadores de parâmetros de condicionamento físico.
  6. Para induzir efeitos de overtraining, aumente a velocidade do fluxo de água semanalmente com base nos resultados do teste de resistência realizado após cada ciclo de treinamento de 4 dias. As durações de treinamento devem ser ajustadas para levar em conta a distância percorrida (velocidade × tempo), e essas durações devem permanecer consistentes entre os grupos exercitados.
  7. Ajuste o tempo de natação em resposta ao aumento do fluxo de água, padronizando assim a carga de treinamento entre os grupos exercitados.

5. Medidas corporais

  1. Anestesiar os peixes com tricaína 0,0075% (p/v) por imersão para a realização de medidas corporais (peso e tamanho)20.
  2. Fotografe e pese os peixes para determinar as dimensões do corpo usando o software ImageJ.
  3. Expresse os dados em termos de Índices de Condição Corporal (peso [g]/comprimento padrão [mm]2; IMC) e Escore de Condição Corporal (ECC)20.
  4. Para eliminar as variações de tamanho e peso causadas pela formação de ovos, submeter os peixes à criação padrão20, seguida de medições e pesagem.

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Resultados

O aparelho de exercício demonstrou notável eficiência na regulação da velocidade do fluxo. Para aumentar gradualmente a velocidade de natação, o fluxo de água foi aumentado semanalmente para todos os grupos, exceto para o grupo SED, que foi mantido a uma velocidade de fluxo constante de 0,06 m/s. Notavelmente, o aparelho permitiu um nível notável de precisão, alcançando ajustes de velocidade de fluxo tão finos quanto 0,001 m/s. No entanto, a taxa de erro foi de 30% em baixas velocidades, como 0,06 m/s. Em altas velocidad...

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Discussão

Neste estudo, foi desenvolvido um sistema de exercícios inovador e econômico inspirado no respirômetro de túnel de natação da Loligo Systems21 e no sistema de calha22 para o exame abrangente do desempenho de natação do peixe-zebra. O Umax foi determinado pelo aumento sistemático do fluxo de água em estágios discretos, com incrementos de velocidade ocorrendo em intervalos curtos (20-30 min) até que os peixes atingissem a exaustão, caracteriz...

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Divulgações

É essencial esclarecer que não há interesses financeiros concorrentes associados à pesquisa apresentada neste manuscrito. Não foram estabelecidas parcerias financeiras ou afiliações com organizações ou entidades que possam influenciar ou influenciar os resultados deste trabalho. Essa afirmação serve como garantia de que o processo de pesquisa foi direto e honesto, sem conflitos financeiros influenciando os resultados. A apresentação deste trabalho é motivada por uma paixão genuína pelo assunto, impulsionada apenas pelo amor pela academia e pela busca do conhecimento científico.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Omar Mertins por generosamente fornecer acesso ao laboratório para a manutenção dos peixes e execução dos testes. Além disso, são agradecimentos à FAPESP, CNPq e CAPES pela concessão de bolsas para apoiar esta pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cotovelo Fêmea CPVC 90 Graus para EncanamentoTigre221502603/4 polegadas 
Fio 24AWGSky Cablo StoreConexão entre componentes na Placa de Circuito Perfurado (1m)
Tubo de acrílicoThe Clear Plastic Shop411384083/4 de polegada 
Tanque de Peixes Submersível para AquárioTanque300w
CPVC PipeTigre101217873/4 polegadas 
Válvula de Água de Portão Roscado FêmeaTigre279503103/4 de polegada 
Válvula de Água Globo com Rosca FêmeaTigre279405103/4 polegadas 
resistor de furo de calhaBXV10 kΩ, 0.25W t
Suporte de Laboratório com Grampo com haste de 30 polegadas Masiye LabsRSC0001Suporta a tela LCD de tubos horizontais
 Eichip16 x 2, modelo JHD162A
Jumpers Dupont Macho x MachoChyanConexão entre arduino e sensor de fluxo (30 cm)
Placa de Circuito Perfurada de um ladoKY WIN ROBOT5 x 10 cm
PotenciômetroLUSYADL-ALPSA0110kΩ
Rolo de Fita de Bloqueio de ÁguaOne World5603131000Para evitar vazamentos
Mangueira de siliconeTigre142112502 cm interna
Estação de SoldaQHTITECPLUGUE EU/USSistema de soldagem Arduine 
Carretel de Fio de SoldaBEEYIHFI001-A001-SetSistema de soldagem Arduine 
Soquete Macho Rosqueado e Soquete Fêmea Não Rosqueado Encaixe de Tubo CPVC354478493/4 de polegada 
Tricaine (MS-222)Sigma-AldrichE10521Anestésico
UNO-R3 placa UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz FSXSEMIPara Arduino UNO R3 Placa de Desenvolvimento
Conexão de Tubo CPVC Não Rosqueada, FêmeaTigre222002673/4 de polegada 
Encaixe de Tubo de Soquete CPVC Fêmea Não RosqueadoTigre221702603/4 polegadas 
Sensor de Fluxo de Água modelo YF-B5Siqma RoboticsSQ86591-25 L/min
SunsunModelo HJ-2041, 3000L / h,
reservatório de água65W personalizado30 L
de Aqua Bomba de Água

Referências

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